Name: האדם בידוד T לימפוציטים, התרבות ניתוח של הגירה במבחנה /em (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-01T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: למדו לבודד ולגדול תאי T לימפוציטים אנושיים ולנתח את נדידתם במבחנה באמצעות חלבוני הדבקה וכימוקינים. שיטה זו מאפשרת חקר מנגנוני נדידה של תאי T ותפקוד מערכת החיסון.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

פרויקט זה מומן על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענקים HL087088 (ח&quot;כ) ו HL18208 (ח&quot;כ).

1. בידוד של האדם לימפוציטים-T <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג דם אדם מתורם בריא. לאפשר לדם להתקרר לטמפרטורת החדר (~ 30 דקות) לפני שתמשיך לשלב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות פיפטה 3 מ"ל של בטמפרטורת החדר צפיפות התקשורת Polymorph הדרגתי לתוך צינור עגול 8 התחתונה מ"ל קלקר. בעדינות להוסיף 3 מ"ל של דם מלא על גבי מדיה Polymorph. חשוב כדי למנוע ערבוב של שני חומרים כימיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הצינורות בבית XG 500 במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות צנטריפוגה, את כדוריות הדם ההיקפיים mononuclear (PBMC) נפרדו עכשיו לתוך שכבת התאים העליונה של מרכיבי דם אחרים. שכבת PBMC מופיע, מלמעלה למטה, כמו הלהקה מעונן הראשון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות את השלב ברור בצבע צהוב העליון של הדם, מעל שכבת PBMC, ולאחר מכן להשתמש micropipette P1000 להעביר את השכבה PBMC כדי 15 מ"ל או 50 מ"ל צינור חרוטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את PBMC פעמיים עם PBS, centrifuging תאים ב XG 500 במשך 5 דקות בכל פעם. Supernatant יהיה מעונן קצת אחרי כל שטיפה. </li></ol> 2. התרבות של האדם לימפוציטים-T <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה, העברת PBMC כדי בבקבוק T-75 תרבות 20 מ"ל RPMI 1640 מדיה המכילה 10% FBS, 1% פניצילין / סטרפטומיצין, ו 1 מיקרוגרם / מ"ל ​​phytohemagglutinin (PHA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 ° C ו 5% CO 2 לפחות 1 שעה, עד 24 שעות. שלב זה מאפשר מונוציטים, אשר יהיה חסיד אל פני השטח את הבקבוק, להיות מופרדים מן לימפוציטים כי לרחף. אם הדגירה קצר (1 שעה) משמש בשלב זה, מקובל להשתמש RPMI 1640 מדיה המכילה 10% FBS ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין בלי להשלים עם PHA כפי שצוין בשלב 2.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להסיר את כל התקשורת מהבקבוק, להוסיף אותו צינור חרוטי 50 מ"ל, ו צנטריפוגות ב XG 500 במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התא גלולה, אשר כעת כוללת בעיקר לימפוציטים, ולהעביר את התאים בבקבוק T-75 חדש המכיל 25 מ"ל RPMI 1640 מדיה המכילה 10% FBS, 1% פניצילין / סטרפטומיצין, ו 1 מיקרוגרם / מ"ל ​​PHA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 3 ימים (2 ימים אם הדגירה הראשונית של PBMC היה לילה). לאחר 24 שעות של צמיחה, ייתכן שיהיה צורך להוסיף 15-20 מ"ל של התקשורת טריים להעביר T-175 גדול יותר בקבוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 3 ימים, להשתמש פיפטה להסיר את המדיה לימפוציטים מושעה מהבקבוק ומעבירים צינור חרוטי 50 מ"ל. צנטריפוגה ב XG 500 במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התא גלולה ותאי להעביר בקבוק T-75 או T-175 חדש המכיל 25 מ"ל (T-75) או 50 מ"ל (T-175) RPMI 1640 עם 10% FBS, 1% פניצילין / סטרפטומיצין, ו 20 ng / mL האדם IL-2 או IL-15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל לימפוציטים ימים 4-7. אם מתחילים עם בקבוק T-75, התרבות יהיה צורך להרחיב והועברו בקבוק T-175 לאחר 1-2 ימים. </li></ol> 3. Assay הגירה לימפוציטים חוץ גופית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 יום לפני assay ההגירה, מעיל זכוכית התחתונה 0.17 מ"מ עם צלחת חלבון מיקרוגרם / מ"ל ​​או 20 G ב PBS לילה בשעה 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את המנה נרחב עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשתק ICAM-1/Fc האנושי (10 מיקרוגרם / מ"ל) אדם SDF-1 (2 מיקרוגרם / מ"ל) על ידי הוספת חומרים כימיים אלו בתמיסה PBS לצלחת ואת דוגרים 