Name: מבחני ביות תחרותי לחקר נדידת גוט-טרופי T Cell (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-01T17:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: חקור מבחני ביות תחרותיים לחקר נדידת תאי T גוט-טרופיים בעכברים. השיטה מאפשרת השוואה ישירה של יכולות הנדידה לרקמות שונות ומספקת תובנות חשובות לחקר האימונולוגיה והתאים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

EJV נתמך על ידי מענק מן ה-S &amp; קרוהן קוליטיס קרן של אמריקה (CCFA). JRM הוא נתמך על ידי מענקים CCFA, Cancer Research Institute (CRI), הווארד ח גודמן (MGH), מסצ&#39;וסטס Life Science Center (MLSC) ואת פרס ממציא ניו NIH של המנהל.

1. Ex vivo הדור של תאים T מעיים ביות ושליטה (ראה תרשים 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בודד splenocytes מוחצים one טחול מעכברים סוג בר. Resuspend ההשעיה תאים PBS ו צנטריפוגות במשך 5 'ב 400 x ז הסר את supernatant ו lyse את כדוריות הדם האדומות על ידי resuspending התא גלולה של 4 מ"ל של חיץ תמוגה ACK עבור 2-3 דקות. לאחר מכן, להוסיף 5 מ"ל של PBS. צנטריפוגה עבור 5 'ב XG 400 ולהסיר את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend splenocytes סך של 1 x 10 6 / מ"ל ב IMDM + 10% FBS + 50 מ"מ + 2-mercaptoethanol פניצילין / סטרפטומיצין (IMDM מלא). הפרד את התאים לשתי קבוצות, שאחת מהן היא להשלים עם RA (או סינתטיים RAR-אגוניסטים, כגון Am80 או Am580) לריכוז סופי של nM 100-200 3. בתאי T מופעל בנוכחות של RA או RAR-אגוניסטים יהיה upregulate a4b7and CCR9 ויהפוך מעיים טרופי בתאי T, בעוד שתאי T מופעלים ללא RA יהפכו T תאים שליטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1.5-2.0 מ"ל של ההשעיה התא היטב בכל צלחת 24 באר מצופה בעבר עם אנטי CD3 (10 מ"ג / מ"ל) אנטי CD28 (10 מ"ג / מ"ל) ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס CO 5% 2 (לציפוי הצלחת להוסיף 500 מ"ל / היטב אנטי CD3 בתוספת אנטי CD28 ב PBS ו דגירה עבור 2 שעות 37 ˚ C ולאחר מכן לשטוף פעמיים עם 2 מ"ל PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למנוע גירוי יתר תא T, לאחר 2-3 ימים להעביר את המתלים התא לתוך צלחת חדשה 24 גם ללא ציפוי. דגירה של 2-3 ימים נוספים. בהתאם צפיפות התאים ואת ריבוי כלי התקשורת עלול להיות חומצה (צהוב), ובמקרה זה עשוי להיות נחוץ כדי להחליף מחצית התקשורת עם IMDM שלם טרי. קציר התאים לאחר 4-5 ימים (הספירה מהיום 0). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התשואות הסופי אופייניות הן 1-2 x 10 6 תאים T מפעיל / היטב. לכן, מינימום של 9-12 בארות של כל המעי, ותאי T טרופי ושליטה בתאי T צריך להיות מצופה על מנת בסופו של דבר עם 10-20 x 10 6 תאים T לכל מצב. </li></ol> 2. ניתוח מעיים ביות על הפעלת קולטנים בתאי T לאחר 4-5 ימים של תרבות אנחנו צריכים לצפות ביטוי גבוה של רצפטורים מעיים ביות a4b7and CCR9 על שתאי T מופעלים בנוכחות אגוניסטים RA או RAR, בעוד בקרה בתאי T צריך להביע רמות נמוכות מאוד של קולטנים אלה 4. Cytometry זרימה (FACS) ניתוח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף בין 0.2-0.5 x10 6 תאים בצנטריפוגה במשך 5 דק 'ב 300 גר' ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם אנטי CD4-FITC, אנטי a4b7-PE (BD Biosciences), אנטי CCR9-APC (eBiosciences) ואנטי CD8-PercP במשך 15 דקות ב 4 ° C בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה, צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 300 גרם 4 ° C. לשטוף ו resuspend התאים מכתים חיץ ולנתח ידי FACS. </li></ol> 3. תיוג תא T עם עוקבים CFSE ו CMTMR תא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את כל הפתרונות על 37 מעלות צלזיוס לפני שמתחילים. לשטוף מעיים טרופי ותאי T (a4b7 גבוהה CCR9 גבוהה) ושליטה בתאי T (a4b7 נמוכה / נג CCR9 נמוכה / נג) פעמיים עם PBS להסיר את בסרום. התאם את הריכוז תא T ל 10-15 x 10 6 / מ"ל PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף CFSE (Carboxyfluorescein succinimidyl אסתר) או CMTMR (chloromethyl-בנזואיל-amino-tetramethylrhodamine) fluorophores אל T-טרופי או בטן מלאה בתאי T ריכוז סופי של 5 מ"מ ו 10 מ"מ, בהתאמה, מערבולת בעדינות דגירה של 20 דקות בשעה 37 ° C. מומלץ להחליף את labelings באותו או בניסוי נפרד על מנת למנוע תופעות מהותי הפוטנציאל של fluorophores על נדידת תאים טי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה, להרוות עם נפח של 1 FBS ו דגירה של 1-5 דקות בטמפרטורת החדר. מדולל 10 פעמים עם PBS חם צנטריפוגות 5 דקות ב 300 גרם שטפו פעמיים עם PBS ו resuspend ב IMDM להשלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן אידיאלי, 10-20 x 10 6 התאים של כל האוכלוסייה T צריכה להיות מעורבת ביחס של 1:1 ולאחר מכן centrifuged XG ב 300 דקות 5. לבסוף, resuspend