מבחני ביות תחרותי לחקר נדידת גוט-טרופי T Cell

המטרה הכוללת של הליך זה היא להשוות את יכולות הנדידה הספציפיות לרקמה של שתי תת-קבוצות תאים או יותר באותו מושתל עכבר, מה שמאפשר ניתוח של רקמות ותאים רבים בניסוי אחד. כאן אנו מראים שיטה להשוואת יכולות הנדידה של תאי T טרופיים ובקרה שנוצרו במבחנה בעכבר נמען מסוג בר. ניתן להשתמש בשיטה למשל, כדי לקבוע את יכולתם של תאי T טרופיים במעי לנדוד לבלוטות הלימפה המזנטריות של המעי, בלוטות הלימפה ההיקפיות והטחול.

בהשוואה לתאי T בקרה, יש ליצור תאי T ראשונים של המעי הטרופי ותאי הביקורת במבחנה. לאחר מכן, יש לסמן את תאי ה-T הניסיוניים והמבוקרים בצבעים דיפרנציאליים ולערבב ביחס של אחד לאחד. לאחר מכן מוזרקת תערובת התאים, למעט Eloqua קטן המשמש לאישור יחס הקלט לעכבר המקבל.

לבסוף, העכבר מוקרב 18 שעות לאחר ההעברה לאימוץ והאיברים המעניינים מנותחים לנוכחות תאי T טרופיים במעיים ובקרה על ידי זרימה ציטומטרית. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו העברה מאומצת של אוכלוסיית תאים בודדים הוא ששילוב של תת-סוג שונה מוזרק לאותו עכברים מקבלים, מה שמפחית מאוד את השונות הקשורה להזרקה תוך ורידית או משימוש בעכברים נמענים שונים. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על הטיפול שלנו במחלות הקשורות לחדירת לויקוציטים מסיבית כגון מחלת מעי דלקתית.

לדוגמה, זה מאפשר לנו לקבוע אילו מולקולות רבות דורשות במהלך נדידת לימפוציטים רגילים כמו גם במהלך נדידת לימפוציטים אראן למעי. יתר על כן, הליך זה מאפשר לנו להעריך את יעילותן של תרופות שנועדו לחסום סחר בלויקוציטים בכל באר של צלחת 24 בארות עם 500 מיקרוליטר PBS המכילים 10 מיליגרם למיליליטר, נוגדנים נגד CD 3 ונוגדנים נגד CD 28. דגרו את הצלחת למשך שעתיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו חמצני בזמן ציפוי הבארות.

הקריבו עכבר מסוג פרא ונתחו את הטחול, והניחו אותו בצינור של 50 מיליליטר עם מדיה. בודדו את ציטי ה-PLE על ידי הנחת הטחול בין שתי שקופיות מיקרוסקופ וריסוסו על צלחת פטרי. Resus השהה את התאים ב-PBS, פיפטה את תרחיף התא לצינור חרוטי חדש של 50 מיליליטר וצנטריפוגה למשך חמש דקות.

ב-400 גרם בטמפרטורת החדר, הסר את ה-snat ושחרר את כדוריות הדם האדומות על ידי Resus השעיית כדורית התא בארבעה מיליליטר של מאגר ליזה למשך שתיים-שלוש דקות. עצור את הליזיס עם חמישה מיליליטר של צנטריפוגת PBS את תרחיף התא שוב למשך חמש דקות ב-400 Gs בטמפרטורת החדר והשליך את ה-supernatant resus. השעו את הגלולה המתקבלת באחת פעמים 10 מתוך ששת התאים למיליליטר בקרח שלם.

מפרצונים שינו את מדיום הדלקוס או IMDM באופן שווה, מחלקים את תרחיף התאים המתקבל בין שני צינורות נפרדים, ומשלימים את אחד הצינורות עם כל החומצה הטראנס רטינואית או RA לריכוז סופי של 100 עד 200 ננו-מולרי מעוקב. הגן על הצינור מפני אור ישיר כדי למנוע כל פירוק של חומצה טראנס רטינואית. מוציאים את צלחת 24 הבאר מהחממה ושוטפים כל באר פעמיים עם שני מיליליטר PBS.

