הערכת שכיחות המוטציות בחיידקים באמצעות בדיקת בטא-גלוקוזידאז

קחו תרבית של חיידקים מהונדסים גנטית.

החיידקים מושרים לבטא גרסה מוטנטית של DNA פולימראז עם פעילות הגהה פגומה, מה שמגדיל את הסיכוי לשגיאת שכפול.

שגיאות אלו עלולות להוביל למוטציות ספונטניות באזור הרגולציה, אשר מדכאות את הגן בטא-גלוקוזידאז ומעוררות את ביטוי האנזים בטא-גלוקוזידאז.

אסוף דגימות במרווחי זמן קבועים והעריך את מספר דורות החיידקים בכל תרבית. צנטריפוגה של הדגימות והשליכו את הסופרנטנט.

השעו מחדש את הכדור במאגר.

הוסף תמיסה מחדירה וערבב כדי לחלחל את קרום החיידקים.

העבירו את דגימות החיידקים החדירות לצלחת מרובת בארות.

הוסף מצע שנכנס לחיידקים ומגיב עם האנזים בטא-גלוקוזידאז, ויוצר מוצר צבעוני.

מדוד את עוצמת הצבע כדי לקבוע את פעילות הבטא-גלוקוזידאז.

לנתח את פעילות הבטא-גלוקוזידאז בתרביות החיידקים כדי לקבוע את תדירות המוטציות לאורך הדורות.

להעביר מושבה אחת של E. coli TOP10 המכילה את הווקטורים pBAD-ε ו-pGOOD1-εD12A11 למיליליטר אחד של חומר LB שטופל באנטיביוטיקה.

דגרו על התרבית למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר, יש לדלל את טרום התרבית 1 עד 250 בשלוש צלוחיות המכילות 10 מיליליטר מדיה טרייה. הוסף את המשרה מילי-מולר אחד כל אחד של ארבינוז, IPTG או ארבינוז ו-IPTG, ודגר את התרבית המושרית ב-37 מעלות צלזיוס למשך שמונה שעות.

הכן תרבויות שאינן מושרות במקביל. אסוף מיליליטר אחד של אליקוטים ודלל