התאים 200-250 מ"ל של PBS חמה מזריקים דרך וריד הזנב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחשב את יחס קלט המדויק (רצוי קרוב ל 1) לחסוך 5-10 מ"ל של השעיה התא שהוחדר ו לדלל עם 300 מ"ל של PBS ולנתח ידי FACS. </li></ol> 4. ניתוח של תא T ביות אמנם בעכברים ניתן לנתח בנקודות זמן שונות (בין 1 שעות שלאחר מספר ימים הזרקת תא T), ביות של המעיים ותאי T-טרופי מתועדת הטוב ביותר בין 12-24 שעות שלאחר ההזרקה. נקודות זמן רב יותר להגדיל את ההשפעות האפשריות של משתנים אחרים המשפיעים על התא האחרון מספרים / יחסי, כמו אפופטוזיס תא T ו-T תא יציאה מן הרקמה. לאחר בעכברים מורדמים, השעיות תאים מרקמות כמה צריך להיות מבודד ללא דיחוי על מנת להקטין מוות של תאים, אשר עשויים להשפיע על התשואות הסופי ואת התוצאות. רקמות של עניין הם המעי הגס קטן, הטחול, בלוטות הלימפה, תיקונים של Peyer, כבד, ריאות ודם. אםבתאי T מוזרק הם בתום לב מעיים טרופי בתאי T, הם צריכים בית על פי 50-10 בממוצע טוב יותר (או יותר) על רירית המעי הדק לעומת בקרה בתאי T. עם זאת, רקמות אחרות, כגון דם הטחול, לא צריך להציג הגירה מועדף תא T. בידוד של לימפוציטים מתוך lamina propria במעי תא intraepithelial תוארה בעבר 5. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכתים FACS: דוגמאות הן resuspended תלוי במספר התאים שנאספו, בצפיפות לא גבוהה יותר מאשר 3.0 x 10 6 תאים / מ"ל. אם congenic CD45.1 + + או Thy1.1 עכברים ששימשו נמענים, התאים הם מוכתמים סמן congenic המתאים (למשל, CD45.2 או Thy1.2) בשילוב עם סמן כמה השושלת (למשל, TCRbchain, CD4, CD8 , CD45.1 + / CD45.2 +). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך ניתוח FACS, תאים מגודרת על סמן congenic (למשל CD45.1) ולאחר מכן על סמנים ספציפיים השושלת (למשל CD4/CD8) ונותחו על היחסים בין CMTMR ותאי CFSE חיובית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנתונים בא לידי ביטוי בדרך כלל מדד ביות (HI), אשר מחושב CFSE היחס / CMTMR (או CMTMR / CFSE) ברקמות בכל חלקי יחס הקלט המתאים (ראה להלן). אם יחס קלט קרוב מאוד 1, ולאחר מכן את רקמת היחסים יהיה שווה ערך ל HI. </li></ol> היי = רקמה / CMTMR רקמות CFSE: קלט / קלט CMTMR CFSE דם צריך גם להיות מנותח על מנת לקבוע אם הן אוכלוסיות תאים T מיוצגים באופן שווה במחזור הדם או אם אוכלוסיית תאים T יורדת ביחס אחרות (למשל, על ידי לכידה מועדף בריאות / כבד או הכדאיות ירד). זה עלול לקרות כאשר משווים נאיבי או מנוחה לתאי T זיכרון לעומת הופעל לאחרונה בתאי T מפעיל, שכן האחרון עלול להיות לכודים במידה רבה יותר בתוך הריאות. אם HI בדם היא שונה משמעותית מ 1, אפשר לנרמל HI ברקמות ידי HI בדם. דם ניתן להשיג באמצעות לנקב לב מעכברים הרדים (עם המתת חסד Avertin או isofluorane מראש) ויש lysed פעמיים לפני השימוש בו מכתים FACS עם חיץ ACK. נורמליזציה דם = HI רקמה / HI דם 5. נציג תוצאות עכברים נמען (Thy1.1 +) היו תאים euthanized18h הזרקת הודעה. המתלים Cell נוצרו מן הטחול, בלוטות הלימפה ההיקפית (PLN), בלוטות לימפה mesenteric (mln) ובמעי הדק lamina propia (LP). לאחר שהתאים היו מוכתמים עבור Thy1.2 ו CD8 ולאחר מכן נותחו על ידי FACS gating על ידי קיימא Thy1.2 + CD8 + תאים, אשר נבדקו לבסוף על היחס בין CMTMR תאים + (מעיים טרופי ותאי T) ו CFSE + תאים (שליטה ותאי T) מחולק יחס קלט. התוצאות יכול להיות מוצג כפי שמוצג באיור 2, שבו ניתן להעריך כי מעיים טרופי ושליטה בתאי T התבייתו שווה על הטחול (HI קרוב to1, ציין עם קו אדום). לעומת זאת, הבטן טרופי בתאי T היגרו כ -10 פעמים יותר ביעילות LP לעומת בקרה בתאי T. <img src="/files/ftp_upload/2619/2619fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> Figure1:. דיאגרמה המציגה את הדור וסימון של טרופי בטן ולא במעיים טרופי T לתאים ותאי T מבודדים מעכברים סוג בר מופעל עם anti-CD3/anti-CD28 ועל נוכחות או היעדר של 100-200 nM כל - טרנס retinoic חומצה (ע"ר). לאחר 4-5 ימים RA שטופלו תא T תרכוש את הביטוי של קולטנים ביות בטן CCR9 ו a4b7. ואז, מעיים טרופי ושליטה בתאי T מסומנים באופן דיפרנציאלי עם CFSE או CMTMR, שטף, מעורבת ביחס של 1:1 ו מוזרק עכבר לנמען דרך וריד הזנב. תאים מסוימים שכותרתו משמשות כדי לקבוע את היחס CFSE / CMTMR קלט (יש קרוב ל 1). <img src="/files/ftp_upload/2619/2619fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> Figure2:. עכברים דוגמה של ניתוח ביות ניתח 12-18 שעות שלאחר הזרקת T התא השעיות תא בודד מתקבלים איברים של עניין. התאים הם מוכתמים אנטי Thy1.2 (סמן congenic) בתוספת אנטי CD8 ואז Thy1.2 + CD8 + T תאים מנותחים על יחס של CMTMR + + ו CFSE תאים ברקמות על ידי כל FACS. CMTMR / CFSE יחסי רקמה מנורמל אז לפי היחס בין קלט CMTMR / CFSE כדי להשיג את מדדי ביות (HI). ב + דוגמה זו CMTMR ו CFSE תאים + הם מעיים טרופי ועל מפעיל בקרה בתאי T, בהתאמה.

