Name: בימוי שיטת אבולוציה שמר האפייה: יצירת ספריית Mutant והקרנה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: למדו כיצד לבנות ולסנן ספריות מוטנטים ב-Saccharomyces cerevisiae לאבולוציה מכוונת. השיטה משתמשת באלגוריתמים חישוביים לבחירת אזורי יעד ומוטגנזה אקראית של AAO.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט Indox-FP7-KBBE-2013-7-613549 של הנציבות האירופית; ביוקטליזה של Cost-Action CM1303-Systems; והפרויקטים הלאומיים Dewry [BIO201343407-R] ו-Cambios [RTC-2014-1777-3].

1. בניית ספריית Mutant <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחרו את האזורים להיות חשופים Morphing בעזרת אלגוריתמים חישוביים המבוססים על מודלי הומולוגית מבנה או קריסטל הזמין 18. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאן, למקד שני אזורים של AAO מ Pleurotus eryngii עבור mutagenesis ו רקומבינציה אקראית (Met [α1] -Val109, Phe392-Gln566), תוך הגברה והשאר של הגן (844 נ&quot;ב) על ידי באיכות גבוהה PCR (איור 1). הערה: מקטעים אחדים ניתן ללמוד על ידי Morphing באופן עצמאי או בשילוב 16. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגבר את האזורים שהותקפו על ידי מוטגנים PCR. צור חפיפה בין אזורים ובין מגזרים (~ 50 נ&quot;ב כל אחד) על ידי superimposing PCR תגובות של האזורים המוגדרים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן PCR מוטגנים של מגזרים ממוקדים נפח סופי של 50 μl המכילים תבנית ה- DNA (0.92 ng / μl), 90 תחושת אוליגו ננומטר (RMLN עבור המגזר אמ&quot;ן AAO-BP עבור המגזר M-II), 90 ננומטרפריימר ntisense (AAO-92C עבור מגזר אמ&quot;ן RMLC עבור מגזר M-II), 0.3 מ&quot;מ dNTPs (0.075 מ&quot;מ כל אחד), 3% (v / v) dimethylsulfoxide (DMSO), 1.5 מ&quot;מ 2 MgCl, 0.05 מ&quot;מ MnCl 2 ו 0.05 U / μl פולימראז תקי DNA. רצפי Primers מפורטים באיור 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש תוכנית ה- PCR הבאה: 95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות (1 מחזור); 95 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות, 50 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות, 74 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות (28 מחזורים); ו -74 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות (1 מחזור). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגבר את האזורים שאינם מוטגנים עם פולימראז נאמנות הגבוהה במיוחד וכולל אזורים המקבילים חופפי המגזרים מוטגנים / או סככות וקטור הוא לינארית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תערובת התגובה בנפח סופי של 50 μl המכיל: תבנית ה- DNA (0.2 ng / μl), 250 ננומטר תחושה אוליגו HFF, 250 HFR antisense אוליגו ננומטר, 0.8 מ&quot;מ dNTPs (0.2 מ&quot;מ כל אחד), 3% (v / v) dimethylsulfoxide (DMSO) ו 0.02 U / μl iproof DNA פולימרז. רצפי Primers מפורטים &lt;strong&gt; איור 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש תוכנית ה- PCR הבאה: 98 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות (1 מחזור); 98 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות, 55 מעלות צלזיוס למשך 25 שניות, 72 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות (28 מחזורים); ו -72 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות (1 מחזור). הערה: עם התנאים המתוארים 1.2 ו -1.3 חפיפות של 43 נ&quot;ב (אזור פלסמיד-M1); 46 נ&quot;ב (אזור לאזור HF M1); 47 נ&quot;ב (אזור-M2 HF באזור) ו -61 נ&quot;ב (פלסמיד אזור- M2) נועדו (איור 1) להעדיף ב שחבור vivo בשמרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את כל שברי PCR (מוטגנים הלא מוטגנים) עם ערכת חילוץ ג&#39;ל מסחרית על פי הפרוטוקול של היצרן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Linearize וקטור כך איגוף אזורים של כ -50 נ&quot;ב נוצרים כי הם הומולוגיים אל 5&#39;- ו 3&#39;-הקצוות של גן המטרה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו תערובת התגובה לינאריזציה המכיל 2 מיקרוגרם DNA, 7.5 U בם HI, 7.5 U Xho לי, 20 מיקרוגרם BSA ו -2 μl של הצפת Baמ HI 10x בנפח סופי של 20 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת תערובת התגובה על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות ו -40 דקות. לאחר מכן, להמשיך עם איון על 80 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את הווקטור לינארית על ידי מיצוי ג&#39;ל agarose כדי למנוע זיהום עם הפלסמיד העגול שיורית (איור 2). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את תערובת התגובה העיכול אל-היטב מגה של ג&#39;ל agarose נקודת התכה נמוכה חצי preparative (0.75%, w: נ) וכן aliquot (5 μl) של תערובת התגובה ב הסמוך גם ככתב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעלה אלקטרופורזה DNA (5 V / ס&quot;מ בין האלקטרודות, 4 ᵒC) ולהפריד את הג&#39;ל agarose המתאים היטב מגה ולאחסן אותו ב 4 ᵒC ב 1x טה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם השביל עם סולם המשקל המולקולרי ואת הכתב. דמיינו את הלהקות תחת אור UV. ניק במצב שבו מקומות הווקטור לינארית. הערה: ככל איכות הווקטור לינארית המטוהר היא critiגורם cal עבור רקומבינציה והרכבה מוצלחת בשמרים, להימנע מכתים ג&#39;ל אלקטרופורזה DNA חצי preparative. השימוש של צבעים וחשיפת UV להפקת ג&#39;ל עשוי להשפיע על היציבות של וקטור DNA, להתפשר על יעילות רקומבינציה vivo. כפי אלטרנטיבת צבעי EtBr רעילים, ג&#39;ל אדום וצבעי SYBR משמשים עבור מכתים ג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהיעדר אור UV, לזהות את הווקטור לינארית ב שהבר מגה-גם באמצעות הדרכתו של ניקס בנתיב הכתב המוכתם כך שהוא יכול להיות מבודד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלץ את הווקטור לינארית מ agarose ולטהר אותו עם ערכת חילוץ ג&#39;ל מסחרית על פי הפרוטוקול של היצרן. הערה: וקטורים הסעות episomal גבוהה עותק השתמש בטושים אנטיביוטיקה auxotrophy: בדוגמה זו שיישמנו אורציל עצמאית אמפיצילין התנגדות וקטור pJRoC30, תחת שליטה של האמרגן שמרים GAL1. