בסיוע מחשב ויזואליזציה בקנה מידה גדול כימות המוניים הלבלב איילט, התפלגות גודל ואדריכלות

המטרה הכוללת של הליך זה היא לאסוף נתונים מייצגים בלתי משוחדים בתוך מדגם מוגבל ולנתח במדויק את המבנה התלת מימדי המורכב של הרקמה. זה מושג על ידי לכידת פרוסות וירטואליות של אימונוהיסטו, חלקי לבלב מוכתמים כימית. לאחר מכן מכמתים את הפרוסות הווירטואליות עם מאקרו הפרוסה הווירטואלית של IHC בתוכנת תמונה J, והנתונים מנותחים באמצעות סקריפטים שנכתבו עבור Mathematica.

לאחר מכן, שחזור תלת מימד של הפרוסות הווירטואליות מתבצע באמצעות תמונה J.השלב האחרון של ההליך הוא ללכוד ערימה של תמונות איים בודדות באמצעות תוכנת ספר השקופיות ולמפות את ערימות התמונות באופן ידני בתלת מימד באמצעות חוקר סטריאו. בסופו של דבר ניתן להשיג ארכיטקטורת לולאות מדויקת עם קואורדינטות תלת מימד לכל תא עינית באמצעות שיטה משולבת של הדמיה תלת מימדית ומיפוי ידני. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום לימודי השמנת יתר וסוכרת כגון כיצד מצבים פיזיולוגיים ונתיב של מצבים פיזיולוגיים משפיעים על הלבלב, התפלגות מסת תאי הבטא והארכיטקטורה.

ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על אבחון או טיפול בהשמנת יתר וסוכרת מליטיס מכיוון שהבנה טובה יותר של השינויים במסת תאי הבטא תקל על פיתוח והערכה של התערבויות טיפוליות. למרות שהשיטות המתוארות במחקר הנוכחי מספקות תובנה ספציפית לגבי הניתוח האימונוהיסטוכימי הדינמי של הלבלב ניתן ליישם גם על מערך של אורגניזמים ורקמות אחרות. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד את שלבי הניתוח בעזרת מחשב.

בגלל המורכבות של ניתוח מערכי נתונים כה גדולים בדו ותלת מימד. התחל הליך זה על ידי הנחת שקופית נקייה המחזיקה קטע שלם של לבלב אימונוהיסטו, מוכתם כימית במחזיק של מיקרוסקופ פלורסנט. פתח את תוכנת חוקר הסטריאו ודמיין את הדגימה על ידי לחיצה על רכישה.

ואז תמונה חיה. קבעו את רמות החשיפה לכל ערוץ באמצעות חלון היסטוגרמה של הווידאו, המציג את עוצמת הקרינה. בדוגמה זו, ערוץ שני משמש עבור ערוץ DAP P שלוש עבור ערוץ GFP ארבע עבור RFP, ערוץ חמש עבור מדע חמש וערוץ שש עבור SCI שבע.

באמצעות חלון הגדרות המצלמה, כוונן את רמת החשיפה כך שעוצמת הקרינה תזנב. בקצה הימני של היסטוגרמה של הווידאו, ניתן למקד את התמונה באמצעות גלגל המיקוד של המיקרוסקופ. לפני יצירת פרוסה וירטואלית, סמן את הדגימה על ידי לחיצה על המסך בנקודה הרחק מהדגימה, שתסמן נקודת ייחוס.

לאחר מכן לחץ מסביב לקווי המתאר של הדגימה לאחר השלמת קווי המתאר. לחץ לחיצה ימנית ובחר סגור קו מתאר כדי לחבר את נקודות ההתחלה והסיום לאחר סגירת קווי המתאר, לכוד פרוסה וירטואלית עבור המדגם על ידי בחירת רכישה ולאחר מכן רכוש פרוסה וירטואלית. כאשר אפשרויות חלון הפרוסה הווירטואלית נפתחות, בחר רכישה במהירות גבוהה, כמו גם השבתת ידני.

התמקדות על ידי ביטול הסימון בתיבה שליד ידני. שמור את הקובץ. כייל את ה-prefo על-ידי לחיצה באמצעות לחצן העכבר הימני ובחירה באפשרות הוסף לרשימת אתרי המיקוד.