<ol><li>Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte-endothelial+cell+recognition%3A+Three+%28or+more%29+steps+to+specificity+and+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Leukocyte-endothelial cell recognition: Three (or more) steps to specificity and diversity.</a> Cell. 67, 1033-1036 (1991).</li>
<li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traffic+signals+for+lymphocyte+recirculation+and+leukocyte+emigration%3A+the+multistep+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm.</a> Cell. 76, 301-314 (1994).</li>
<li>Iwata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+imprints+gut-homing+specificity+on+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid imprints gut-homing specificity on T cells.</a> Immunity. 21, 527-538 (2004).</li>
<li>Mora, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+and+dynamic+control+of+CD8+T+cell+homing+by+dendritic+cells+from+skin-+and+gut-associated+lymphoid+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Reciprocal and dynamic control of CD8 T cell homing by dendritic cells from skin- and gut-associated lymphoid tissues.</a> J Exp Med. 201, 303-316 (2005).</li>
<li>Mora, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+imprinting+of+gut-homing+T+cells+by+Peyer%27s+patch+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Selective imprinting of gut-homing T cells by Peyer's patch dendritic cells.</a> Nature. 424, 88-93 (2003).</li>
<li>Mempel, T. R., Scimone, M. L., Mora, J. R., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+leukocyte+trafficking+in+blood+vessels+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues.</a> Curr Opin Immunol. 16, 406-417 (2004).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

למרות ניסויים ביות לספק מידע בעל ערך רב על הגירה של אוכלוסיות תאים ברקמות סך נתון, יש לזכור כי מבחני אלו אינן ישירות לנתח הידבקות האנדותל, ולכן לא להפלות שבו צעד (ים) של הידבקות רב שלבי אשד (קשירה / מתגלגל, הפעלה או דבק) קולטן ביות נתון פועל. תקן הזהב להגדיר את התפקיד הספציפי של קולטנים ביות במפל את הידבקות היא מיקרוסקופית intravital (IVM) שבו שכותרתו fluorescently אדם ותאי T (או תאים אחרים או חרוזים שכותרתו אפילו fluorescently) הם נצפו ישירות אינטראקציה עם לתאי אנדותל בזמן אמת. ע...