4 שעות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן לימפוציטים מסוג T על ידי הראשון בקביעת צפיפות התאים בתרבית בתוך בקבוק T-175 באמצעות hemacytometer. כ 2-5 x 10 5 תאים יש להשתמש לכל מנה להשיג צפיפות התאים המתאימים לניתוח הגירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף לימפוציטים מסוג T פעמיים עם PBS ו resuspend אז 1 מ"ל L-15 מדיה המכילה 1 מ"ג / מ"ל ​​D-גלוקוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את צלחת מצופה ICAM-1/Fc ו - SDF-1 נרחב עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת לימפוציטים מסוג T ב 1 מ"ל התקשורת על צלחת ולשמור אותם על 37 ° C. </li></ol> 4. לכידת תמונה ברצף באמצעות תוכנות ש"ח Elements <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח תוכנה ש"ח אלמנטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתפריט הגדרות המצלמה, בחר "binning 2x2" כמצב הדמיה שניהם חיים לכידת תמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור אל התפריט Applications ובחר הגדר / הפעלה ניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את משך הזמן בין התמונות את האורך הכולל של רצף לכידת תמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על כפתור "הפעל" כדי להתחיל רכישת התמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים ניתן לעקוב ופרמטרים הגירה (מהירות, אורך הדרך, עקירה, וכו ') לכמת באמצעות אחד כמה חבילות תוכנה, כולל ImageJ, AutoQuant או Volocity (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ליצור "מגרש קורי העכביש", xy את הקואורדינטות של כל תא timepoint נאספים (איור 2) ו מוקרנת על גרף עם נקודת מוצא משותפת עבור כל תא על המקור (איור 3). </li></ol> 5. נציג תוצאות ביום 6 של התרבות בנוכחות או IL-2 או IL-15, לימפוציטים מסוג T.לפצות&gt; 98% של תאים, כפי שנקבע על ידי מכתים CD3 חיובי כמו גם CD4 חיובי ו / או CD8 מכתים. עבור IL-2, מצאנו 83 תאים מסוג CD4 +%, 15% ו - CD8 + &lt;1% CD4 + CD8 + תאים. עבור IL-15, מצאנו 88 תאים מסוג CD4 +%, 11% ו - CD8 + &lt;1% CD4 + CD8 + תאים. במהלך הנדידה T לימפוציטים על ICAM-1/SDF-1 מצעים, תאים הציג מהירות של כ 15 מיקרומטר / min שיכולים להתקיים לאורך תקופת זמן 1 שעה. הגירה T לימפוציטים על ICAM-1/SDF-1 תלויה הידבקות LFA-1-בתיווך, כמו אנטי LFA-1 ליגנד חוסמות הנוגדן מעכב הגירה קשות. <img src="/files/ftp_upload/2017/2017fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. מעקב סלולרי של העברת לימפוציטים מסוג T. לימפוציטים מסוג T מבודדים מהדם כולו בתרבית בנוכחות של IL-2 או IL-15 עבור 6 ימים הורשו לדבוק ולהעביר על קרקעית הזכוכית מאכלים מצופה 10 מיקרוגרם / מ"ל ICAM-1 ו 2 מיקרוגרם / מ"ל ​​SDF-1. תמונות נרכשו כל 10 שניות במשך 30 דקות. תאים זוהו כל תמונה מסומנים לאורך זמן באמצעות תוכנת Volocity. סרט זה מציג את ההגירה אקראי של לימפוציטים מסוג T במהירות של ~ 15 מיקרומטר / min. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2017/2017_Kim_Movie1.mov">לחץ כאן כדי לראות את הוידאו.</a> 1. סרט Cell מעקב של העברת לימפוציטים מסוג T. לימפוציטים מסוג T מבודדים מהדם כולו בתרבית בנוכחות של IL-2 או IL-15 עבור 6 ימים הורשו לדבוק ולהעביר על תחתית צלחות זכוכית מצופה 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​ICAM-1 ו 2 מיקרוגרם / מ"ל ​​SDF-1 . תמונות נרכשו כל 10 שניות במשך 30 דקות. תאים זוהו כל תמונה מסומנים לאורך זמן באמצעות תוכנת Volocity. סרט זה מציג את ההגירה אקראי של לימפוציטים מסוג T במהירות של ~ 15 מיקרומטר / min. <img src="/files/ftp_upload/2017/2017fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. בעמדה תא Spatiotemporal. קואורדינטות XY של כל תא התקבלו עבור כל נקודת זמן באמצעות תוכנת Volocity. <img src="/files/ftp_upload/2017/2017fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. "מזימה קורי עכביש". שימוש XYt קואורדינטות עבור כל תא, 15 תאים נבחרו באקראי זממו עם נקודת מוצא משותפת על המקור. השוואת באינטרנט חלקות עכביש נותן תיאור חזותי מהירה של ההבדלים הגירה בין תנאי הניסוי השונים. מגרשים הגירה T לימפוציטים בתנאים שליטה (פאנל משמאל) בנוכחות נוגדן ליגנד לחסימת אנטי LFA-1 (פאנל מימין).

