בימוי שיטת אבולוציה

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא להראות כיצד לבנות ולסנן ספריות מוטנטים ב-Saccharomyces Cerevisiae עבור ניסויי אבולוציה מכוונת. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח ביצירה במעבדה המשמשת לניסויי אבולוציה מכוונת ממוקדת, כגון כיצד להקצות אזורים חופפים עבור ההרכבה והשיבוט. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא הפשטות והחוסן שלה, מכיוון שרק בשלב טרנספורמציה אחד ניתן להקצות רמות באיכות טובה.

פרוטוקול זה ליצירה וסריקה של ספריות מוטנטים יודגם עבור אריל-אלכוהול אוקסידאז (AAO) פטרייתי. האזורים לאבולוציה מכוונת ממוקדת נבחרים תחילה בעזרת אלגוריתמים חישוביים המבוססים על מבנה הגביש הזמין או על מודלי הומולוגיה של האנזים. שני אזורים של AAO יעמדו כיעד למוטגנזה אקראית ורקומינציה: אזור M1 ואזור M2.

ביצוע PCR מוטגני יבוצע כדי להגביר את האזורים הממוקדים. כדי לקדם שחבור (splicing) in vivo בשמרים, ייוצרו אזורי חפיפה בין מקטעים של כ-50 זוגות בסיסים כל אחד, על ידי הצלבה של תגובות PCR של האזורים המוגדרים. הכין תגובות PCR מוטגניות בנפח של 50 µL, כאשר כל תגובה מכילה 46 ng של תבנית DNA, 90 nM של פריימר sense ו-antisense, 0.3 mM של dNTPs, 3% DMSO, 1.5 mM של מגנזיום כלוריד, 0.5 mM של מנגן כלוריד, ו-0.5 units/µL של Taq DNA polymerase.

השתמש בתוכנית ה-PCR הבאה: 95 degrees Celsius למשך שתי דקות, 95 degrees Celsius למשך 45 שניות, 50 degrees Celsius למשך 45 שניות, ו-74 degrees Celsius למשך 45 שניות למשך 28 מחזורים, ו-74 degrees Celsius למשך 10 דקות. שאר הגן AAO, אזור ה-HF, יועשרו באמצעות high fidelity PCR עם אזורים תואמים החופפים למקטעים המוטגניים, ו/או עם קצוות בולטים (overhangs) של וקטור ליניארי.

הכינו את תגובת ה-PCR בעלת הנאמנות הגבוהה (high-fidelity PCR) בנפח סופי של 50 µL, המכיל 10 ng של DNA תבנית, 250 nM של כל אחד מהפריימרים (sense ו-antisense), 0.8 mM של dNTPs, 3% DMSO, ו-02 units/µL של iProof ultra high-fidelity DNA polymerase. השתמשו בתוכנית ה-PCR הבאה: 98 °C למשך 30 שניות, 98 °C למשך 10 שניות, 55 °C למשך 25 שניות, ו-72 °C למשך 45 שניות למשך 28 מחזורים, ו-72 °C למשך 10 דקות.

כל מקטעי ה-PCR מטהרים לאחר מכן באמצעות ערכה מסחרית להוצאה מג'ל (gel-extraction kit) לפי פרוטוקול היצרן. השלב הבא הוא ליניאריזציה של הווקטור כדי ליצור אזורי שוליים של כ-50 זוגות בסיסים שהם הומולוגיים לקצוות ה-5' וה-3' של הגן המטרה. הכינו תערובת תגובה לליניאריזציה בנפח של 20 µL המכילה 2 µg של DNA, 7.5 units של BamH-one, 7.5 units של XHO-one, 20 µg של BSA, ושני µL של 10x buffer BamH-one.

דגרו את תערובת התגובה בטמפרטורה של 37 °C למשך שעתיים ו-40 דקות. לאחר מכן,בצעו אינאקטיבציה לתגובה בטמפרטורה של 80 °C למשך 20 דקות. כדי לטהר את הווקטור הליניארי ולמנוע זיהום על ידי הפלסמיד המעגלי שנותר, טענו את תערובת תגובת העיכול למגה-באור (mega-well) של ג'ל Agarose חצי-preparative בעל נקודת התכה נמוכה.

טען חמישה µL של תערובת התגובה לבאר הסמוכה כמדד (reporter). בצע אלקטרופורזה של DNA בטמפרטורה של 4 °C ובמתח של 5 V לסנטימטר בין האלקטרודות. לאחר מכן, הפר את ג'ל האגרוז המתאים למגה-באר (mega-well) ושמור אותו בטמפרטורה של 4 °C ב-1X TAE.

צבעו את הנתיב הכולל את סולם המשקלים המולקולריים ואת הדיווח (reporter). הדמיעו את הפסים תחת אור UV, וסמנו בחריטות את המיקום שבו נמצא הווקטור הליניארי. בהיעדר אור UV ובהסתמכות על הסימנים בנתיב הדיווח הצבוע, זהו את הווקטור הליניארי במג'ה-וול (mega-well) של הפרגמנטים וגזרו אותו.