בעלי חיים: C57BL עכברים / 6 משמשים בדרך כלל עבור בידוד תא T. בנוסף, CD45.1 ו Thy1.1 זנים congenic זמינים דרך ג&#39;קסון מעבדות (בר הרבור, ME). תרבות התקשורת: IMDM (Medium השתנה Iscove של של Dulbecco + L-גלוטמין + Hepes) בתוספת 10% חום מומת FBS (עוברית שור רעלן פנימי סרום, נמוך, Gibco ®, Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה) בתוספת 100 U / ml פניצילין, 100 מ&quot;ג / ml סטרפטומיצין (אנטיביוטיקה HyClone, Waltham, MA), 0.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​fungizone / amphotericin B (Gibco), ו - 50 מ&quot;מ ב-mercaptoethanol. תא דם אדום ACK תמוגה חיץ (RBC, 10 mM KHCO 3, 150 מ&quot;מ NH 4 Cl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0), כדי להתאים את pH 7.2-7.4 ולאחסן בטמפרטורת החדר). PBS (פוספט בופר, Hyclone, Waltham, MA). Cytometry זרימה (FACS) מדיה (PBS או IMDM + 2% FBS + 5 mM EDTA). כאשר מכתים באמצעות selectin-Fc מפלצות, התקשורת עם 2 mM Ca + + יש להשתמש בכל האמצעים (כולל רכישת FACS). IMDM מומלץ במקרה זה. T תיוג תא ולהעביר המאמצת: CFSE (diacetate carboxyfluorescein, succinimidyl אסתר), CMTMR ((5 - (ו-6 )-((( 4-chloromethyl) בנזואיל) אמינו) tetramethylrhodamine) מתוך בדיקות מולקולריות ®, Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה ). 1000 x במניות צריכה להתבצע DMSO (5 CFSE מ&quot;מ, 20 מ&quot;מ CMTMR) ומאוחסנים ב -20 ° C. Polyclonal הפעלת תא T: 24-96-יפה או גם צלחות (רקמות תרבות מטופלים, קלקר, שטוחות תחתית עם מכסה, BD פלקון, פרנקלין לייקס, ניו ג&#39;רזי) מודגרת עבור 2 שעות על 37 מעלות צלזיוס עם 50 מ&quot;ל PBS, בהתאמה , המכיל אנטי CD3 בתוספת אנטי CD28 נוגדנים (10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​כל אחד). ואז, צלחות תרבות נשטפים פעמיים עם PBS ומשומשים מיד לתרבות תא T. לחלופין, Dynabeads מצופה anti-CD3/anti-CD28 (Dynal, Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה) יכול לשמש להפעלת תא T במקום צלחת הנכנס נוגדנים. תזרים cytometry (FACS) מכתים: הפעלת polyclonal: CD3 (1452C11), CD28 (37.51). Lineage MAB: CD4 (L3T4), CD8a (Ly-2), Thy1.2 (CD90.2/53-1.2), CD45.2 (104). Gut-ביות קולטנים: מטוהרים CCR9 (CD199/eBioCW-1.2, eBioscience, סן דייגו, קליפורניה), a4b7 (LPAM-1/DATK3), אלוטיפ שליטה (IgG2a, יא). עור ביות קולטנים: P-selectin-Fc (מטוהרים מאוס P-selectin - חלבון IgG Fusion, BD Pharmingen, בסן חוזה, קליפורניה), E-selectin-Fc (E-Selectin/Fc עכבר רקומביננטי כימרה, R &amp; D מערכות, מיניאפוליס, MN) בתוספת עז המקביל משני מגיב F (ab &#39;) 2 אנטי אנושי IgG R-PE (Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה). All-טרנס החומצה הרטינואית (Sigma, סנט לואיס, מיזורי) הוא resuspended באתנול DMSO מוחלטת או באמצעות נורה צהובה או מקור אור עקיף במהלך הכנת. Aliquots חנות בתוך צלוחיות זכוכית -80 מעלות צלזיוס ומוגן מפני אור בכל עת. Synthetic-RAR אגוניסטים: Am80 (Wako כימיקלים, ריצ&#39;מונד, VA).