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מיל equimolarxture של שברי PCR ומערבב אותו עם הווקטור לינארית ב יחס של 2: 1, עם לא פחות מ -100 ננוגרם של פלסמיד לינארית (יחסים שונים במבחן וקטור equimolar ספרייה / פתוח להשיג תשואות טרנספורמציה טובות). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את הספיגה של שברי PCR ו הווקטור לינארית ב 260 ננומטר ו -280 ננומטר כדי לקבוע הריכוז והטוהר שלהם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transform בתאי שמרים מוסמך בתערובת DNA באמצעות ערכת טרנספורמציה שמרים מסחרית (ראה טבלה עבור אספקה) על פי הוראות היצרן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנה, להשתמש פרוטאז לקוי URA3 - תלוי ס זן cerevisiae, BJ5465. להפוך את התאים עם וקטור circularized הורית כסטנדרט פנימי במהלך ההקרנה (ראה להלן). בנוסף, לבדוק את הרקע על ידי הפיכת הווקטור לינארית בהעדר שבר PCR. הערה: במקרה של התגלה רמות הפרשה נמוכות ראשוניות, השתמש סcerevisiae פרוטאז זנים לקוי כמו BJ5465 לטפח הצטברות של חלבון פעיל supernatants תרבות. אם אנזים היעד עובר hyperglycosylation, שימוש זני glycosylation מחסר (למשל, Δ kre2 כי הוא מסוגל רק הצמדת oligomers מנוז הקטן) יכול להיות אופציה מתאימה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט תאי טרנספורמציה על צלחות נשירת SC הדגירה אותם ב 30 מעלות צלזיוס למשך שלושה ימים. פלייט (על צלחות הנשירה SC בתוספת אורציל) URA3 - ס תאי cerevisiae חסרי פלסמיד כביקורת שלילית להקרנה (ראה להלן). </li></ol> 2. תפוקה גבוהה הקרנת Assay (איור 3) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו מספר מתאים של 96-גם צלחות סטרילי (23 צלחות לנתח ספרייה של 2,000 שיבוטים) עם 50 μl בינוניים מינימאלי לכל טוב בעזרת רובוט pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיק מושבות בודדות מתוך SC-נושרים צלחות ולהעבירם צלחות 96-היטב. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכל צלחת, לחסן מספר העמודה 6 עם סוג הורית כסטנדרט פנימי היטב H1 עם URA3 - ס תאים cerevisiae (במדיום SC בתוספת אורציל) ללא פלסמיד כביקורת שלילית. הערה: ובכן H1 מלא במיוחד עם התקשורת הנשירה בתוספת אורציל. מדיה ריק היטב המכיל ללא תאים ניתן להכין גם כפקד עקרות נוספים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את הצלחות עם העפעפיים שלהם ועוטפים אותם Parafilm. דגירת צלחות עבור 48 שעות ב 30 מעלות צלזיוס, 225 סל&quot;ד ולחות יחסית 80% שייקרו ולח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את Parafilm, להוסיף 160 μl של מדיום ביטוי היטב כל בעזרת רובוט pipetting, לאטום את צלחות דגירה אותם במשך שעות 24 נוספות. הערה: בינוני מינימל ובינוני ביטוי ערוך כפי שדווחו במקומות אחרים 19. רמות ההפרשה עשויות להשתנות תלויים הגן נחקר ובהתאם, tהוא הדגירה פעמים חייבות להיות מותאמות בכל מקרה לסנכרן את צמיחת תאים בכל הבארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צלחות (צלחות אב) ב 2,800 x ז במשך 10 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 20 μl של supernatant מבארות בצלחת המאסטר לצלחת העתק באמצעות נוזל טיפול multistation רובוטית. הערה: כדי להעדיף הפרשת אנזים רצוי להחליף את הפפטיד אות יליד חלבון המטרה על ידי פפטידים אות נפוצים ביטוי Heterologous בשמרים (למשל, גורם α prepro-המנהיג, המנהיג של הרעלן Killer 1 K מ ס cerevisiae, או גרסאות כימרי אפילו של שני פפטידים 13). לחלופין, הפפטיד אות היליד ניתן התפתח באופן בלעדי עבור הפרשה בשמרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 μl של 2 מ&quot;מ p -methoxybenzylalcohol ב- pH חיץ פוספט נתרן 100 מ&quot;מ 6.0 בעזרת הרובוט pipetting. מערבבים את צלחות בקצרה עם 96-אנחנוll מערבל צלחת דגירה אותם במשך 30 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם רובוט pipetting, להוסיף 160 μl של מגיב FOX על כל צלחת העתק ומערבבים בקצרה עם מערבל (הריכוז הסופי של תערובת FOX בבאר: 100 מיקרומטר xylenol כתום, 250 מיקרומטר Fe (NH 4) 2 (SO 4) 2 ו 25 מ&quot;מ H 2 SO 4). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מספר ותוספות מגיבים כדי לשפר את הרגישות, כגון ממסי שיתוף אורגניים (DMSO, אתנול, מתנול) או סורביטול 17. הנה, להגביר את התגובה על ידי הוספת סורביטול לריכוז סופי של 100 מ&quot;מ (איור 4). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קראו את הצלחות (מצב נקודת סיום, t0) ב 560 ננומטר על קורא צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת הצלחות ב RT עד שצבע מפתחת מדידת הבליעה שוב (t 1). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשבתי את הפעילות היחסית מהפער בין שווי Abs לאחר דגירה וכי המדידה הראשונית מנורמל פאךקסוג פתיחות opening סגירות closures עבור כל צלחת (Δt 1 - t0). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נושא להיטי המוטציה הטובים ביותר לשני מחדש הקרנות רצופות כדי לשלול תוצאות חיוביות שגויות. הערה: בדרך כלל, מחדש הקרנות כוללות בידוד פלסמיד מן השמרים, הגברה וטיהור Escherichia coli, ואחריו טרנספורמציה של תאי שמרים טריים עם הפלסמיד 19. כל כפיל שנבחר מחדש הוקרן pentaplicate. </li></ol>