<ol><li>Hyun, Y. M., Chung, H. L., McGrath, J. L., Waugh, R. E., Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+integrin+VLA-4+localizes+to+the+lamellipodia+and+mediates+t+cell+migration+on+VCAM-1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Activated integrin VLA-4 localizes to the lamellipodia and mediates t cell migration on VCAM-1.</a> J Immunol. 183, 359-369 (2009).</li>
<li>Morin, N. A., Oakes, P. W., Hyun, Y. M., Lee, D., Chin, Y. E., King, M. R., Springer, T. A., Shimaoka, M., Tang, J. X., Reichner, J. S., Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonmuscle+myosin+heavy+chain+IIA+mediates+integrin+LFA-1+de-adhesion+during+T+lymphocyte+migration%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Nonmuscle myosin heavy chain IIA mediates integrin LFA-1 de-adhesion during T lymphocyte migration.</a> The Journal of experimental medicine. 205, 195-205 (2008).</li>
<li>Hyun, Y. M., Lefort, C. T., Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+integrins+and+their+ligand+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Immunologic+research%22%5BJournal%5D)">Leukocyte integrins and their ligand interactions.</a> Immunologic research. , (2009).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

בניסוי זה, אנו מספקים פרטים על מערכת פשוטה לנתח את תנועתיות העיקרי של לימפוציטים מסוג T אנושיים. ב מבחני חוץ גופית הגירה שימשו לנתח את התפקידים של מולקולות רבות במעברי האותות המעורבים תנועה של תאים מסוגים שונים. חלק שולטת קריטי לזכור בעת תכנון הניסוי שלכם מתוך פרוטוקול שלנו כוללים: 1) ללא דבק או לא integrin ציפויים המצע דבק, כגון אלבומין בסרום שור (BSA) או פולי-L ליזין (PLL), בהתאמה, 2 ) integrin ספציפיים חסימת טיפול נוגדן כדי לקבוע סגוליות integrin, ו 3) שיתוף צ...

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>GIBCO, מבית Life Technologies</td><td>11875</td><td></td></tr><tr><td>סרום עגל עוברי (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH300070.03</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>GIBCO, מבית Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>פולימורפים בצעד אחד</td><td>כימיה מדויקת &amp;amp; Scientific Corporation</td><td>AN221725</td><td></td></tr><tr><td>PHA</td><td>Remel, Thermo Fisher Scientific</td><td>R30852801</td><td></td></tr><tr><td>IL-2 אנושי רקומביננטי</td><td>R&amp;R&D Systems</td><td>202-IL</td><td></td></tr><tr><td>IL-15 אנושי רקומביננטי</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>247-IL</td><td></td></tr><tr><td>חלבון G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>19459</td><td></td></tr><tr><td>ICAM-1/Fc אנושי רקומביננטי</td><td>R&amp;R&D Systems</td><td>720-IC</td><td></td></tr><tr><td>SDF-1 אנושי רקומביננטי</td><td>R&amp;R&D Systems</td><td>350-NS</td><td></td></tr></tbody></table>