הוסף 1.5 עד שני מיליליטר של מתלה התאים בתוספת RA למחצית מצלחת 24 הבארות. לאחר מכן הוסף את אותה כמות של תאי הבקרה לכל באר במחצית השנייה של צלחת 24 הבארות והחזיר את הצלחת לחממה. לאחר יומיים-שלושה, העבירו את מתלי התאים לצלחת חדשה לא מצופה של 24 בארות.

כדי למנוע גירוי יתר של תאי ה-T, דגרו על התאים למשך יומיים-שלושה נוספים. אם המדיה הופכת לצהובה לצפיפות התאים ו/או להתפשטות, הוסף 500 מיקרוליטר IMDM טרי לכל באר כדי להגיע לנפח סופי של מיליליטר אחד לבאר. כדי לקצור את התאים, אספו את הסופרנטנט ביום הרביעי או החמישי, וספרו את היום שבו התאים צופו כיום האפס.

התשואות הסופיות האופייניות הן 1 עד 2 כפול 10 מתוך ששת תאי ה-T האפקטורים לבאר. לכן, יש לצפות לפחות תשע עד 12 בארות של כל אחד מתאי ה-T הטרופיים והמבוקרים במעיים על מנת לייצר 10 עד 20 כפול 10 עד ששת תאי T לקבוצה. כדי לבדוק את הרמות של ביטוי אלפא ארבע, בטא שבע ו-CCR תשע על ra.

תאי T מופעלים ומבוקרים נאספים בין 0.2 ל-0.5 פעמים 10 מתוך השישית של תאי הניסוי והביקורת הטריים שנקטפו לתוך ארבעה צינורות פקס וצנטריפוגה של מיליליטר. הצינורות במשך חמש דקות ב-300 גרם בארבע מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים ב-100 מיקרוליטר של מאגר צביעה עם אנטי CD ארבע FSE ANTIFA ארבע בטא שבע pe, אנטי CCR תשע מחשב ואנטי CD שמונה ל-P למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס בחושך.

לאחר הדגירה, שטפו את התאים עם PBS במשך חמש דקות בטמפרטורה של 300 GS ארבע מעלות צלזיוס, השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים בצביעה. חוצץ שוב ונתח על ידי ציטומטריית זרימה בתחילת שלב זה. מחממים מראש בקבוק IMDM ובקבוק PBS ב-37 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר בפרוטוקול הצביעה.

לאחר אישור הפנוטיפים של תאי T של שתי תרביות התאים על ידי זרימה ציטומטרית כמתואר בצנטריפוגה הקודמת, אלפא ארבע, בטא שבע, CCR 9 גבוה, מעיים טרופי גבוה ואלפא ארבע, בטא שבע, CCR נמוך או שלילי תשע אוכלוסיות תאי T בקרה נמוכות או שליליות ב-300 Gs למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטפו את התאים פעמיים נוספות עם PBS כדי להסיר את הסרום ולאחר מכן התאימו את ריכוז תאי ה-T עבור כל קבוצה ל-10 עד 15 כפול 10 לששת התאים למיליליטר. ב-PBS add, CFSE או C-M-T-M-R מתים לתאי T טרופיים במעי או לתאי T בבקרה.

כאן CFSE מתווסף לאוכלוסיית תאי הביקורת ו-C-M-T-M-R מתווסף למעיים. תאי T טרופיים לריכוז סופי של 5 מילי-מולרי ו-10 מילי-מולר בהתאמה מערבלים בעדינות את התאים למשך חמש שניות ודוגרים על הצינורות למשך 20 דקות ב-37 מעלות צלזיוס באמבט המים לאחר תקופת הדגירה. עצור את הצביעה בתוספת חמישה מיליליטר FPS ודגירה למשך דקה עד חמש דקות בטמפרטורת החדר.

מדללים 10 פעמים עם PBS חם וצנטריפוגה למשך חמש דקות בחום של 300 גרם בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופרנטנט ושטפו פעמיים נוספות עם PBS והשעו מחדש את התאים ב-IMDM מלא. באופן אידיאלי, יש לערבב 10 עד 20 כפול 10 מתוך ששת התאים של כל אוכלוסיית תאי T יחד בארבעה צינורות פקס של מיליליטר ביחס של אחד לאחד.