מבחני ביות תחרותי לחקר נדידת גוט-טרופי t cell

Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

על מנת להפעיל לימפוציטים תפקידם צריכים לעזוב את הדם ולנדוד לרקמות שונות בגוף. הידבקות הלימפוציטים לתאי האנדותל extravasation רקמות הוא תהליך רב שלבי נשלט על ידי מולקולות הדבקה שונות (קולטנים ביות) הביע על לימפוציטים ו ligands שלהם (addressins) מוצג לתאי אנדותל 1 2. אף על פי פונקציה של קולטנים אלה הדבקה ניתן ללמוד באופן חלקי לשעבר vivo, את המבחן האולטימטיבי רלוונטיות פיזיולוגיים שלהם הוא להעריך את תפקידם במהלך הידבקות ב לימפוציטים הגירה vivo ו. שתי אסטרטגיות משלימות שימשו למטרה זו: מיקרוסקופיה intravital (IVM) וניסויים ביות. למרות IVM כבר חיוני להגדיר את התרומה המדויקת של הידבקות קולטנים ספציפיים במהלך מפל הידבקות בזמן אמת ברקמות שונות, IVM היא זמן רב ועבודה אינטנסיבית, לעתים קרובות מחייב פיתוח של שיטות ניתוח מתוחכם, הוא צריך בידוד מראש של הומוגנית אוכלוסיות תאים וזה מאפשר ניתוח של איבר אחד בלבד רקמה / בכל זמן נתון. לעומת זאת, ניסויים ביות תחרותי לאפשר השוואה ישירה סימולטני הגירה של שני (או אפילו יותר) תת תא העכבר אותו והם גם היתר ניתוח של רקמות רבות של מספר גבוה של תאים בניסוי זהה. כאן אנו מתארים את פרוטוקול קלאסית ביות תחרותי בשימוש כדי לקבוע את היתרון / חיסרון של סוג תא נתון לבית לרקמות ספציפיות לעומת האוכלוסייה תא שליטה. בחרנו להדגים את מאפייני הנדידה של טרופי בטן לעומת הלא קרביים טרופי בתאי T, כי רירית המעי הוא משטח הגוף הגדול ביותר במגע עם הסביבה החיצונית, והיא גם רקמת הלימפה במיוחד עם מיטב מוגדרים דרישות הנדידה . יתר על כן, העבודה האחרונה קבעה כי הוויטמין חומצה המטבוליט כל טרנס retinoic (ע&quot;ר) הוא המנגנון המולקולרי האחראי העיקרי גרימת בטן ספציפי קולטנים הידבקות (integrin קולטן a4b7and chemokine CCR9) על לימפוציטים. לפיכך, אנו יכולים בקלות ליצור מספר רב של vivo לשעבר מעיים טרופי ולא מעיים טרופי ידי הפעלת לימפוציטים ותאי T בנוכחות או היעדרו של RA, בהתאמה, אשר ניתן להשתמש בהם בסופו של דבר בניסויים ביות תחרותי המתואר כאן.

ניסויים ביות תחרותי לאפשר ישירות להעריך את מאפייני הנדידה של שתי אוכלוסיות תאים שונות עכבר אחת. כאן אנו מדגימים הליך זה על ידי השוואת ההגירה לשעבר טרופי-vivo הבטן שנוצר לעומת אי - טי בטן תאים טרופי.

מבחני ביות תחרותי לחקר נדידת גוט-טרופי T Cell

על מנת למלא את תפקידם, לימפוציטים צריכים לצאת מזרם הדם ולנדוד לרקמות שונות בגוף. היצמדות של לימפוציטים לאנדותל...