האדם בידוד t לימפוציטים, התרבות ניתוח של הגירה במבחנה</em

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

ההגירה של לימפוציטים מסוג T מערבת את האינטראקציה של דבק integrins פני התא עם ligands הביע על תאים אחרים או עם חלבונים תאי מטריקס. הפעלת spatiotemporal המדויק של integrins ממצב נמוך זיקה למדינה זיקה גבוהה בקצה התא מוביל חשוב T לימפוציטים הגירה<sup&gt; 1</sup&gt;. כמו כן, הכחשה של קצה תא נגרר, או uropod, הוא צעד הכרחי בשמירה על תנועתיות מתמשך integrin תלויי T לימפוציטים<sup&gt; 2</sup&gt;. גישות טיפוליות רבות integrins מחלות אוטואימוניות דלקתיות או יעד כאמצעי לעכב את גיוס הגירה מופרזת של לויקוציטים<sup&gt; 3</sup&gt;. כדי לחקור את האירועים המולקולריים המווסתים את נדידת האדם T לימפוציטים, יש לנו מנוצל<em&gt; במבחנה</em&gt; מערכת לנתח נדידת תאים על מצע דו מימדי המחקה את הסביבה כי לימפוציטים T מפגשים במהלך גיוס של כלי הדם. לימפוציטים מסוג T הם בודד לראשונה מתורמים האדם הם מגורה אז בתרבית במשך שבעה עד עשרה ימים. במהלך assay, לימפוציטים מסוג T מותר לדבוק ולהעביר על מצע מצופה מולקולה-1 הידבקות אינטר (ICAM-1), ליגנד עבור integrin LFA-1, הגורם-1 סטרומה תא הנגזרות (SDF-1). הנתונים שלנו מראים כי לימפוציטים מסוג T התערוכה מהירות הנדידה של ~ 15 מיקרומטר / min. T לימפוציטים הגירה יכולה להיות מעוכבים על ידי המצור integrin<sup&gt; 1</sup&gt; או מעכבי של המנגנון המווסת actomyosin הסלולר נדידת תאים<sup&gt; 2</sup&gt;.

T לימפוציטים הגירה מתרחשת במהלך הביות הלימפה לאיברים, יציאה vasculature, וכניסה לתוך רקמות הפריפריה. כאן אנו מתארים פרוטוקול כי ניתן להשתמש כדי לנתח את ההגירה T לימפוציטים<em&gt; במבחנה</em&gt;.

האדם בידוד T לימפוציטים, התרבות ניתוח של הגירה במבחנה</em

נדירתם של לימפוציטים T כוללת אינטראקציית הידבקות של אינטגרינים על פני השטח של התא עם ליגנדים המבטאים על תאים אחרים או עם מרכיבים חוץ-תאיים...