מקד ידנית מספר קטעים אקראיים בתצוגה המקדימה של הפרוסה הווירטואלית כאשר מספר אתרים התמקדו, התחל את הפרוסה הווירטואלית על ידי לחיצה ימנית ובחירה. התחל פרוסה וירטואלית עם prefo לאחר השלמת הפרוסה הווירטואלית עבור הדגימה הראשונה, עבור לערוץ הבא והתאם את החשיפה בהתאם. הליך זה חוזר על עצמו עבור כל ערוץ כדי לבצע כימות של לולאות לעבד את התמונות באמצעות מאקרו תמונה J בשם I-H-C-V-S, המכין תחילה תמונות טעונות לניתוח ולאחר מכן מכמת תכונות של לולאות כגון הרכב תאי.

פקודות המאקרו I-H-C-V-S מפצלות את הערימה לערוצי הצבע המתאימים. בתמונה J ממיר כל תמונה למסיכה בשחור-לבן של שמונה סיביות. לאחר עוצמה אוטומטית, קביעת סף והוספה של תמונות הערוץ הנפרדות יחד באופן אריתמטי למסיכה ללא הפרדות צבע.

ניתוח החלקיקים המובנה של תמונה J בתמונה המרוכבת יזהה אזורי עניין או החזר ROI תוך אי הכללת חלקיקים קטנים מתא בטא אחד. כימות החזר ההשקעה. שימוש בתמונה J יוצר גיליון אלקטרוני של פרמטרים של תאים.

שמור את התוצאות המצטברות בגיליון אלקטרוני של Excel. אחסון נתונים כגון מעגליות היקף השטח, קוטר הקצה ומרכז העפעפיים עבור כל עינית, יחד עם מספרים מתאימים המסומנים בתמונה. ניתן לבצע ניתוח חישובי של פרמטרים אלה כמתואר בפרוטוקול הכתוב כדי לחשוף מידע כולל התפלגות לולאות וניתוח תדרים, בצע שחזור תלת מימדי של פרוסות וירטואליות על ידי הפעלת סקריפט הממיר את כל שתי התמונות של JP בספרייה לקבצי TIF, שהוא הפורמט המשמש לבנייה וכימות של ערימות תלת מימדיות מהפרוסות הווירטואליות.

כאן, נעשה שימוש בתסריט שנקרא I MJ two two tiff. העתק את קובץ ה- Script לספריה המכילה את שתי התמונות של JP. הפעל את הסקריפט עם מעטפת לינוקס על ידי הקלדת dot slash I am JP two two TIFF לתוך הקונסולה ולאחר מכן לחיצה על Enter.

כאשר כל התמונות שצולמו הומרו מקבצי JP 2 ל-TIFF, הן מוכנות לשימוש לניתוח בתמונה J.באמצעות תמונה J, פתח את כל התמונות עבור הדגימה הראשונה, שבמקרה זה הן מלבלב עוברי אנושי ומזג אותן כאחת על ידי בחירת תמונה, צבע, ולאחר מכן למזג ערוצים. חזור על תהליך זה עבור כל אחת מהדגימות כאשר כל הדגימות שולבו כתמונות בודדות. נקה את התמונות על-ידי בחירת אזורים לא רצויים בעזרת הכלי לבחירת מצולעים.

מלא אותם על-ידי בחירה באפשרות עריכה ולאחר מכן מילוי. המירו כל תמונה לתמונת צבע RGB. לבסוף, צור ערימה מתוך התמונות ולאחר מכן ניתן ליישר אותן עוד יותר עם תוסף stack reg.

בסופו של דבר, מיזוג הערוצים ושילוב התמונות יוצר מונטאז' תלת-ממדי של כל הלולאות בלבלב כולו. כדי לאסוף ערימות תמונות, מקם את כל לולאות הלבלב מתחת למיקרוסקופ. יש למרוח מים אם משתמשים בעדשה אובייקטיבית לטבילה במים.

פתח את תוכנת חוברת השקופיות, גש לבקרת הלכידה והמיקוד על ידי לחיצה על Control plus shift plus E בחלון בקרת המיקוד. הגדר את המטרה ל-20 פעמים או 40 פעמים בהתאם לגודל העין. כדי להשתמש בעינית המיקרוסקופ כדי לאתר את הלולאות, הגדר את הסל לפעמיים והגדר את סט המסנן למשתמש אחד.