המטרה הכללית של הליך זה היא להשוות את יכולות הנדידה הספציפיות לרקמה של שתי או יותר תתי-אוכלוסיות של תאים באותו עכבר מקבל, מה שמאפשר ניתוח של רקמות ותאים רבים בניסוי אחד. כאן אנו מציגים שיטה להשוואת יכולות הנדידה של תאי T בעלי טרופיזם למעי (gut tropic) ותאי T של ביקורת, שנוצרו in vitro, בעכבר מקבל מסוג wildtype. ניתן להשתמש בשיטה זו, למשל, כדי לקבוע את יכולתם של תאי T בעלי טרופיזם למעי לנדוד לקשרי הלימפה המזנטריים של המעי, לקשרי לימפה פריפריאליים ולטחול.בהשוואה לתאי T של ביקורת, ראשית יש להפיק במעבדה (in vitro) תאי T טרופיים למעי ותאי T אפקטוריים של ביקורת. לאחר מכן, יש לסמן את תאי T הניסיוניים ותאי T של הביקורת בצבעים שונים ולערבבם ביחס של אחד לאחד. לאחר מכן, תערובת התאים מוזרקת לעכבר המקבל, למעט כמות קטנה המשמשת לאישור יחס הקלט.לבסוף, העכבר נשחט 18 שעות לאחר ההעברה האדופטיבית, והאיברים הרלוונטיים מנותחים באמצעות ציטומטריית זרימה (flow cytometry) כדי לבחון את נוכחותן של תאי T בעלי טרופיזם למעי ותאי T של בקרה. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון העברה אדופטיבית של אוכלוסיית תאים בודדת, הוא ששילוב של תתי-סוגים שונים מוזרק לאותם עכברים מקבלים, מה שמפחית משמעותית את השונות הקשורה להזרקה תוך-ורידית או לשימוש בעכברים מקבלים שונים. ההשלכות של טכניקה זו חלות על הטיפול במחלות המאופיינות בחדירה מאסיבית של לוקוציטים, כגון מחלה דלקתית של המעיים (IBD).לדוגמה, הדבר מאפשר לנו לקבוע כמה מולקולות נדרשות במהלך נדידה רגילה וכן במהלך נדידת לימפוציטים של aran למעי. יתרה מכך, הליך זה מאפשר לנו להעריך את היעילות של תרופות שנועדו לחסום תנועה של לוקוציטים. קודדו כל באער בלוח של 24 באערים עם 500 µL של PBS המכיל 10 mg/mL של נוגדני anti CD3 ו-anti CD28. דגרו את הלוח למשך שעתיים בטמפרטורה של 37 °C ב-5% CO2 בזמן שהבאערים מצופים.יש להקריב עכבר מסוג wild type ולבצע דיסקציה של הטחול, תוך העברתו למבחנה של 50 מיליליטר עם מדיום. יש לבודד את תאי ה-PLE על ידי הנחת הטחול בין שתי זכוכיות מיקרוסקופ ומעיכתו מעל צלחת פטרי. יש לסספנד מחדש את התאים ב-PBS, להעביר את סספנד התאים באמצעות פיפט למבחנה קונית חדשה של 50 מיליליטר ולסבב בצנטריפוגה למשך חמש דקות.ב-400 Gs בטמפרטורת החדר, הסירו את העל-נתיך ושחררו את תאי הדם האדומים על ידי השעיה של משקע התאים בארבעה מיליליטר של תמיסת lysis buffer למשך שתי עד שלוש דקות. עצרו את הליזיס באמצעות חמישה מיליליטר של PBS, צנטריפוגו שוב את תליית התאים למשך חמש דקות ב-400 Gs בטמפרטורת החדר והשליכו את העל-נתיך. השעיה את המשקע שהתקבל בריכוז של 1×10⁶ תאים למילליטר בתוך קרח.ערבבו מצע Coves modified delcos או IMDM באופן שווה, חלקו את תרחיף התאים שהתקבל בין שתי מבחנות נפרדות, והוסיפו לאחת המבחנות all trans retinoic acid או RA לריכוז סופי של 100 עד 200 nanomolar cubed. הגנו על המבחנה מאור ישיר כדי למנוע פירוק של all trans retinoic acid. הוציאו את פלטת 24 הבארות מהאינקובטור ושטפו כל בארה פעמיים עם 2 milliliters של PBS.הוסיפו 1.5 עד שני מיליליטר של תרחיף התאים המועשר ב-RA למחצית מלוח 24 הבארות. לאחר מכן, הוסיפו את אותה כמות של תאי ביקורת לכל בארה במחצית השנייה של לוח 24 הבארות והחזירו את הלוח לאינקובטור. לאחר יומיים עד שלושה ימים, העבירו את תרחיפי התאים ללוח 24 בארות חדש שאינו מצופה.כדי למנוע גירוי יתר של תאי ה-T, דגרו את התאים למשך יומיים עד שלושה ימים נוספים. אם המצע הופך לצהוב עקב צפיפות התאים ו/או השכפיל, הוסיפו 500 µL של IMDM רענן לכל באר כדי להגיע לנפח סופי של 1 mL לכל באר. כדי לקצור את התאים, אספו את העילאי ביום הרביעי או החמישי, כאשר היום שבו נזרעו התאים נחשב ליום אפס.התנובות הסופיות הטיפוסיות הן 10⁶ עד 2×10⁶ תאי T אפקטורים לבאר. לכן, יש לזרוע לפחות תשעה עד 12 בארות של כל אחד מסוגי תאי ה-T הטרופיים למעי והתאים השליטה, כדי להפיק 10⁷ עד 2×10⁷ תאי T לכל קבוצה. כדי לבדוק את רמות הביטוי של alpha 4, beta 7 ו-CCR9 על גבי.אסוף תאי T מופעלים ונשלטים בכמות של 0.2 עד 0.5 כפול 10⁶ מהתאים הניסיוניים ותאי הבקרה שנקצרו acabado לתוך פרוטות פקס של 4 מיליליטר, וסבב אותן בצנטריפוגה למשך חמש דקות ב-300 Gs בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. השלך את העילוי והשעה מחדש את התאים ב-100 µL של בופר צביעה; דגור עם anti-CD4 FITC, anti-integrin α4β7 PE, anti-CCR9 APC ו-anti-CD8 PerCP למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס בחושך.