<ol><li>Jäckel, C., Hilvert, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocatalysts+by+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Biocatalysts by evolution.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 21 (6), 753-759 (2010).</li>
<li>Bornscheuer, U. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+the+third+wave+of+biocatalysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Engineering the third wave of biocatalysis.</a> Nature. 485 (7397), 185-194 (2012).</li>
<li>Renata, H., Wang, Z. W., Arnold, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+enzyme+universe%3A+accessing+non-natural+reactions+by+mechanism-guided+directed+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Expanding the enzyme universe: accessing non-natural reactions by mechanism-guided directed evolution.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 54 (11), 3351-3367 (2015).</li>
<li>Cobb, R. E., Chao, R., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution%3A+past%2C+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22AIChE+J%22%5BJournal%5D)">Directed evolution: past, present and future.</a> AIChE J. 59 (5), 1432-1440 (2013).</li>
<li>Abatemarco, J., Hill, A., Alper, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+metabolic+engineering+toolbox+with+directed+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Expanding the metabolic engineering toolbox with directed evolution.</a> Biotechnol. J. 8 (12), 1397-1410 (2013).</li>
<li>Pourmir, A., Johannes, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution%3A+selection+of+the+host+organism%5BTitle%5D)+AND+%22Comput+Struct+Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Directed evolution: selection of the host organism.</a> Comput Struct Biotechnol J. 2 (3), e201209012(2012).</li>
<li>Krivoruchko, A., Siewers, V., Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opportunities+for+yeast+metabolic+engineering%3A+lessons+from+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Opportunities for yeast metabolic engineering: lessons from synthetic biology.</a> Biotechnol J. 6 (3), 262-276 (2011).</li>
<li>Gonzalez-Perez, D., Garcia-Ruiz, E., Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saccharomyces+cerevisiae+in+directed+evolution%3A+an+efficient+tool+to+improve+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Bioeng+Bugs%22%5BJournal%5D)">Saccharomyces cerevisiae in directed evolution: an efficient tool to improve enzymes.</a> Bioeng Bugs. 3, 172-177 (2012).</li>
<li>Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenesis+protocols+in+Saccharomyces+cerevisiae+by+In+Vivo+Overlap+Extension%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mutagenesis protocols in Saccharomyces cerevisiae by In Vivo Overlap Extension.</a> Methods Mol. Biol. 634, 3-14 (2010).</li>
<li>Bulter, T., Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+libraries+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparing libraries in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods. Mol. Biol. 231, 17-22 (2003).</li>
<li>Ostrov, N., Wingler, L. M., Cornish, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+assembly+and+combinatorial+libraries+in+S.+cerevisiae+via+reiterative+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene assembly and combinatorial libraries in S. cerevisiae via reiterative recombination.</a> Methods. Mol. Biol. 978, 187-203 (2013).</li>
<li>Shao, Z., Zhao, H., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+assembler%2C+an+in+vivo+genetic+method+for+rapid+construction+of+biochemical+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">DNA assembler, an in vivo genetic method for rapid construction of biochemical pathways.</a> Nucleic Acids Res. 37 (2), e16(2009).</li>
<li>Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+the+ligninolytic+enzyme+consortium%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineering the ligninolytic enzyme consortium.</a> Trends Biotechnol. 33 (3), 155-162 (2015).</li>
<li>Garcia-Ruiz, E. Directed evolution of ligninolytic oxidoreductases: from functional expression to stabilization and beyond. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGarcia-Ruiz%2C+E+%22Cascade+Biocatalysis%3A+integrating+stereoselective+and+environmentally+friendly+reactions%22">Cascade Biocatalysis: integrating stereoselective and environmentally friendly reactions</a>. , Wiley-VCH. 1-22 (2014).</li>
<li>Hernandez-Ortega, A., Ferreira, P., Martinez, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungal+aryl-alcohol+oxidase%3A+a+peroxide-producing+flavoenzyme+involved+in+lignin+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Fungal aryl-alcohol oxidase: a peroxide-producing flavoenzyme involved in lignin degradation.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 93 (4), 1395-1410 (2012).</li>
<li>Gonzalez-Perez, D., Molina-Espeja, P., Garcia-Ruiz, E., Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenic+organized+recombination+process+by+homologous+in+vivo+grouping+%28MORPHING%29+for+directed+enzyme+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mutagenic organized recombination process by homologous in vivo grouping (MORPHING) for directed enzyme evolution.</a> PLoS One. 9, e90919(2014).</li>
<li>Rhee, S. G., Chang, T., Jeong, W., Kang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+Detection+and+Measurement+of+Hydrogen+Peroxide+Inside+and+Outside+of+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cells%22%5BJournal%5D)">Methods for Detection and Measurement of Hydrogen Peroxide Inside and Outside of Cells.</a> Mol. Cells. 29 (6), 539-549 (2010).</li>
<li>Sebestova, E., Bendl, J., Brezovsky, J., Damborsky, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+tools+for+designing+smart+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Computational tools for designing smart libraries.</a> Methods. Mol. Biol. 1179, 291-314 (2014).</li>
<li>Viña-Gonzalez, J., Gonzalez-Perez, D., Ferreira, P., Martinez, A. T., Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+directed+evolution+of+aryl-alcohol+oxidase+in+yeast+using+chimeric+signal+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Focused directed evolution of aryl-alcohol oxidase in yeast using chimeric signal peptides.</a> Appl. Environ. Microbiol. , (2015).</li>
<li>Gay, C., Collins, J., Gebicki, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroperoxide+Assay+with+the+Ferric-Xylenol+orange+Complex%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Hydroperoxide Assay with the Ferric-Xylenol orange Complex.</a> Anal. Biochem. 273 (2), 149-155 (1999).</li>
<li>Reetz, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocatalysis+in+organic+chemistry+and+biotechnology%3A+Past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Biocatalysis in organic chemistry and biotechnology: Past, present, and future.</a> J. Am. Chem. Soc. 135 (34), 12480-12496 (2013).</li>
<li>Mate, D. M., Gonzalez-Perez, D., Mateljak, I., Gomez de Santos, P., Vicente, A. I., Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pocket+manual+of+directed+evolution%3A+Tips+and+tricks%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+of+Microbial+Enzymes%3A+Production%2C+Biocatalysis+and+Industrial+Applications%22%5BJournal%5D)">The pocket manual of directed evolution: Tips and tricks.</a> Biotechnology of Microbial Enzymes: Production, Biocatalysis and Industrial Applications. , Elsevier. Forthcoming Forthcoming.</li>
<li>Chao, R., Yuan, Y., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+DNA+assembly+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Yeast+Res%22%5BJournal%5D)">Recent advances in DNA assembly technologies.</a> FEMS Yeast Res. 15, 1-9 (2015).</li>
</ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

