JoVE Journal
Immunology and Infection

A subscription to JoVE is required to view this content.  Sign in or start your free trial.

JoVE Journal Immunology and Infection

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

האדם בידוד T לימפוציטים, התרבות ניתוח של הגירה במבחנה

Full Text

46,761 Views

08:39 min

June 1, 2010

DOI: 10.3791/2017-v

Craig T. Lefort¹, Minsoo Kim¹

¹Center for Vaccine Biology and Immunology,University of Rochester

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Summary

T לימפוציטים הגירה מתרחשת במהלך הביות הלימפה לאיברים, יציאה vasculature, וכניסה לתוך רקמות הפריפריה. כאן אנו מתארים פרוטוקול כי ניתן להשתמש כדי לנתח את ההגירה T לימפוציטים

Transcript

נדידת לימפוציטים מסוג T מתרחשת במהלך ביות לאיברי לימפה, יציאה מכלי הדם וכניסה לרקמות היקפיות. תהליך זה כולל אינטראקציה דביקה של פני השטח של תאי T עם תאים אחרים. כדי לבחון תופעה זו במבחנה, לימפוציטים אנושיים מבודדים, מתורבתים ומונחים על צלחות תרבית רקמה המצופות בחלבון הדבק.

ICAM אחד וכימוקין SDF אחד. לאחר מכן ניתן לרכוש ולנתח תמונות של נדידת לימפוציטים מסוג T. היי, אני קרייג לפורט והמעבדה של מינסו קים במרכז לביולוגיה ואימונולוגיה של חיסונים באוניברסיטת רוצ'סטר.

היום נראה לכם נוהל לבידוד ותרבית של לימפוציטים בני נוער אנושיים, ניתוח של נדידתם במבחנה. אנו משתמשים בבדיקה זו במעבדה שלנו כדי לחקור את תפקידם של אינטגרינים ונדידת תאי T. האינטגרין העיקרי בתאי T הוא אנטיגן אחד הקשור לתפקוד הלימפוציטים או LFA אחד.

הליגנדים הספציפיים ל-LFA הם ה-icas, כגון ICAM אחד. בנוסף, נדרש אות kin לנדידת תאי T כדי לספק גם אות כיווניות וגם להפעיל אינטגרינים. בבדיקה שלנו, אנו משתמשים ב-ICAM אנושי אחד וב-CX CL 12 או SDF אחד כמצעים לנדידת תאי T.

אז בואו נתחיל. לאחר השגת דם אנושי מתורם בריא, הניחו לדם להתקרר לטמפרטורת החדר. הנסיעה אורכת כ-30 דקות.

לאחר קירור הדם, פיפטה בעדינות שלושה מיליליטר של טמפרטורת החדר, מדיה שיפוע צפיפות פולימורפית לתוך צינור פוליסטירן תחתון עגול של שמונה מיליליטר. ואז להוסיף בעדינות שלושה מיליליטר דם מלא מעל. חשוב להימנע מכל ערבוב.

מניחים את הצינורות בצנטריפוגה וסובבים אותה 500 גרם למשך 45 דקות. בטמפרטורת החדר לאחר הצנטריפוגה, התאים החד-גרעיניים של הדם ההיקפי או P BMCs הופרדו משאר מרכיבי הדם. שכבת PBMC מופיעה כרצועה המעוננת הראשונה מלמעלה.

בתנאים סטריליים, הסר בזהירות והשליך את השלב העליון בצבע צהוב שקוף. לאחר מכן השתמש במיקרו פיפטה P 1000 כדי להעביר את שכבת ה-PBMC לצינור חרוטי חדש. שטפו את ה- PBMC פעמיים עם תאי צנטריפוגה PBS בחום של 500 גרם למשך חמש דקות.

בכל פעם הסופרנטנט יהיה מעט מעונן לאחר כל שטיפה. השהה מחדש את התאים ב-20 מיליליטר של מדיה RPMI 1640 המכילה 10% FBS, 1% סטרפטומיצין פניצילין ומיקרוגרם אחד למיליליטר. דגירה של פיטו המגלוטינין או PHA בנוכחות PHA גורמת להפעלה והתרחבות של לימפוציטים מסוג T.

בעזרת פיפטה העבירו את ה-pbmc לבקבוק תרבית T 75. לאחר מכן דגרה 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך שעה עד 24 שעות. שלב זה מאפשר להפריד מונוציטים, שייצמדו למשטח הבקבוק מהלימפוציטים שנותרו בתרחיף.

לאחר הדגירה יש להסיר בזהירות את כל החומר המכיל בעיקר לימפוציטים ולהעביר אותו לצינור חרוטי של 15 מיליליטר. צנטריפוגה בחום של 500 גרם למשך חמש דקות. ריס היה כדור התא ב-RPMI 1640 והעביר את התאים ל-T 75 flaz חדש המכיל 25 מיליליטר של RPMI 1640 עם FBS, פניצילין, סטרפטומיצין ו-PHA מודגרים ב-37 מעלות צלזיוס.