לאחר הדגירה, שטפו את התאים ב-PBS למשך חמש דקות ב-300 GS בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס, השליכו את העלייה (supernatant) והשעיו שוב את התאים בבופר צביעה ונתחו באמצעות פלוו-ציטומטריה. בתחילת שלב זה, חממו מראש בקבוק של IMDM ובקבוק של PBS לטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר בפרוטוקול הצביעה.לאחר אישור הפנוטיפים של ה-T-cell homing של שתי תרביתי התאים באמצעות ציטומטריה של זרימה כפי שתואר בשלב הקודם, סבבו במערכת צנטריפוגה את אוכלוסיות תאי ה-T שגובסו זה עתה – אלו עם ביטוי גבוה של alpha four, beta seven ו-CCR nine (gut tropic) ואלו עם ביטוי נמוך או שלילי של alpha four, beta seven ו-CCR nine (ביקורת) – במהירות של 300 Gs למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטפו את התאים פעמיים נוספות ב-PBS כדי להסיר את הסרום, ואז התאימו את ריכוז תאי ה-T עבור כל קבוצה ל-10 עד 15 פעמים 10⁶ תאים ל-milliliter. הוסיפו ל-PBS צבעי CFSE או C-M-T-M-R לתאי ה-T מסוג gut tropic או לתאי ה-T של ביקורת.כאן מוסיפים CFSE לאוכלוסיית תאי הביקורת ו-C-M-T-M-R לתאי ה-gut Tropic T בריכוז סופי של five millimolar ו-10 millimolar בהתאמה. ערבבו בעדינות את התאים באמצעות וורטקס למשך חמש שניות והדגרו את המבחנות למשך 20 דקות בטמפרטורה של 37 degrees Celsius במקלחית. לאחר תקופת ההדגרה, עצרו את הצביעה על ידי הוספה של five milliliters של FPS והדגרו למשך דקה אחת עד חמש דקות בטמפרטורת החדר.דללו פי 10 עם PBS חמים וסבבו בצנטריפוגה למשך חמש דקות ב-300 Gs בטמפרטורת החדר. השליכו את supernatant ושטפו פעמיים נוספות עם PBS, ולאחר מכן השביחו את התאים ב-IMDM מלא. באופן אידיאלי, יש לערבב יחד 10 עד 20 פעם עשירית משש התאים של כל אוכלוסיית תאי T בנבובות פאלקס בנפח של ארבעה מיליליטר ביחס של אחד לאחד.כדי לחשב את יחס הקלט המדויק, שמרו 5 עד 10 µL מתליית התאים שהוזרקה לצינורת, הנקראת "קלט" (input), ושמרו אותה בטמפרטורה של 4 °C. סבבו במרכזפוגה את תערובת התאים להזרקה ב-300 ×g למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. השעיו מחדש את התאים להזרקה ב-250 עד 300 µL של PBS חמים. מלאו מזרק אינסולין של 1 CC עם מחט בבג' (gauge) 28 בתאים להזרקה.הזריקו 250 µL מתערובת התאים דרך וריד הזנב. לבסוף, נתחו את תאי הקלט באמצעות פלוו Cytometry כדי לקבל את אחוז התאים החיוביים ל-CFSE ו-C-M-T-M-R שהוזרקו קודם לכן. זה יהיה יחס הקלט שבו ייעשה שימוש.בחישוב הסופי של מדד ה-homing, נתלה את דגימות התאים מהרקמות לצורך ניתוח ה-homing של תאי T בצפיפות שאינה עולה על 3 × 10⁶ תאים למיליליטר. אם נעשה שימוש בעכברים קונגניים כמקלטים בסרטון זה, נעשה שימוש ב-CD 45.1 חיוביים שצבעו עם הסמן הקונגני המתאים בשילוב עם סמן lineage כלשהו; במהלך ניתוח פלואו-ציטומטרי, בצעו gate לתאים על פי הסמן הקונגני הנבחר ולאחר מכן על סמן ה-lineage הספציפי CD8, ונתחו את היחסים בין תאים חיוביים ל-CMTMR ותאים חיוביים ל-CFSE.לאחר מכן, הנתונים מבוטאים כמדד ההומינג (homing index) או hi, המחושב כיחס בין שני הצבעים השונים בכל רקמה מחולק ביחס הקלט המתאים. יחס הקלט הוא היחס בין תאים חיוביים ל-CFSE לבין תאים חיוביים ל-CMTM TMR במזרק לפני ההזרקה, המחושב מתוך מנה (aliquot) של 5 עד 10 µL מתלי suspension התאים שהופרשה ונותחה לצורך זה באמצעות ציטומטריה עם זרימה. אם יחס הקלט קרוב מאוד לאחד, אזי יחסי הרקמה יהיו שקולים ל-hi.אם ה-HI והדם שונים באופן משמעותי מאחד, ניתן לנרמל את ה-HI ברקמות המנותחות על ידי ה-HI בדם, באמצעות חישוב היחס בין ה-HI ברקמות ל-HI בתרחיפי התאים שהופקו מהטחול, מקשרי לימפה פריפריים או PLN, קשרי לימפה מזנטריים או MLN, או מה-Lamin propria של המעי הדק או LP, 18 שעות לאחר ההזרקה. נבדקו עבור ביטוי של C-M-T-M-R ו-CFSE בתאים שסוננו כ-CD eight positive ו-CD 45.1 positive. תאי T חיוביים ל-C-M-T-M-R המבטאים RA activated alpha four, beta seven ו-CCR nine נודדו אל הטחול במספרים שווים לתאי בקרה חיוביים ל-CFSE, אך הראו עלייה ניכרת בנודדות אל המעי ורקמות לימפה מנקזות. חישוב ה-HI עבור כל רקמה אישר עוד כי תאי T בעלי טרופיות למעי ותאי בקרה נודדו באופן שווה אל הטחול, אך בניגוד לכך, תאי T בעלי טרופיות למעי נדדו ביעילות גבוהה פי 10 בקירוב אל ה-LP בהשוואה לתאי T של בקרה, לאחר שליטה בפרוצדורה.ניתן להשתמש בעכברים קונגניים במקום בסימון בצבע כדי להעריך את יכולת הנדידה של סוגי תאים נוספים, כגון תאים דנדריטיים או מקרופאגים. מכיוון שסוגי תאים אלו נוטים לאבד את הצבע לאחר הזרקתם לעכברי הרסיפיאנט, שימוש בבעלי חיים קונגניים מאפשר מעקב טוב יותר אחר התאים ולפרקי זמן ארוכים בהרבה לאחר ההעברה (adoptive transfer).