במאמר זה, יש לנו סכמתי רוב הטיפים והטריקים המועסקים במעבדה שלנו להנדס אנזימים על ידי אבולוציה מכוונת ס cerevisiae (באמצעות AAO כדוגמא), כך שהם יכולים להיות מותאמים לשימוש עם מערכות אנזימים האיקריוטים רבות אחרות על ידי ביצוע הגישה הנפוצה פשוט המתואר כאן. במונחים של יצירת ספרייה, Morphing היא שיטה בסיר אחד מהר כדי להציג ולשלב מחדש מוטציות אקראיות בתוך רצועות חלבון קטנות תוך השארת האזורים הנותרים של החלבון ...

אבולוציה מולקולרית בימוי היא שיטה חזקה, מהירה ואמינה לעצב אנזימים 1, 2. דרך סיבובים איטרטיבי של מוטציות אקראיות, רקומבינציה הקרנה, הגירסות משופרות של אנזימים יכולות להיוצר שפועלים על מצעים חדשים, בתגובות רומן, ב שאינו טבעי סביבות, או אפילו כדי לסייע התא כדי להשיג את המטרות מטבוליות חדשות 3-5. בין המארחים המשמשים אבולוציה מכוונת, את cerevisiae Saccharomyces שמרי בירה מציע רפרטואר של פתרונות עבור הביטוי הפונקציונלי של חלבונים איקריוטיים מורכבים שאינם זמינים אחרת עמיתיהם פרוקריוטים 6,7. משומשים ממצה מחקרים בביולוגיה של התא, מודל אוקריוטים הקטן הזה יש יתרונות רבים מבחינת שלאחר translational שינויים, קלות ויעילות מניפולציה וטרנספורמציה, שכולן הן התכונות החשובות להנדס אנזימים על ידי אבולוציה מכוונת 8. יתר על כן, תדירות גבוההשל רקומבינציה DNA ההומולוגית ס cerevisiae מצמיד את מנגנון הוכחת הקריאה היעיל בה פותח מגוון רחב של אפשרויות ליצירת ספרייה והרכבת גני in vivo, טיפוח האבולוציה של מערכות שונות אנזימים יחידים מסלולים מלאכותיים מורכבים 9-12. המעבדה שלנו בילתה את העשור האחרון בעיצוב כלים ואסטראטגי עבור האבולוציה המולקולרית של ligninases השונה בשמרים (oxidoreductases מעורב השפלה של ליגנין במהלך דעיכת עץ טבעית) 13-14. בתקשורת זו, אנו מציגים פרוטוקול מפורט להכין וספריות מוטצית מסך ס cerevisiae עבור מודל flavooxidase, מונואמין -aryl-אלכוהול (AAO 15) -, כי יכול להיות מתורגם בקלות אנזימים רבים אחרים. הפרוטוקול כרוך שיטת אבולוציה ממוקדת מכוון (Morphing: תהליך רקומבינציה מוטגנים מאורגן על ידי הומולוגי in vivo קיבוץ) נעזרה במנגנון שמרים תא 16, גידולassay ההקרנה מאוד רגיש דה המבוססת על התגובה פנטון על מנת לזהות פעילות AAO מופרש לתוך המרק תרבות 17.