בחלון בקרת המיקוד, יש להגדיר את בחירת הפליטה ל-100%יש להגדיר עיניים בצפיפות ניטרלית ללחיצה אחת GFP ey, ולאחר מכן לפתוח את הרצפה כדי לדמיין את הדגימה בספר השקופיות, לחזור לחלון בקרת המיקוד ולהחליף את המסנן המוגדר לתיקון. לאחר מכן לחץ על G-F-P-D-S. השתמש בג'ויסטיק כדי למרכז את העין במצלמה חלון אחד טוב ככל האפשר.

התמקד לעומק איפשהו ליד מרכז העין שבו ניתן להבחין בתאים בקלות. בחלון בקרת המיקוד, בחר את הזאב. השתמש בפקד הטווח כדי לגלול לעומק העליון של העין שבו ניתן להבחין בבירור בתכונות, ולחץ על הגדר למעלה.

גלול לתחתית העינית ולחץ על הגדר. תחתון לחץ על go. כדי לחזור לנקודת הייחוס בחלון הלכידה, לחץ על מתקדם ולאחר מכן על מצב חלופי לערוץ.

הגדר את גורם הסל לפעמיים ואת סוג הלכידה לתלת-ממד בצד ימין של החלון, לחץ על השתמש במיקומים עליונים ותחתונים וחזור לעוצמת הקול המרכזית לאחר הצילום. הגדר את גודל המדרגה לשלוש. הגדר את ערכת המסננים כך שתחיה מתחת לקופסת ערכת המסננים.

בחר DAP, E-D-S-U-G-F-P-D-S-U-R-F-P-D-S-U ו-SCI five DSU. עבור כל אחד מהם, לחץ על מצא את הטוב ביותר תחת התאם את החשיפה. לאחר מכן לחץ על בדיקה כדי לוודא שהחשיפה שנבחרה מתאימה.

לחץ על התחל כדי להתחיל בצילום. לאחר השלמת הלכידה, התאם את הרמות לפי הצורך ושנה את הצבע המוצג עבור RFP ללבן. שמור את השקופית ועבור ל view ייצוא סדרת TIFF.

הקלד את שם השקופית עם מקף בסוף ושמור אותה. נוצרים עשרות קובצי TIF נפרדים, כך שכדאי לשמור כל ערימת תמונות של לולאות בתיקייה נפרדת. כדי למפות ערימות תמונות, פתח את תוכנת חוקר הסטריאו.

הציגו את התמונה באופן חזותי באמצעות פתיחת אוספי התמונות בתפריט שינוי גודל התמונה. הגדר מרחק בין תמונות לשלושה מיקרון כדי לתקן כיפוף כפול. בחוברת שקופיות, בחר עקוף את שינוי הגודל של X ו- Y והשתמש ב- שצוין למקור של שינוי גודל x ו- Y.

הזן 0.65 עבור מרכז X ו-Y והגדל את התמונה על ידי לחיצה על כפתור הזום, ולאחר מכן באמצע ה-ilis המעניין בחלון המאקרו שוק תא אחד לפחות. באמצעות הסמן המתאים תאי בטא יופיעו בירוק. תאי אלפא יופיעו באדום ותאי דלתא יופיעו לבנים.

סמן את התאים במרכז הגרעין שלהם, שיופיעו כחולים אם הדגימה נצבעה ב-DPI השתמש בסמן שתיים כדי לסמן תאי בטא. סמן חמש לסימון תאי אלפא, וסמן שש לסימון תאי דלתא. לאחר סימון תא אחד לפחות, הצג את התצוגה האורתוגונלית באמצעות הסמל בתפריט העליון, בדוק מסנן Z וסימטרי.

יש להגדיר את הטווח ל-15.00. החל מ-0.0 Z.גלול בין הלולאות באמצעות גלגל העכבר וסמן כל תא בסמן המתאים, סמן כל תא פעם אחת בלבד במרכז עומקו. לאחר סיום הסימון של כל אחת מרמות Z, ניתן לבטל את הסימון בתיבת הסימון של מסנן Z.

פעולה זו תציג את כל הסמנים מכל רמות ה-Z. כאשר כל תא סומן, שמור את הקובץ כקובץ DAT. לאחר מכן עבור אל מעקב אחר ייצוא קבצים.

שמור את העקיבה כקובץ TXT. לבסוף, לחץ על קובץ נתונים חדש כדי לנקות את סביבת העבודה לפני שתנסה למפות לולאות חדשות. הכנת פרוסות וירטואליות מדגימת לבלב מוכתמת אימונוהיסטוכימית מאפשרת בחינה של התאים האנדוקריניים אלפא, בטא ודלתא בכל הלבלב יחד שכן ניתן לראות צביעה אימונוהיסטוכימית לאינסולין בירוק, גלוקגון באדום, סומטוסטטין בלבן ו-DAP בכחול.