נדידה של לימפוציטים מסוג T מתרחשת במהלך הגירה לאיברים לימפואידיים, יציאה מכלי הדם וכניסה לרקמות פריפריאליות. תהליך זה כולל אינטראקציה דביקה של פני השטח של תאי ה-T עם תאים אחרים. כדי לבחון תופעה זו in vitro, מבודדים לימפוציטים מסוג T אנושיים, מגדלים אותם ומניחים אותם על פלטות לתרבית רקמה המצופות בחלבון דביק.ICAM one וכימוקין SDF one. לאחר מכן ניתן להשיג ולנתח תמונות של נדידת תאי T lymphocyte. שלום, אני קרייג להפורט מהמעבדה של מינסו קים במרכז לביולוגיה ואימונולוגיה של חיסונים באוניברסיטת רוצ'סטר.היום נדגים לכם פרוצדורה לבידוד ובישול של לימפוציטים T אנושיים, ואת ניתוח נדידתם in vitro. אנו משתמשים במבחן זה במעבדה שלנו כדי לחקור את תפקידם של האינטגרינים ואת נדידת תאי T. האינטגרין העיקרי בתאי T הוא lymphocyte function associated antigen one או LFA one.הליגנדים הספציפיים עבור LFA one הם ה-icas, כגון ICAM one. בנוסף, נדרש אות קין (kin signal) עבור נדידת תאי T כדי לספק הן אות כיווניות והן כדי להפעיל אינטגרינים. במערך הבדיקה שלנו, אנו משתמשים ב-ICAM one אנושי וב-CX CL 12 או SDF one כתשתיות לנדידת תאי T.אם כן, בואו נתחיל. לאחר קבלת דם אנושי מתורם בריא, יש להמתין עד שהדם יתקרר לטמפרטורת החדר. תהליך זה אורך כ-30 דקות.לאחר קירור הדם, העבירו בזהירות באמצעות פיפט שלושה מיליליטרים של מצע גרדיאנט צפיפות פולימורפי בטמפרטורת החדר לתוך מבחנה פוליסטירן בעלת תחתית עגולה בנפח שמונה מיליליטרים. לאחר מכן, הוסיפו בזהירות שלושה מיליליטרים של דם מלא מעל המצע. חשוב להימנע מכל ערבוב של השכבות.הניחו את המבחנות בצנטריפוגה וסובבו אותן ב-500 G למשך 45 דקות. לאחר הצנטריפוגה, בטמפרטורת החדר, תבודדו התאים המונונוקליאריים של דם פריפריאלי (PBMCs) מרכיבי הדם האחרים. שכבת ה-PBMC מופיעה כפס העכור הראשון מהחלק העליון.בתנאי סטריליות, הסיר בזהירות והשלך את השכבה העליונה השקופה בצבע צהוב. לאחר מכן, השתמש במיקרופיפקה P 1000 כדי להעביר את שכבת ה-PBMC למבחנה קונית חדשה. שטוף את ה-PBMC פעמיים עם PBS על ידי סבב של התאים בצנטריפוגה ב-500 G למשך חמש דקות.בכל פעם, הנוזל העליון (supernatant) יהיה עכור במידה רבה לאחר כל שטיפה. השעו שוב את התאים ב-20 milliliters של מצע RPMI 1640 המכיל 10%FBS, 1%penicillin streptomycin, ואחד microgram per milliliter של Phyto hemagglutinin או PHA. דגירה בנוכחות PHA משרה הפעלה והתרחבות של לימפוציטים מסוג T.העבר את ה-pbmc לבקבוק תרבית T 75 באמצעות פיפטה. לאחר מכן, דגור בטמפרטורה של 37 degrees Celsius וב-5% carbon dioxide למשך 1 עד 24 שעות. שלב זה מאפשר הפרדה של מונוציטים, אשר ייצמדו למשטח הבקבוק, מהלימפוציטים שנותרו בסספנסיה.בעקבות הדגירה, הסירו בזהירות את כל המצע המכיל בעיקר לימפוציטים והעבירו אותו למבחנה קונית של 15 מיליליטר. סבבו במסננת (צנטריפוגה) ב-500 G למשך חמש דקות. השעיו את משקע התאים ב-RPMI 1640 והעבירו את התאים לבקבוק T 75 חדש המכיל 25 מיליליטר של RPMI 1640 עם FBS, פניצילין, סטרפטומייצין ו-PHA, והדגירו ב-37 degrees Celsius.לאחר 24 שעות של גידול, ייתכן שיהיה צורך להוסיף 15 עד 20 milliliters של מצע טרי ולהעביר לבקבוק T 1 75 גדול יותר. המשיכו בדגירה למשך שלושה או שניים ימים. אם הדגירה הראשונית של PBMC הייתה למשך הלילה ולאחר שלושה ימים, השתמשו בפיפט להוצאת המצע, שיכיל לימפוציטים תלויים, והעבירו אותו לפרוקת צנטריפוגה של 50 milliliter, צנטריפוגה במהירות של 500 G למשך חמש דקות.ריס אספה את משקע התאים והעבירה אותם לבקבוק T 75 חדש המכיל 25 milliliters של RPMI 1640 עם FBS, פניצילין, סטיפტომיצין ו-human IL 2 או IL 15, ולאחר מכן הניחה את התאים באינקובטור. אם מתחילים עם בקבוק T 75, יהיה צורך להרחיב את התרבית ולהעבירה לבקבוק T 175.לאחר יום עד יומיים, גדלו את הלימפוציטים למשך ארבעה עד שבעה ימים בסך הכל. יום אחד לפני בדיגת הנדידה, צפו את תחתית צלחת זכוכית בעובי 0.17 מילימטר ב-20 micrograms per milliliter של חלבון A או G ב-PBS, והדגרו למשך לילה בטמפרטורה של 4°C. למחרת, שטפו את הצלחת היטב ב-PBS, ולאחר מכן הוסיפו לצלחת תמיסת ICAM one FC ו-human SDF1 ב-PBS.דגרו במשך ארבע שעות בטמפרטורת החדר כדי לקבע את המולקולות. קבעו את צפיפות התאים התרביתיים באמצעות המוציטומטר. לאחר מכן, שטפו את הלימפוציטים פעמיים ב-PBS והשביו אותם למחיליל של מיליליטר אחד של תווך L 15 המכיל D glucose. לאחר הדגירה, שטפו היטב את הצלחת המצופה ב-ICAM one FC וב-SDF one באמצעות PBS. העבירו את תאי ה-T lymphocytes במיליליטר אחד של תווך אל הצלחת; יש להשתמש בכ-2 עד 5 פעמים 10⁵ תאים לצלחת כדי להגיע לצפיפות תאים המתאימה לניתוח נדידה.כדי לקבל תמונות של נדידת תאים, הניחו את הצלחת על במת המיקרוסקופ בסביבה עם בקרת טמפרטורה, כגון תא מחומם ב-37 °C. פתחו את תוכנת NIS elements בתפריט הגדרות התמונה. בחרו ב-two by two binning כמצב עבור דימות חי (live imaging) ועבור לכידת תמונות.עברו לתפריט היישומים ובחרו ב-define, run, experiment. בחרו את פרק הזמן בין התמונות ואת הזמן הכולל. עבור רצף לכידת התמונות, לחצו על כפתור ה-run כדי להתחיל ברכישת התמונות בעקבות הרכישה.ניתן לכמת פרמטרי נדידה כגון מהירות, אורך מסלול והעתקה באמצעות חבילת תוכנה כגון Image J Auto Quant או veloc. כדי להפיק גרף רשת עכביש (spider web plot), אספו את קואורדינ efekטות ה-XY עבור כל תא ונקודת זמן, והשליכו אותם על גרף עם נקודת התחלה משותפת לכל תא בראשית הצירים. תאי ה-T לומפocytes המוצגים כאן גודלו על ICAM ו-SDF one, וצולמו מדי 10 שניות למשך 30 דקות.סרט זה מציג נדידה אקראית של T lymphocytes במהירות של כ-15 microns per minute באמצעות קואורדינטות XYT עבור כל תא. 15 תאים נבחרו באופן אקראי ושורטטו עם נקודת התחלה משותפת בראשית הצירים. השוואת גרפי קורי עכביש (spiderweb plots) מספקת תיאור חזותי מהיר של הבדלים בנידידה בין תנאים ניסיוניים שונים.גרפים של נדידת תאי T תחת תנאי בקרה מוצגים משמאל, בעוד שגרפים של נדידת תאי T בנוכחות נוגדן חוסם לליגנד anti LFA one מוצגים מימין. נתונים אלו מדגימים כי תאי T משתמשים באינטגרין LFA one כדי לנדוד על תשת ICAM one. הרגע הצגנו לכם כיצד לבצע בדיקת נדידה באמצעות תאי T אנושיים שהוצאו מתרבית במהלך הפרוצדורה.חשוב לזכור להוסיף מספר מתאים של תאים לצלחת המצופה ב-ICAM 1, כדי שמעקב התאים וניתוח הנדידה יהיו פשוטים יותר. זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.