<table><tbody><tr><td><חזק>1. אמצעי תרבית</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אמפיצילין מלח נתרן</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A0166</td><td>CAS N&ordm; 69-52-3 M.W. 371.39</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Difco</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Cloramphenicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td>CAS N&ordm; 56-75-7 M.W. 323.13</td></tr><tr><td>D-(+)-Galactose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G0750</td><td>CAS N&ordm; 59-23-4 M.W. 180.16</td></tr><tr><td>D-(+)-גלוקוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G5767</td><td>CAS N&ordm; 50-99-7 M.W. 180.16</td></tr><tr><td>D-(+)-Raffinose pentahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83400</td><td>CAS N&ordm; 17629-30-0 M.W. 594.51</td></tr><tr><td>פפטון</td><td>דיפקו</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן פוספט מונו-בסיסי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td>CAS N&ordm; 7778-77-0 M.W. 136.09</td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U1128</td><td></td></tr><tr><td>תמצית שמרים</td><td>Difco</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>בסיס חנקן שמרים ללא חומצות אמינו</td><td>Difco</td><td>291940</td><td></td></tr><tr><td>שמרים סינתטיים נשירה בינונית תוספי תזונה ללא uracil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1501</td><td></td></tr><tr><td>שם</td><td>חברה</td><td>מספר קטלוגי</td><td>Comments</td></tr><tr><td>2. PCR Reactions</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>dNTP Mix</td><td>Agilent genomics</td><td>200415-51</td><td>25 mM כל אחד</td></tr><tr><td>iProof High-Fidelity DNA פולימראז</td><td>Bio-rad</td><td>172-5301</td><td></td></tr><tr><td>מנגן (II) כלוריד טטרהידראט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8054</td><td>CAS N&ordm; 13446-34-9 M.W. 197.91</td></tr><tr><td>Taq DNA פולימראז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D4545</td><td>לשגיאה נוטה PCR</td></tr><tr><td><חזק>שם</חזק></td><td><חזק>חברה</חזק></td><td><חזק>מספר קטלוגי</חזק></td><td><חזק>הערות</חזק></td></tr><tr><td><חזק>3. ליניאריזציה של פלסמיד</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BamHI אנזים הגבלת</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>R0136S</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>B9001S</td><td></td></tr><tr><td>אנזים הגבלת XhoI</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>לא I אנזים הגבלה</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>R0189S</td><td></td></tr><tr><td>ג'ל אדום</td><td>ביוטיום</td><td>41003</td><td>לצביעה של DNA</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>4. בדיקות FOX</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אמוניום ברזל (II) סולפט הקסהידראט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>F3754</td><td>CAS N&ordm; 7783-85-9 M.W. 392.14</td></tr><tr><td>Anysil אלכוהול</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>W209902</td><td>CAS N&ordm; 105-13-5 M.W. 138.16</td></tr><tr><td>D-סורביטול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S1876</td><td>CAS N&ordm; 50-70-4 M.W. 182.17</td></tr><tr><td>מי חמצן 30%</td> <td>Merck Millipore</td><td>1072090250</td><td>FOX עקומה סטנדרטית</td></tr><tr><td>קסילנול כתום מלח דיסודיום</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>52097</td><td>CAS N&ordm; 1611-35-4 M.W. 716.62</td></tr><tr><td>שם</td><td>חברה</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>5. חומר ג'ל אגרוז</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Norgen</td><td>28035</td><td>CAS N&ordm; 9012-36-6</td></tr><tr><td>ג'ל</td><td>אדום ביוטיום</td><td>41003</td><td>צבע ניתוח DNA</td></tr><tr><td>GeneRuler 1kb סולם</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0311</td><td>DNA M.W.</td></tr><tr><td>צבע טעינה סטנדרטי 6x</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>טמפרטורת התכה נמוכה אגרוז</td><td>Bio-rad</td><td>161-3112</td><td>CAS N&ordm; 39346-81-1</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>6. ערכות ותאים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>S. cerevisiae זן BJ5465</td><td>LGC Promochem</td><td>ATTC 208289</td><td>זן חסר פרוטאז עם גנוטיפ: MAT&alpha; ura3-52 trp1 leu2-delta1 his3-delta200 pep4::HIS3 prb1-delta1.6R can1 GAL</td></tr><tr><td>E. coli XL2-Blue תאים מוכשרים</td><td>Agilent גנומיקה</td><td>200150</td><td>לטיהור והגברה של פלסמיד</td></tr><tr><td>NucleoSpin ג'ל וערכת</td> <td>ניקוי PCRMacherey-Nagel</td><td>740,609,250</td><td>מיצוי ג'ל DNA</td></tr><tr><td>ערכת פלסמיד NucleoSpin</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740,588,250</td><td>ערכת מיני-הכנה לעמודות</td></tr><tr><td>ערכת טרנספורמציה של שמרים</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>YEAST1-1KT</td><td>כלול נשא DNA (אשכי סלמון)</td></tr> <tr><td>Zymoprep שמרים פלסמיד miniprep I</td><td>מחקר Zymo</td><td>D2001</td><td>מיצוי פלסמיד משמרים</td></tr> <tr><td><חזקים>שם</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>7. צלחות</חזקות></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>צלחות 96 בארות</td><td>גריינר ביו-וואן</td><td>655101</td><td>פוליסטירן שקוף, לא סטרילי, (למדידות פעילות)</td></tr><tr><td>צלחות 96 בארות</td><td>גריינר ביו-וואן</td><td>655161</td><td>שקוף, סטרילי, פוליסטירן (למיקרו-תסיסות)</td></tr><tr><td>מכסה צלחת 96 בארות</td><td>גריינר ביו-וואן</td><td>656171</td><td>שקוף, סטרילי, פוליסטירן (למיקרו-תסיסות)</td></tr></tbody></table>