כדי לחשב את יחס הקלט המדויק, שמור חמישה עד 10 מיקרוליטר מתרחיף התאים המוזרק טובי, הנקרא קלט ושמור אותו על צנטריפוגה של ארבע מעלות צלזיוס את תערובת התאים שתוזרק ב-300 Gs למשך חמש דקות. בטמפרטורת החדר. השעו מחדש את התאים שיוזרקו ב-250 עד 300 מיקרוליטר מעומס ה-PBS החם, מזרק אינסולין CC אחד עם מחט 28 עם התאים להזרקה.

הזרקו 250 מיקרוליטר מתערובת התאים דרך וריד הזנב. לבסוף, נתח את תאי הקלט על ידי זרימה ציטומטרית כדי לקבל את אחוז התאים החיוביים CFSE ו-C-M-T-M-R שהוזרקו בעבר. זה יהיה יחס הקלט בו נעשה שימוש.

בחישוב הסופי של מדד הביות. אנו משעים את דגימות התאים מהרקמות לניתוח ביות תאי T בצפיפות שאינה גבוהה משלוש פעמים 10 מתוך ששת התאים למיליליטר. אם עכברים קונגניים משמשים כנמענים לסרטון זה, נעשה שימוש ב-CD 45.1 חיובי צבוע בסמן הקונגני המתאים בשילוב עם סמן שושלת כלשהו במהלך ניתוח ציטומטרי זרימה שער התאים על הסמן הקונגני שנבחר ולאחר מכן על סמן השושלת הספציפי CD 8, וניתוח היחסים בין תאים חיוביים C-M-T-M-R ו-CFSE.

הנתונים מבוטאים לאחר מכן כמדד הביות או hi, המחושב כיחס בין שני הצבעים השונים בכל רקמה חלקי יחס הקלט המתאים. יחס הקלט הוא היחס בין התאים החיוביים ל-CMTM TMR במזרק לפני ההזרקה המחושב מ-5 עד 10 מיקרוליטר של תרחיף התאים שהונח ונותח על ידי ציטומטריית זרימה למטרה זו. אם יחס הקלט קרוב מאוד לאחד, אז יחסי הרקמות יהיו שווים ל-hi.

אם ה- HI והדם שונים באופן משמעותי מאחד, ניתן לנרמל את ה- HI ברקמות המנותחות על ידי ה- HI בדם על ידי חישוב היחס בין ה- HI ברקמות חלקי ה- HI בתרחיפי התאים הנוצרים מהטחול, בלוטות הלימפה ההיקפיות או בלוטות הלימפה המזנטריות PLN או MLN והמעי הדק Lamin propria או LP 18 שעות לאחר ההזרקה. נותחו לביטוי C-M-T-M-R ו-CFSE על CD מגודר שמונה תאים חיוביים CD 45.1 חיוביים RA הפעילו אלפא ארבע, בטא שבע ו-CCR תשע המבטאים תאי T חיוביים C-M-T-M-R הביתה לטחול במספרים שווים כדי לשלוט בתאים חיוביים ל-CFSE, אך הראו עלייה ניכרת בביות למעי ובאימון רקמות הלימפה בחישוב ה-HI עבור כל רקמה. עוד אישר כי תאי ה-T הטרופיים של המעי ותאי הביקורת התגוררו באופן שווה לטחול, אך בניגוד לכך, תאי ה-T הטרופיים של המעיים נדדו ביעילות גבוהה פי 10 ל-LP בהשוואה לתאי T בקרה לאחר שליטה בהליך.

שימוש בעכברי קונגן במקום פילוס צבע יכול להיעשות על מנת להעריך את יכולת הנדידה של סוגי תאים נוספים כגון תאים דנדריטיים או מיקרופאג'ים. מכיוון שסוגי תאים אלה נוטים לאבד את הצבע לאחר הזרקה לעכברים המקבלים, שימוש בבעלי חיים קונגניים מאפשר מעקב טוב יותר אחר התאים ולפרקי זמן ארוכים בהרבה לאחר אימוץ ההעברה.