בימוי שיטת אבולוציה שמר האפייה: יצירת ספריית Mutant והקרנה

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא להראות כיצד לבנות ולסנן ספריות מוטנטיות ב-Saccharomyces Cerevisiae לניסויי אבולוציה מכוונים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בשימוש ביצירה במעבדה לניסויי אבולוציה מכוונת ממוקדים כגון כיצד להקצות אזורים חופפים להרכבה ושיבוט. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא הפשטות והחוסן שלה, שכן בצעד טרנספורמציה אחד בלבד ניתן להקצות רמות באיכות טובה.

פרוטוקול זה ליצירה וסינון של ספריות מוטנטיות יודגם עבור אריל-אלכוהול אוקסידאז פטרייתי או AAO. האזורים לאבולוציה מכוונת ממוקדת נבחרים תחילה בעזרת אלגוריתמים חישוביים המבוססים על מבנה הגביש הזמין או מודלים הומולוגיה של האנזים. שני אזורים של AAO יכוונו למוטגנזה אקראית ורקומבינציה: אזור M1 ואזור M2.

PCR מוטגני יבוצע כדי להגביר את האזורים הממוקדים. כדי לקדם שחבור in vivo בשמרים, אזורים חופפים בין מקטעים של כ-50 זוגות בסיסים כל אחד ייווצרו על ידי הנחת תגובות PCR של האזורים המוגדרים. הכן PCRs מוטגניים בנפח 50 מיקרוליטר, כל אחד מכיל 46 ננוגרם של תבנית DNA 90 ננו-מולרית כל אחד של פריימרים חושיים ואנטי-סנסים 0.3 מילימולר של DNTPs, 3% של DMSO, 1.5 מילימולר של מגנזיום כלוריד, 05 מילימולר של מנגן כלוריד ו-05 יחידות למיקרוליטר של DNA פולימראז.

השתמש בתוכנית ה-PCR הבאה. 95 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות, 95 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות, 50 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות ו-74 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות למשך 28 מחזורים, ו-74 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. שאר גן ה-AAO, אזור ה-HF, יוגבר על ידי PCR בנאמנות גבוהה כאשר האזורים המתאימים חופפים את המקטעים המוטגניים, ו/או תלויים וקטוריים ליניאריים כלולים.

הכן את ה-PCR בנאמנות גבוהה בנפח סופי של 50 מיקרוליטר המכיל 10 ננוגרם של תבנית DNA, 250 ננו-מולרי כל אחד של פריימרים חושיים ואנטי-סנס, 0.8 מילימולר של DNTPs, 3% של DMSO ו-02 יחידות למיקרוליטר של iProof פולימראז DNA בנאמנות גבוהה במיוחד. השתמש בתוכנית ה-PCR הבאה. 98 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 98 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות, 55 מעלות צלזיוס למשך 25 שניות, ו-72 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות למשך 28 מחזורים, ו-72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.

לאחר מכן כל שברי ה-PCR מטוהרים עם ערכת מיצוי ג'ל מסחרית על פי פרוטוקול היצרן. השלב הבא הוא ליניאריזציה של הווקטור כדי ליצור אזורי אגף של כ-50 זוגות בסיסים שהם הומולוגיים לחמשת הקצוות הראשוניים ושלושת הקצוות הראשוניים של גן המטרה. הכן תערובת תגובת ליניאריזציה של 20 מיקרוליטר המכילה 2 מיקרוגרם DNA, 7.5 יחידות BamH-one, 7.5 יחידות XHO-one, 20 מיקרוגרם BSA ושני מיקרוליטרים של 10x מאגר BamH-one.

דגרו את תערובת התגובה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים ו -40 דקות. לאחר מכן, השבת את התגובה בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. כדי לטהר את הווקטור הליניארי כדי למנוע זיהום בפלסמיד המעגלי השיורי, טען את תערובת תגובת העיכול לתוך המגה-באר של ג'ל אגרוז עם נקודת התכה נמוכה למחצה.

טען חמישה מיקרוליטרים מתערובת התגובה בבאר הסמוכה כמדווח. הפעל אלקטרופורזה של DNA בארבע מעלות צלזיוס וחמישה וולט לסנטימטר בין אלקטרודות. לאחר מכן הפרד את ג'ל האגרוז המתאים למגה-באר ואחסן אותו בארבע מעלות צלזיוס ב-XTAE אחד.

צבעו את הנתיב עם סולם המשקל המולקולרי והכתב. דמיין את הרצועות תחת אור UV, וחתך את המיקום שבו הווקטור הליניארי ממוקם. בהיעדר אור UV ותוך שימוש בהנחיית החריצים בנתיב המדווח המוכתם, זהה את הווקטור הליניארי בשבר המגה-באר והסר אותו.