human-t-lymphocyte-isolation-culture-analysis-migration

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

ניסויים ביות תחרותי לאפשר ישירות להעריך את מאפייני הנדידה של שתי אוכלוסיות תאים שונות עכבר אחת. כאן אנו מדגימים הליך זה על ידי השוואת ההגירה לשעבר טרופי-vivo הבטן שנוצר לעומת אי - טי בטן תאים טרופי.

מבחני ביות תחרותי לחקר נדידת גוט-טרופי T Cell

סרטון זה מדגים חקירה ניסויית של גלגול לימפוציטים על פני מודל אנדותל מחסום דם-מוח (BBB). חד-שכבה של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח האנושי (HBMECs) נוצרת במבחנה, ותאים חד-גרעיניים בדם היקפי (PBMCs) המכילים לימפוציטים מתווספים לשכבה החד-שכבתית. לאחר מכן התאים מודגרים כדי לאפשר גלגול לימפוציטים, והתאים הנודדים מכומתים באמצעות ציטומטריית זרימה.

חקר גלגול לימפוציטים על פני חד-שכבת תא אנדותל מיקרו-וסקולרי

אנו מתארים פרוטוקול לבידוד יעיל של תאי T תושבי עור מביופסיות עור אנושיות. פרוטוקול זה מניב מספר מספיק של לימפוציטים תושבי עור אנושי ברי קיימא לניתוח זרימה ציטומטרית ותרבית ex vivo.