חלצו את הווקטור הליניארי מהאגרוז וטהרו אותו באמצעות ערכה מסחרית להפקה מג'ל בהתאם לפרוטוקול היצרן. לאחר מכן, ערבבו את הווקטור הליניארי המהומה עם מקטעי ה-PCR והשתמשו בתערובת DNA זו לטרנספורמציה של תאי שמרים קומפטנטיים באמצעות ערכה מסחרית בהתאם להוראות היצרן. זרעו את התאים שעברו טרנספורמציה על מצעי SC dropout והדגירו אותם בטמפרטורה של 30 °C למשך שלושה ימים.

כדי להכין את הבדיקה זו, יש לבחור מושבות בודדות מלוחיות ה-SC dropout ולהעבירן ללוחיות 96 בארות המכילות 50 µL של מצע מינימלי לכל בארה. בכל לוחית, יש להחדיר לעמודה מספר שש את סוג ההורה כסטנדרט פנימי. כביקורת שלילית, יש להחדיר לבארה H-1, המולאה במצעי SC בתוספת uracil, תאי ESI visceral שליליים ל-URA3 ללא פלסמיד.

כסו את הפלטות במכסיהן, עטפו אותן ב-para film, והדגירו בטמפרטורה של 30 degrees Celsius בשייקר לח למשך 48 שעות. לאחר 48 שעות, הוסיפו 160 microliters של מצע ביטוי לכל באר וסגרו שוב את הפלטות. הדגירו למשך 24 שעות נוספות.

לאחר סבוב הצנטריפוגה של הפלטות, השתמשו בתחנה רובוטית רב-תכליתית לטיפול בנוזלים כדי להעביר 20 µL של הנוזל העליון מהבארים בכל פלטה לפלטת העתק. הוסיפו לכל באר 20 µL של P-methoxybenzyl alcohol בריכוז 2 mM ו-100 mM של באפר סודיום פוספט pH 6.0. ערבבו את הפלטות קצרות בעזרת מערבל פלטות ל-96 בארים והדגרימו אותן למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.

בשלב הבא, הוסיפו 160 µL של ריאגנט FOX לכל לוחית שכפול וערבבו קצרות בעזרת המערבל. קראו את הלוחיות באורך גל של 560 nm במכשיר קריאת לוחות. הדגירו את הלוחיות בטמפרטורת החדר עד להתפתחות הצבע.

מדוד את הבליעה שוב. הפעילות היחסית מחושבת מההפרש בין ערך הבליעה לאחר הדגירה לבין זה של המדידה הראשונית, כאשר התוצאה מנורמלת לסוג ההורה עבור כל פלטה. תמונת הג'ל המייצגת זו מראה את הווקטור הליניארי בניב 2, את מקטע ה-PCR של M1 בניב 3, את מקטע ה-PCR של M2 בניב 4, את מקטע ה-PCR של HF בניב 5, ואת הווקטור שהורכב in vivo וליניאריז ב-NHE 1 בניב 6.

הג'ל הבא מראה בנתיב שני את מיני-פרפ (mini-prep) של הפלסמיד של הווקטור שהורכב מחדש, בנתיב שלושה את הפלסמיד שהוליניארי עם NHE I, בנתיב ארבע את הפלסמיד שהוליניארי עם BamH I ו-Xho I, ובנתיב חמישה את הפלסמיד ההוליניארי שהתקבל על ידי הפקת ג'ל וניקוי. עומסים מוטציוניים הותאמו על ידי דגימה של ספריות מוטציות בעלות נופים שונים, חישוב מספר הכלונים עם פחות מ-10% מהפעילות האנזימטית של ההורה, ואימות נוסף על ידי רצף של מדגם אקראי של וריאנטים פעילים ולא פעילים. הערכה של גבול הגילוי של בדיקה זו הראתה כי הבדיקה הייתה ליניארית בנוכחות sorbitol, המיוצגת על ידי עיגולים שחורים.

בהיעדר סורביטול, המיוצג על ידי הריבועים הלבנים, הליניאריות הייתה עמידה יותר אך התגובה הייתה חלשה יותר. נצפתה קורלציה ליניארית בין ריכוז AAO לבין הבליעה. ספריית מוטציות של 2,000 שיבוטים הוקמה ונבדקה באמצעות בדיקה זו.

הריבוע המוצל indicates את מוטנטי AAO עם שיפור ניכר בהפרשה ובפעילות נגד P-methoxybenzyl alcohol. לאחר רכישת המיומנות, ניתן להכין ספריות מוטנטים בתוך כארבע שעות אם התהליך מבוצע כראוי. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להגדיר אזורי חפיפה מתאימים עבור כל משפחת PCR ווקטור לינארי עבור שחזור (splicing) in vivo ושכפול בשלב טרנספורמציה יחיד.

בגישה דומה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון דגימת DNA in vivo, ספריית מוטגנזה של רוויה או הרכבת DNA, וזאת במטרה להקים ספריות של מוטנטים ו/או מסלולים מטבוליים. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום הביו-הנדסה לחקור פעילויות, יציבויות, או אף להמציא סוגים אינסופיים של אינטראקציות. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לנצל את המערכת של Saccharomyces Cerevisiae לבנייה וסריקה של ספריות