בימוי שיטת אבולוציה<em&gt; שמר האפייה</em&gt;: יצירת ספריית mutant והקרנה

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

אבולוציה מכוונת ב שמר אפייה מציעה יתרונות רבים אטרקטיביים בעת תכנון אנזימים עבור יישומים ביוטכנולוגיים, תהליך כרוך בבנייה, שיבוט וביטוי של ספריות מוטציה, מצמיד את רקומבינציה DNA בתדר גבוה ההומולוגית in vivo. כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצור ספריות מוטציה מסך בשמרים המבוססת על הדוגמא של מונואמין aryl-אלכוהול פטרייתי (AAO) כדי לשפר את הפעילות הכוללת שלה. שני מקטעי חלבון היו נתונים האבולוציה ממוקד בבימויו של mutagenesis אקראי וב רקומבינציה DNA vivo. מסוכך של ~ 50 נ&quot;ב איגוף בכל מגזר אפשר וההרכבה הנכונה של גן AAO-פיוז&#39;ן וקטור לינארית והוליד פלסמיד משכפלים מלא באופן אוטונומי. ספריות Mutant מועשרות גרסות פונקציונליות AAO הוקרנו ס supernatants cerevisiae עם assay תפוקה גבוהה רגיש המבוססת על התגובה פנטון. התהליך הכללי שלבניית ספרייה ב ס cerevisiae המתואר כאן יכול בקלות להיות מיושם להתפתח גני האיקריוטים רבים אחרים, הימנעות PCR תגובות נוספות, ב- DNA במבחנת צעדי רקומבינציה קשירה.

AAO מ פ eryngii הוא flavooxidase תאי המספק peroxidases פטרייתי עם H 2 O 2 כדי להתחיל לתקוף ליגנין. שני קטעים של AAO היו נתוני אבולוציה ממוקדת בבימויו של Morphing כדי לשפר את פעילותה וביטויו ס cerevisiae 19. בלא קשר עם אנזימים חוץ שטיפחו ס cerevisiae, הנושא הקריטי ביותר בעת בניית ספריות מוטציה בשמרים נוגעת ההנדסה של אזורים חופפים ספציפיים להעדיף את השחבור בין שברי השיבוט שלהם לתוך הווקטור ל...

אנו מציגים פרוטוקול מפורט לבנייה וסינון של ספריות מוטנטיות עבור מסעות אבולוציה מכוונים ב-Saccharomyces cerevisiae.