competitive-homing-assays-to-study-gut-tropic-t-cell-migration

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

T לימפוציטים הגירה מתרחשת במהלך הביות הלימפה לאיברים, יציאה vasculature, וכניסה לתוך רקמות הפריפריה. כאן אנו מתארים פרוטוקול כי ניתן להשתמש כדי לנתח את ההגירה T...

האדם בידוד T לימפוציטים, התרבות ניתוח של הגירה במבחנה</em

סרטון זה מתאר הדמיה של תאי CD8 T חודרי גידול תושבים המסומנים בנוגדנים מצומדים פלואורסצנטית בתוך פרוסות גידולי ריאה אנושיים. טכניקה זו מאפשרת ניתוח בזמן אמת של נדידת תאי CD8 T באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי.

ניתוח בזמן אמת של נדידת תאי T באזורי גידול שונים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי

אנו מציגים vivo לשעבר assay נדידת תאים המאפשר כימות מדויק של פוטנציאל נדידת תאי רכס העצבי enteric בנוכחות של גורמי גדילה שונים.

Assay נדידת תאים כמותיות לMurine אבות עצביים enteric

המנגנונים ששולטים תנועתיות ביניים של תאי T מסוג CD4 מפעיל באתרים של דלקת הם יחסית לא ידועים. אנו מציגים גישה לא פולשנית לדמיין ולטפל בתאים במבחנה -primed CD4 T בדרמיס האוזן הדלקתית, המאפשר חקר את ההתנהגות הדינמית של תאים אלה באתרו.

הדמית תא CD4 T גירת ביניים בדרמיס המוסת

פרוטוקולים עבור הערכה כמותית של לימפוציטים כימוטקסיס והעברה הן כלי חשוב עבור מחקר באימונולוגיה. . הנה, פרוטוקול במבחנה מתואר כי היתרים בזמן אמת, מרובב הערכה של נדידת תאים, כמו גם משלימים ויוו טכניקה המאפשרת מעקב של תאים מקורית על הטחול.

לכימות מונוציט האנושי כימוטקסיס במבחנה , לימפוציט מאתר סחר In Vivo

פרוטוקול שהוצג כאן מאפשרת אפיון ריאות ביות של לימפוציטים אנושיים הראשי תחת תנאים דלקתיים ויוו. יכול להיות עם תמונה, לכמת על-ידי קרינה פלואורסצנטית אור גיליונות מיקרוסקופיה של רקמת הריאה כימית שנוקה ריאתי חדירה של תאים חיסוניים האנושי הועבר adoptively במודל של עכברים של דלקת אלרגית.

הדמיה של לימפוציטים אנושיים יונת ריאות ב ניסיוני במודל Vivo של דלקת אלרגית בהתבסס על מיקרוסקופ אור גיליונות מתקדמות

בפרוטוקול זה, לימפוציטים ממוקמים בחדר העליון של מערכת הגירה גלגול מופרדים מהתא התחתון על ידי קרום נקבובי. כימוקין מתווסף לחדר התחתון, אשר מעורר הגירה פעילה לאורך הדרגתי כימוקין. לאחר 48 h, לימפוציטים נספרים בשני התאים כדי הגירה טרנסטייט.

הערכה של הגירה לימפוציט במערכת הגירה לשעבר של Vivo

כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור בvivo הגדלת הרגולטורים של הבטן הרגולציה האינדוקציה תא T. בפרוטוקול זה, תאים דנדריטים מהונדסים מקומית לייצר ריכוזים גבוהים של ויטמין D הפעיל (1, 25-דיהידרוטסטוסטרון ויטמין D או 1, 25 [הו]2ד) ו ויטמין פעיל (חומצה RETINOIC או RA) דה נובו.

ב Vivo הגדלת האינדוקציה תא T הרגולציה התקינה של הבטן

פרוטוקול זה מספק שיטה של בידוד תאי T ראשוניים ומיקרוסקופ בהילוך מהיר של נדידת תאי T בתנאים סביבתיים ספציפיים עם ניתוח כמותי.

בדיקת הגירה חוץ גופית בזמן אמת עבור תאי T ראשוניים מסוג +CD8

אנו מציגים פרוטוקולים משופרים להתמרה רטרו-ויראלית של קולטני סחר וביות תחרותי כדי לחקור מיקום לימפוציטים ספציפיים לאיברים ומיקרו-סביבה בתיווך קולטנים. שיטה זו מציעה תובנות חשובות לגבי מנגנוני סחר בתאי חיסון ויש לה יישומים פוטנציאליים במחקר בסיסי וטיפולי עתידי.

התמרה רטרו-ויראלית יעילה וביות תחרותי לחקירת לוקליזציה של תאי T בתיווך GPCR במיקרו-סביבות רקמה מגוונות

חקור מבחני ביות תחרותיים לחקר נדידת תאי T גוט-טרופיים בעכברים. השיטה מאפשרת השוואה ישירה של יכולות הנדידה לרקמות שונות ומספקת תובנות חשובות לחקר האימונולוגיה והתאים.

מבחני ביות תחרותי לחקר נדידת גוט-טרופי T Cell

גלה סרטונים נוספים