בידוד לימפוציטים מעור אדם עבור ניתוח פנוטיפי<em&gt; Ex Vivo</em&gt; תרבית תאים

המטרה של פרוטוקול זה היא לבודד תאי האנדותל הלימפה בדופן כלי אנושיים מום הלימפה כמו ציסטה-ועורלות באמצעות תא הקרינה המופעל מיון (FACS). culturing התא הבא והתרחבות של תאים אלה מאפשרים רמה חדשה של תחכום ניסיוני למחקרים גנטיים, proteomic, פונקציונליים והתמיינות תאים.

בידוד של תאי האנדותל אדם הלימפה על ידי מיון תא הקרינה המופעל Multi-פרמטר

תאי T נאיביים CD4+ מקוטבים לתת-קבוצות שונות בהתאם לסביבה בזמן ההפעלה.  ניתן להשיג את ההתמיינות של תאי CD4+ T נאיביים לתת-קבוצות אפקטורים שונות במבחנה באמצעות הוספת גירויים של קולטני תאי T ואותות ציטוקינים ספציפיים.

העכבר נאיבי CD4<sup&gt; +</supו&gt; בידוד תא T<em&gt; במבחנה</em&gt; בידול לתוך תת תא T

לימפוציטים הם השחקנים העיקריים בתגובות חיסוניות נרכשות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול טיהור לימפוציטים כדי לקבוע את הפונקציות הפיזיולוגיות של המולקולות הרצויות בהפעלת לימפוציטים במבחנה וב-vivo. הליכי הניסוי המתוארים מתאימים להשוואת יכולות תפקודיות בין לימפוציטים בקרה ללימפוציטים מהונדסים גנטית.

בידוד ההפעלה של Murine לימפוציטים

כאן, אנו מתארים מודל מחסום דם-מוח אנושי המאפשר לחקור גלגול לימפוציטים למערכת העצבים המרכזית במבחנה.

ניתוח של לימפוציטים extravasation שימוש<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של מחסום אנושי דם-מוח

פרוטוקולים עבור הערכה כמותית של לימפוציטים כימוטקסיס והעברה הן כלי חשוב עבור מחקר באימונולוגיה. . הנה, פרוטוקול במבחנה מתואר כי היתרים בזמן אמת, מרובב הערכה של נדידת תאים, כמו גם משלימים ויוו טכניקה המאפשרת מעקב של תאים מקורית על הטחול.

לכימות מונוציט האנושי כימוטקסיס במבחנה , לימפוציט מאתר סחר In Vivo

מאמר זה מתאר את השיטה הרומן לייצר אנטיגן הגידול-ספציפי המושרה ביותר תאים גזע מהגרים הרתי (iTE) על ידי תלת מימדי (3D) מערכת התרבות הרתי. iTE הינם תת-קבוצה הומוגנית של תאי T הקשורים היטב לתאי T תמימים עם יכולת התפשטות, היווצרות הזיכרון ודיכוי הגידול.

תלת מימדי הרתי תרבות מערכת לייצר Murine המושרה תא גזע Pluripotent-הגידול הנגזר אנטיגן-מהגרים ספציפיים הרתי

בפרוטוקול זה, לימפוציטים ממוקמים בחדר העליון של מערכת הגירה גלגול מופרדים מהתא התחתון על ידי קרום נקבובי. כימוקין מתווסף לחדר התחתון, אשר מעורר הגירה פעילה לאורך הדרגתי כימוקין. לאחר 48 h, לימפוציטים נספרים בשני התאים כדי הגירה טרנסטייט.

הערכה של הגירה לימפוציט במערכת הגירה לשעבר של Vivo

פרוטוקול זה מספק שיטה של בידוד תאי T ראשוניים ומיקרוסקופ בהילוך מהיר של נדידת תאי T בתנאים סביבתיים ספציפיים עם ניתוח כמותי.

בדיקת הגירה חוץ גופית בזמן אמת עבור תאי T ראשוניים מסוג +CD8

למדו לבודד ולגדול תאי T לימפוציטים אנושיים ולנתח את נדידתם במבחנה באמצעות חלבוני הדבקה וכימוקינים. שיטה זו מאפשרת חקר מנגנוני נדידה של תאי T ותפקוד מערכת החיסון.

האדם בידוד T לימפוציטים, התרבות ניתוח של הגירה במבחנה

גלה סרטונים נוספים