לאחר 24 שעות של צמיחה, ייתכן שיהיה צורך להוסיף 15 עד 20 מיליליטר של מדיה טרייה ולהעביר לבקבוק T 1 75 גדול יותר. המשיכו לדגור במשך שלושה ימים או יומיים. אם הדגירה הראשונית של PBMC הייתה לילה לאחר שלושה ימים, השתמש בפיפטה כדי להסיר את המדיום, שיכיל לימפוציטים תלויים ולהעביר אותו לצנטריפוגה של צינור חרוטי של 50 מיליליטר ב-500 גרם למשך חמש דקות.

ריס היה כדור התא והעביר את התאים ל-T 75 חדש המכיל 25 מיליליטר של RPMI 1640. עם FBS, פניצילין, סטרפטומיצין ו-IL 2 או IL 15 אנושי מכניסים את התאים לאינקובטור. אם מתחילים בקבוק T 75, יהיה צורך להרחיב את התרבות ולהעביר אותה לבקבוק T 1 75.

לאחר יום עד יומיים גדלים לימפוציטים בסך הכל ארבעה עד שבעה ימים. יום אחד לפני בדיקת הנדידה, צפו צלחת זכוכית תחתית של 0.17 מילימטר ב-20 מיקרוגרם למיליליטר של חלבון A או G ב-PBS דגירה למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס למחרת. שטפו את הכלי בהרחבה עם PBS, ולאחר מכן הוסיפו לכלי ICAM One FC ו-SD F1 אנושי בתמיסת PBS.

דגירה במשך ארבע שעות בטמפרטורת החדר כדי לשתק את המולקולות. קבע את צפיפות התאים המתורבתים באמצעות ציטומטר המו. לאחר מכן שטפו את הלימפוציטים פעמיים עם PBS והשעו אותם מחדש במיליליטר אחד של מדיה L 15 המכילה גלוקוז D לאחר הדגירה, שטפו את הכלי המצופה עם ICAM אחד FC ו-SDF אחד בהרחבה עם PBS העבירו את לימפוציטים T במיליליטר אחד של מדיה למנה, בערך פעמיים עד חמש פעמים 10 לתא החמישי יש להשתמש בכל מנה כדי להשיג צפיפות תאים המתאימה לניתוח נדידה.

כדי לקבל תמונות של נדידת תאים, הנח את הצלחת על במת המיקרוסקופ בסביבה מבוקרת טמפרטורה כגון תא מחומם ב-37 מעלות צלזיוס. פתח את תוכנת NIS elements בתפריט הגדרות התמונה. בחר binning של שניים על שניים כמצב הן להדמיה חיה והן ללכידת תמונה.

עבור לתפריט היישומים ובחר, הגדר, הפעל, ניסה. בחר את משך הזמן בין התמונות ואת הזמן הכולל. לרצף לכידת התמונה, לחץ על כפתור ההפעלה כדי להתחיל ברכישת התמונה לאחר הרכישה.

ניתן לכמת פרמטרי הגירה כגון מהירות, אורך נתיב ותזוזה באמצעות חבילת תוכנה כגון Image J Auto Quant או veloc. כדי ליצור עלילת קורי עכביש, אסוף את קואורדינטות ה-XY עבור כל תא ונקודת זמן והקרין אותן על גרף עם נקודת התחלה משותפת לכל תא במקור. לימפוציטים מסוג T המוצגים כאן עברו תרבית מצופה על ICAM ו-SDF 1 וצולמו כל 10 שניות למשך 30 דקות.

סרטון זה מציג את הנדידה האקראית של לימפוציטים מסוג T במהירות של כ-15 מיקרון לדקה באמצעות קואורדינטות XYT עבור כל תא. 15 תאים נבחרו באופן אקראי ושורטטו עם נקודת התחלה משותפת במקור. השוואת חלקות קורי עכביש נותנת תיאור חזותי מהיר של הבדלים בנדידה בין תנאי ניסוי שונים.

עלילות לנדידת לימפוציטים מסוג T בתנאי בקרה מוצגות משמאל ואילו עלילות לנדידת לימפוציטים מסוג T בנוכחות נוגדן חוסם ליגנד אחד נגד LFA מוצגות מימין. נתונים אלה מדגימים כי לימפוציטים מסוג T משתמשים באינטגרין LFA אחד כדי לנדוד על סובסטרט ICAM אחד. זה עתה הראינו לך כיצד לבצע בדיקת הגירה באמצעות לימפוציטים אנושיים מתורבתים במהלך ההליך.

חשוב לזכור להוסיף מספר מתאים של תאים לצלחת מצופה אחת של ICAM כך שמעקב אחר תאים וניתוח הנדידה יהיו פשוטים יותר. אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.

Explore More Videos

אימונולוגיה גיליון 40 T לימפוציטים הגירה Integrin LFA-1 ICAM-1 chemokine