בימוי שיטת אבולוציה<em&gt; שמר האפייה</em&gt;: יצירת ספריית Mutant והקרנה

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא להראות כיצד לבנות ולסנן ספריות מוטנטים ב-Saccharomyces Cerevisiae עבור ניסויי אבולוציה מכוונת. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח ביצירה במעבדה המשמשת לניסויי אבולוציה מכוונת ממוקדת, כגון כיצד להקצות אזורים חופפים עבור ההרכבה והשיבוט. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא הפשטות והחוסן שלה, מכיוון שרק בשלב טרנספורמציה אחד ניתן להקצות רמות באיכות טובה.פרוטוקול זה ליצירה וסריקה של ספריות מוטנטים יודגם עבור אריל-אלכוהול אוקסידאז (AAO) פטרייתי. האזורים לאבולוציה מכוונת ממוקדת נבחרים תחילה בעזרת אלגוריתמים חישוביים המבוססים על מבנה הגביש הזמין או על מודלי הומולוגיה של האנזים. שני אזורים של AAO יעמדו כיעד למוטגנזה אקראית ורקומינציה: אזור M1 ואזור M2.ביצוע PCR מוטגני יבוצע כדי להגביר את האזורים הממוקדים. כדי לקדם שחבור (splicing) in vivo בשמרים, ייוצרו אזורי חפיפה בין מקטעים של כ-50 זוגות בסיסים כל אחד, על ידי הצלבה של תגובות PCR של האזורים המוגדרים. הכין תגובות PCR מוטגניות בנפח של 50 µL, כאשר כל תגובה מכילה 46 ng של תבנית DNA, 90 nM של פריימר sense ו-antisense, 0.3 mM של dNTPs, 3% DMSO, 1.5 mM של מגנזיום כלוריד, 0.5 mM של מנגן כלוריד, ו-0.5 units/µL של Taq DNA polymerase.השתמש בתוכנית ה-PCR הבאה: 95 degrees Celsius למשך שתי דקות, 95 degrees Celsius למשך 45 שניות, 50 degrees Celsius למשך 45 שניות, ו-74 degrees Celsius למשך 45 שניות למשך 28 מחזורים, ו-74 degrees Celsius למשך 10 דקות. שאר הגן AAO, אזור ה-HF, יועשרו באמצעות high fidelity PCR עם אזורים תואמים החופפים למקטעים המוטגניים, ו/או עם קצוות בולטים (overhangs) של וקטור ליניארי.הכינו את תגובת ה-PCR בעלת הנאמנות הגבוהה (high-fidelity PCR) בנפח סופי של 50 µL, המכיל 10 ng של DNA תבנית, 250 nM של כל אחד מהפריימרים (sense ו-antisense), 0.8 mM של dNTPs, 3% DMSO, ו-02 units/µL של iProof ultra high-fidelity DNA polymerase. השתמשו בתוכנית ה-PCR הבאה: 98 °C למשך 30 שניות, 98 °C למשך 10 שניות, 55 °C למשך 25 שניות, ו-72 °C למשך 45 שניות למשך 28 מחזורים, ו-72 °C למשך 10 דקות.כל מקטעי ה-PCR מטהרים לאחר מכן באמצעות ערכה מסחרית להוצאה מג'ל (gel-extraction kit) לפי פרוטוקול היצרן. השלב הבא הוא ליניאריזציה של הווקטור כדי ליצור אזורי שוליים של כ-50 זוגות בסיסים שהם הומולוגיים לקצוות ה-5' וה-3' של הגן המטרה. הכינו תערובת תגובה לליניאריזציה בנפח של 20 µL המכילה 2 µg של DNA, 7.5 units של BamH-one, 7.5 units של XHO-one, 20 µg של BSA, ושני µL של 10x buffer BamH-one.דגרו את תערובת התגובה בטמפרטורה של 37 °C למשך שעתיים ו-40 דקות. לאחר מכן,בצעו אינאקטיבציה לתגובה בטמפרטורה של 80 °C למשך 20 דקות. כדי לטהר את הווקטור הליניארי ולמנוע זיהום על ידי הפלסמיד המעגלי שנותר, טענו את תערובת תגובת העיכול למגה-באור (mega-well) של ג'ל Agarose חצי-preparative בעל נקודת התכה נמוכה.טען חמישה µL של תערובת התגובה לבאר הסמוכה כמדד (reporter). בצע אלקטרופורזה של DNA בטמפרטורה של 4 °C ובמתח של 5 V לסנטימטר בין האלקטרודות. לאחר מכן, הפר את ג'ל האגרוז המתאים למגה-באר (mega-well) ושמור אותו בטמפרטורה של 4 °C ב-1X TAE.צבעו את הנתיב הכולל את סולם המשקלים המולקולריים ואת הדיווח (reporter). הדמיעו את הפסים תחת אור UV, וסמנו בחריטות את המיקום שבו נמצא הווקטור הליניארי. בהיעדר אור UV ובהסתמכות על הסימנים בנתיב הדיווח הצבוע, זהו את הווקטור הליניארי במג'ה-וול (mega-well) של הפרגמנטים וגזרו אותו.חלצו את הווקטור הליניארי מהאגרוז וטהרו אותו באמצעות ערכה מסחרית להפקה מג'ל בהתאם לפרוטוקול היצרן. לאחר מכן, ערבבו את הווקטור הליניארי המהומה עם מקטעי ה-PCR והשתמשו בתערובת DNA זו לטרנספורמציה של תאי שמרים קומפטנטיים באמצעות ערכה מסחרית בהתאם להוראות היצרן. זרעו את התאים שעברו טרנספורמציה על מצעי SC dropout והדגירו אותם בטמפרטורה של 30 °C למשך שלושה ימים.כדי להכין את הבדיקה זו, יש לבחור מושבות בודדות מלוחיות ה-SC dropout ולהעבירן ללוחיות 96 בארות המכילות 50 µL של מצע מינימלי לכל בארה. בכל לוחית, יש להחדיר לעמודה מספר שש את סוג ההורה כסטנדרט פנימי. כביקורת שלילית, יש להחדיר לבארה H-1, המולאה במצעי SC בתוספת uracil, תאי ESI visceral שליליים ל-URA3 ללא פלסמיד.כסו את הפלטות במכסיהן, עטפו אותן ב-para film, והדגירו בטמפרטורה של 30 degrees Celsius בשייקר לח למשך 48 שעות. לאחר 48 שעות, הוסיפו 160 microliters של מצע ביטוי לכל באר וסגרו שוב את הפלטות. הדגירו למשך 24 שעות נוספות.לאחר סבוב הצנטריפוגה של הפלטות, השתמשו בתחנה רובוטית רב-תכליתית לטיפול בנוזלים כדי להעביר 20 µL של הנוזל העליון מהבארים בכל פלטה לפלטת העתק. הוסיפו לכל באר 20 µL של P-methoxybenzyl alcohol בריכוז 2 mM ו-100 mM של באפר סודיום פוספט pH 6.0. ערבבו את הפלטות קצרות בעזרת מערבל פלטות ל-96 בארים והדגרימו אותן למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.בשלב הבא, הוסיפו 160 µL של ריאגנט FOX לכל לוחית שכפול וערבבו קצרות בעזרת המערבל. קראו את הלוחיות באורך גל של 560 nm במכשיר קריאת לוחות. הדגירו את הלוחיות בטמפרטורת החדר עד להתפתחות הצבע.מדוד את הבליעה שוב. הפעילות היחסית מחושבת מההפרש בין ערך הבליעה לאחר הדגירה לבין זה של המדידה הראשונית, כאשר התוצאה מנורמלת לסוג ההורה עבור כל פלטה. תמונת הג'ל המייצגת זו מראה את הווקטור הליניארי בניב 2, את מקטע ה-PCR של M1 בניב 3, את מקטע ה-PCR של M2 בניב 4, את מקטע ה-PCR של HF בניב 5, ואת הווקטור שהורכב in vivo וליניאריז ב-NHE 1 בניב 6.הג'ל הבא מראה בנתיב שני את מיני-פרפ (mini-prep) של הפלסמיד של הווקטור שהורכב מחדש, בנתיב שלושה את הפלסמיד שהוליניארי עם NHE I, בנתיב ארבע את הפלסמיד שהוליניארי עם BamH I ו-Xho I, ובנתיב חמישה את הפלסמיד ההוליניארי שהתקבל על ידי הפקת ג'ל וניקוי. עומסים מוטציוניים הותאמו על ידי דגימה של ספריות מוטציות בעלות נופים שונים, חישוב מספר הכלונים עם פחות מ-10% מהפעילות האנזימטית של ההורה, ואימות נוסף על ידי רצף של מדגם אקראי של וריאנטים פעילים ולא פעילים. הערכה של גבול הגילוי של בדיקה זו הראתה כי הבדיקה הייתה ליניארית בנוכחות sorbitol, המיוצגת על ידי עיגולים שחורים.בהיעדר סורביטול, המיוצג על ידי הריבועים הלבנים, הליניאריות הייתה עמידה יותר אך התגובה הייתה חלשה יותר. נצפתה קורלציה ליניארית בין ריכוז AAO לבין הבליעה. ספריית מוטציות של 2,000 שיבוטים הוקמה ונבדקה באמצעות בדיקה זו.הריבוע המוצל indicates את מוטנטי AAO עם שיפור ניכר בהפרשה ובפעילות נגד P-methoxybenzyl alcohol. לאחר רכישת המיומנות, ניתן להכין ספריות מוטנטים בתוך כארבע שעות אם התהליך מבוצע כראוי. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להגדיר אזורי חפיפה מתאימים עבור כל משפחת PCR ווקטור לינארי עבור שחזור (splicing) in vivo ושכפול בשלב טרנספורמציה יחיד.בגישה דומה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון דגימת DNA in vivo, ספריית מוטגנזה של רוויה או הרכבת DNA, וזאת במטרה להקים ספריות של מוטנטים ו/או מסלולים מטבוליים. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום הביו-הנדסה לחקור פעילויות, יציבויות, או אף להמציא סוגים אינסופיים של אינטראקציות. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לנצל את המערכת של Saccharomyces Cerevisiae לבנייה וסריקה של ספריות

