הערכת שכיחות המוטציות בחיידקים באמצעות בדיקת בטא-גלוקוזידאז

קחו תרבית של חיידקים מהונדסים גנטית.

החיידקים מושרים לבטא גרסה מוטנטית של DNA פולימראז עם פעילות הגהה פגומה, מה שמגדיל את הסיכוי לשגיאת שכפול.

שגיאות אלו עלולות להוביל למוטציות ספונטניות באזור הרגולציה, אשר מדכאות את הגן בטא-גלוקוזידאז ומעוררות את ביטוי האנזים בטא-גלוקוזידאז.

אסוף דגימות במרווחי זמן קבועים והעריך את מספר דורות החיידקים בכל תרבית. צנטריפוגה של הדגימות והשליכו את הסופרנטנט.

השעו מחדש את הכדור במאגר.

הוסף תמיסה מחדירה וערבב כדי לחלחל את קרום החיידקים.

העבירו את דגימות החיידקים החדירות לצלחת מרובת בארות.

הוסף מצע שנכנס לחיידקים ומגיב עם האנזים בטא-גלוקוזידאז, ויוצר מוצר צבעוני.

מדוד את עוצמת הצבע כדי לקבוע את פעילות הבטא-גלוקוזידאז.

לנתח את פעילות הבטא-גלוקוזידאז בתרביות החיידקים כדי לקבוע את תדירות המוטציות לאורך הדורות.

להעביר מושבה אחת של E. coli TOP10 המכילה את הווקטורים pBAD-ε ו-pGOOD1-εD12A11 למיליליטר אחד של חומר LB שטופל באנטיביוטיקה.

דגרו על התרבית למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר, יש לדלל את טרום התרבית 1 עד 250 בשלוש צלוחיות המכילות 10 מיליליטר מדיה טרייה. הוסף את המשרה מילי-מולר אחד כל אחד של ארבינוז, IPTG או ארבינוז ו-IPTG, ודגר את התרבית המושרית ב-37 מעלות צלזיוס למשך שמונה שעות.

הכן תרבויות שאינן מושרות במקביל. אסוף מיליליטר אחד של אליקוטים ודלל אותם מאחד ל-500 בצלוחיות חדשות המכילות 10 מיליליטר של מדיה טרייה, בתוספת או לא בתוספת משרים. לאחר מכן דוגרים את התערובת למשך הלילה בחום של 37 מעלות צלזיוס.

למחרת, חזור על השלבים המתחילים בדילול התרבית המוקדמת ואסוף מיליליטר אחד. לאחר מכן מכניסים את האליקוטים למקפיא.

לאחר מכן, קבע את מספר הדורות שהתרחשו בכל תרבות. העבירו 100 מיקרוליטר של דילולים סדרתיים מתאימים של חיסון ותרבית על לוחות LB.

דגרו את הצלחות למשך הלילה בחום של 37 מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר, ספרו את המושבות על לוחות LB.

חשב את הלוג של מספר התאים הקיימים בחיסון או בלוג I ובתרבית בסוף הגידול או לוג C, וקבע את מספר הדורות.

לאחר מכן צנטריפוגה את התרבית ב-5,000 גרם למשך 20 דקות והשעו מחדש את התאים במיליליטר אחד של 50 מילי-מולרי טריס HCL, pH 7.6, 50 מילי-מולרי NaCl.

כדי לחלחל לתאים, הוסיפו שתיים עד שלוש טיפות של כלורופורם ומערבולת למשך 20 שניות.

לבסוף, קבע את פעילות הגלוקוזידאז של כל אליקוט במיקרו-פלטה של 96 בארות.

הוסף 100 מיקרוליטר של תאים חדירים ו-100 מיקרוליטר של שימוש במצע p-nitrophenyl-D-glucopyranoside לכל באר, תוך הימנעות מיצירת בועות אוויר בבארות.

קרא את הספיגה ב-420 ננומטר באמצעות קורא מיקרו-פלטות ומסנן.