חלץ את הווקטור הליניארי מהאגרוז וטהר אותו עם ערכת מיצוי ג'ל מסחרית לפי פרוטוקול היצרן. לאחר מכן, הווקטור הליניארי המטוהר מעורבב עם שברי ה-PCR ותערובת DNA זו משמשת להפיכת תאי שמרים מוכשרים באמצעות ערכה מסחרית על פי הוראות היצרן. צלחת את התאים שעברו טרנספורמציה על צלחות נשירה של SC ודגירה אותם בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך שלושה ימים.

כדי להתכונן לבדיקה זו, בחר מושבות בודדות מלוחות הנשירה של SC והעביר אותן ל-96 צלחות באר המכילות 50 מיקרוליטר של מדיום מינימלי לבאר. בכל לוחית יש לחסן את עמודה מספר שש עם סוג ההורים כסטנדרט פנימי. כבקרה שלילית, יש לחסן היטב H-one מלא במדיומים SC בתוספת אורציל עם תאי ESI קרביים שליליים של URA3 ללא פלסמיד.

מכסים את הצלחות במכסים, עוטפים אותן בניילון פרה ודוגרים בחום של 30 מעלות צלזיוס בשייקר לח למשך 48 שעות. לאחר 48 שעות, הוסיפו 160 מיקרוליטר של מדיום ביטוי לכל באר ואטמו מחדש את הצלחות. דגירה למשך 24 שעות נוספות.

לאחר הצנטריפוגה, הלוחות משתמשים בתחנה רובוטית רב-תחתית לטיפול בנוזלים כדי להעביר 20 מיקרוליטר של הסופרנטנט מהבארות בכל צלחת לצלחת העתק. הוסף 20 מיקרוליטר של שני אלכוהול P-methoxybenzyl מילימולר ו-100 מילימולר נתרן פוספט מאגר pH 6.0 לכל באר. מערבבים את הצלחות בקצרה בעזרת מערבל צלחות של 96 בארות ומדגרים אותן למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, הוסיפו 160 מיקרוליטר של ריאגנט FOX לכל צלחת העתק וערבבו קצרות עם המיקסר. קרא את הלוחות ב-560 ננומטר בקורא לוחות. דוגרים את הצלחות בטמפרטורת החדר עד להתפתחות הצבע.

מדוד שוב את הספיגה. הפעילות היחסית מחושבת מההפרש בין ערך הקליטה לאחר הדגירה לזה של המדידה הראשונית המנורמלת לסוג ההורה עבור כל צלחת. תמונת ג'ל מייצגת זו מציגה את הווקטור הליניארי בנתיב השני, את מקטע ה-M1 PCR בנתיב שלוש, את מקטע ה-M2 PCR בנתיב ארבע, את מקטע ה-HF PCR בנתיב חמש, ואת הווקטור המורכב מחדש in vivo ליניארי עם NHE אחד בנתיב שש.

הג'ל הבא מציג את המיני-הכנה של הפלסמיד של הווקטור שהורכב מחדש בנתיב השני, הפלסמיד הליניארי עם NHE אחד בנתיב שלוש, הפלסמיד הליניארי עם BamH אחד ו-XHO אחד בנתיב ארבע, והפלסמיד הליניארי המתקבל על ידי מיצוי וניקוי ג'ל בנתיב חמש. עומסי המוטציות הותאמו על ידי דגימת ספריות מוטנטיות עם נופים שונים, חישוב מספר השיבוטים עם פחות מ-10% מפעילות האנזים ההורי, ואימות נוסף על ידי ריצוף מדגם אקראי של וריאנטים פעילים ולא פעילים. הערכה של גבול הגילוי של בדיקה זו הראתה כי הבדיקה הייתה ליניארית בנוכחות סורביטול המיוצג על ידי עיגולים שחורים.

בהיעדר סורביטול המיוצג על ידי הריבועים הלבנים, הליניאריות הייתה מתמשכת יותר אך התגובה הייתה חלשה יותר. נצפה מתאם ליניארי בין ריכוז AAO לספיגה. ספריית מוטאנטים של 2,000 שיבוטים נבנתה והוקרנה באמצעות בדיקה זו.

הריבוע המוצל מציין את מוטציות ה-AAO עם הפרשה ופעילות משופרות במיוחד כנגד אלכוהול P-methoxybenzyl. לאחר שליטה, ניתן ליצור ספריות מוטנטיות תוך כארבע שעות אם זה מבוצע כראוי. כאשר מנסים הליך זה, חשוב לזכור להקצות אזורים חופפים מתאימים לכל משפחת PCR וקטור ליניארי עבור שחבור ושיבוט in vivo בשלב טרנספורמטיבי יחיד.

בעקבות גישה דומה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו דגימת DNA in vivo, ספריית מוטגנזה רוויה או הרכבת DNA על מנת לבנות ספריות מוטנטיות ו/או מסלולים מטבוליים. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביו-הנדסה לחקור פעילויות, יציבות, או אפילו להמציא אינסוף סוגים של אינטראקציה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לרתום את מכשיר Saccharomyces Cerevisiae זה לבניית ספריות והקרנה