לאחר מכן התמונות הומרו למסיכת שמונה סיביות לאחר סף אוטומטי. מוצגת כאן התמונה המורכבת של המיזוג. עם זאת, הפצת לולאות באמצעות פרוסה וירטואלית מאפשרת גם ניתוח פרטני בערוצים נפרדים.

כאן, תצוגות של כל ערוץ מוצגות כדי לחשוף את תאי הדלתא, תאי הבטא ותאי האלפא. ניתוח חלקיקים שבוצע על מסכה מרוכבת המציג כל מבנה לולאה ממוספר ומודגש בכחול. ניתוח החלקיקים של מסכות מרוכבות מוצא כטבלת נתונים המכילה פרמטרים כגון מעגליות היקף שטח Islas וקוטר שונה עבור כל עינית שזוהתה, שיש להם מזהים התואמים את התגים הממוספרים על המסכה המרוכבת.

הניתוח בקנה מידה גדול של תמונות אלה מביא לייצור היסטוגרמות של מספר העפעפיים הכולל והתפלגות הגודל, כמו גם השוואות מפורטות של אזורי תאי אלפא, בטא ודלתא. מיפוי לולאות וניתוח מתמטי של הרכב וארכיטקטורה תאית יכולים לחשוף מישור מוקד יחיד מערימה משוחזרת תלת מימדית של תמונות של לולאות אנושיות שהועלו לחוקר סטריאו. כאן, תאי בטא נמצאים בתאי אלפא ירוקים בתאי דלתא אדומים בלבן וגרעינים בכחול.

לאחר לכידת לולאות נפרדות, תאי אלפא, בטא ודלתא מסומנים במישורי ים שונים כאן, תמונות פלואורסצנטיות ונתוני המפות המתאימים מוצגים עבור שלושה מישורי מוקד שונים במרווח של 10 מיקרון. לאחר שתאי האלפא, הבטא והדלתא סומנו במישורים שונים, ניתן לדמיין את העין בתלת מימד. מוצג כאן שחזור תלת מימדי של רבע העין הפרוסה בהתבסס על קואורדינטות המתקבלות על ידי מיפוי לולאות.

יתר על כן, ניתוח מתמטי אוטומטי של לולאות ממופות יכול להציג את ההרכב והארכיטקטורה של התא. כאן מוצגת התדירות היחסית של מרחקי תאים בין שני תאים באוכלוסיית תאים בודדת. כמו כן מוצגת התדירות היחסית של מרחקי תאים בין שתי אוכלוסיות תאים שונות.

כמו כן מוצגות ההסתברויות המצטברות של התפלגות מרחק תא לתא עבור תאי אלפא לאלפא, בטא לבטא ודלתא לתאי דלתא. ניתן לבצע את מבחן cole OV smirnov או KS על הסתברויות אלה כדי להשיג את מרחקי ה-KS המתאימים. לאחר שליטה, ניתן לבצע הדמיה וניתוח בקנה מידה גדול של קטע רקמה שלם תוך ארבע שעות.

שחזור תלת מימד של גוש רקמה יכול להיעשות תוך 30 דקות. לבסוף, ניתן להשלים הדמיה תלת מימדית ומיפוי ידני תוך ארבע שעות אם מבוצעים כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב להתחיל עם צביעה אימונוהיסטוכימית באיכות גבוהה של החלקים.

הדיוק של הניתוח הבא יהיה תלוי בנתונים הגולמיים. כמו כן, ודא שלמחשבים שלך יש לפחות שמונה ג'יגה-בייט של זיכרון RAM כדי לעבד ניתוח בקנה מידה כה גדול לאחר פיתוחו. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים, לא רק בתחום ההשמנה והסוכרת, אלא באופן נרחב בתחומים רבים אחרים המשתמשים בניתוח הפתולוגי הסטנדרטי.

זה עשוי להיות שימושי במיוחד כאשר זמינות הדגימות מוגבלת. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לאסוף נתונים מייצגים בלתי מוטים בגודל מדגם מוגבל באמצעות טכניקות סטנדרטיות. בחירת אזור ספציפי בלבד עשויה שלא לייצג את התמונה כולה, כפי שהראינו באמצעות מחקר התפלגות לולאות הלבלב שלנו.