directed-evolution-method-saccharomyces-cerevisiae-mutant-library

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כאן אנו להדגים פרוטוקול פשוט ליצור ספריה מוטציה אקראית על רצף יעד נתון. אנו מראים כיצד שיטה זו, אשר מבוצעת in vivo של Escherichia coli, יכול להיות יחד עם בחירות פונקציונלי להתפתח פעילות אנזימטית חדשה.

בחירת הפרוטוקולים mutagenesis ו פונקציונאלי אבולוציה מכוונת של חלבונים א coli</em

פיתחנו מקיף, משוחדת הגנום כולו מסכי להבין גנים סמים גנים הסביבה אינטראקציות. שיטות סינון אלה אוספים מוטציה מוצגים.

מסכי הגנום תחרותי של ספריות שמרים המבורקדים

שיטת אבולוציה מכוונת רומן ספציפית לתחום הנדסת thermostability פותחה וכתוצאה מכך תוקפת לאנזימי bacteriolytic. לאחר סיבוב אחד בלבד של mutagenesis האקראי, אנזים bacteriolytic התפתח, PlyC 29C3, מוצג יותר מכפולה מפעילות שיורית בהשוואה לחלבון פרא מהסוג לאחר דגירת טמפרטורה גבוהה.

שיטת הקרנה חדשה לאבולוציה המכוונת של אנזימי Bacteriolytic Thermostable

מאמר זה מתאר מתודולוגיה מפורט אקראי מוטגנזה מכוונת של גנים היעד בביקוע שמרים. כדוגמה, אנחנו יעד rpt4 +, שמקודד של יחידת משנה של פרוטאוזום 19, וכן מסך מוטציות ביציבותה הטרוכרומטין.

גן במיקוד אקראי מוטגנזה מכוונת לבחירת יציב הטרוכרומטין פרוטאוזום מוטציות שמרים ביקוע

מאמר זה מציג שיטה מבוססת על הזיווג כדי להקל על הקרנת ביטוי ניצני שמרים באמצעות ספריה פלסמיד ערוכים.

ביטוי ההזדווגות מבוססי ספריית הקרנה שמרים

אנו מציגים את פרוטוקול מסך משתיק קול פשוט בהתכה שמרים. שיטה זו היא יעילה ללא מוטגן, סלקטיבי מוטציות מתרחשות לעיתים קרובות באתר גנומית יחיד.  הפרוטוקול מתאים לבידוד מדכאי על פגמים צמיחה בתרבות נוזלי שנגרמות על ידי מוטציה או תרופה.

מסך משתיק קול עמוק רצף-בסיוע, ספונטני ב ביקוע שמרים שמר הביקוע

ניתן לפתח את הגבלת הגבלות עם ספציפיות רצף חדש מאנזימים המספרים על רצף מנוון באופן חלקי. כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט כי השתמשנו בהצלחה כדי לשנות את הספציפיות הרצף של האנזים NlaIV. מרכיבי המפתח של הפרוטוקול הם ממדר החוץ של התגובה שעתוק/תרגום ומבחר של משתנים עם משתני רצף חדש.

האבולוציה בבימויו של הגבלת מגבלות על הגבלה עם ספציפיות יותר מחמירות

עבודה זו מתארת פרוטוקול לבדיקה גנטית מדכאת מולטי-קופיות בסכיזוזאכרומיצס פומבה. מסך זה משתמש בספריית פלסמידים כלל-גנומית כדי לזהות שיבוטים מדכאים של פנוטיפ אובדן תפקוד הקשור לזן מוטנטי שאילתה. מדכאים גנטיים חדשים של מוטציית האפס ell1 זוהו באמצעות מסך זה.

בדיקה גנטית לזיהוי מדכאי ריבוי עותקים בסכיזוזאכרומיצס פומבה

האינטראקציות של ביומולקולות, כגון אינטראקציות חלבון-חלבון, הן הבסיס המולקולרי של פונקציות ביולוגיות. אם ניתן לבודד מוטנטים ריקים/לקויים שחסרים באופן ספציפי את האינטראקציה הרלוונטית, הם יעזרו מאוד להבין את הפונקציות של אינטראקציה זו. מאמר זה מציג דרך יעילה לבודד מוטציות ריקות/לקויות אינטראקציה.

בידוד מוטנטים ריקים/לקויים באמצעות בדיקת שמרים דו-היברידית

פרוטוקול זה מתאר את השלבים החיוניים לביצוע קמפיינים לבחירת פני השטח של שמרים להעשרת וריאנטים חלבוניים הנקשרים לאנטיגן מעניין.

הנדסת חלבונים על ידי תצוגת פני שטח שמרים

למדו כיצד לבנות ולסנן ספריות מוטנטים ב-Saccharomyces cerevisiae לאבולוציה מכוונת. השיטה משתמשת באלגוריתמים חישוביים לבחירת אזורי יעד ומוטגנזה אקראית של AAO.

בימוי שיטת אבולוציה

גלה סרטונים נוספים