Multi-אלקטרודה מערך הקלטות של מפולות העצבית תרבויות Organotypic

מטרת הניסוי הזה היא לחקור את הארגון העצמי של פעילות מוחית בריאה למפולות עצביות, סימן ההיכר של דינמיקת מצב קריטי בקליפת המוח. זה מושג על ידי שילוב של פרוסת קליפת המוח השכבתית של העטרה יחד עם פרוסת מוח אמצעית, המספקת תשומות דופמינרגיות חשובות מבחינה התפתחותית לקליפת המוח. כשלב שני, התרבות המשותפת של המוח התיכון של קליפת המוח גדלה על מערך מרובה אלקטרודות, המאפשר גירוי ורישום מרובה אתרים של פעילויות עצביות בתרבית.

לאחר מכן, אנו נותנים לתרבית המשותפת לשטח, להתרחב ולהיצמד למשטח המזרח התיכון ואפריקה במהלך השבוע-שבועיים הראשונים בחממה שתוכננה בהתאמה אישית, אשר מחזורית את התרבית באמצעות חשיפה לאוויר ולתרבית רגילים. מתקבלות תוצאות נוזליות המראות את הארגון העצמי הספונטני של פוטנציאל השדה המקומי המרחבי-זמני מתפרץ למפולות עצביות. מבוסס על הקלטות MEA וניתוח מפולות לא מקוון המזהה את חוק החשמל בגדלי מפולות.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון תרבויות לא קשורות, הוא המערכות שלה, היבט מדעי המוח. אנו יכולים לתרבית במשותף אזורי מוח רבים יחד, ותרבויות רב-אזוריות אלה יוצרות ארגון מוחי נכון בקנה מידה גדול כמו שכבות קליפת המוח ומערכות הקרנה. היישומים של טכניקה זו חורגים מעבר לחקר מפולות נוירונו.

לדוגמה, אנו יכולים לחקור גירוי בתגובה ברמת הרשת בתנאי מבחנה מבוקרים במדויק. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד יישום נכון של תערובת תרומבין הפלזמה ומיקום הרקמה על ה-MEA. שלבים אלה דורשים תזמון מתאים, שיפוע טמפרטורה נכון והימנעות מנגיעה ישירה במשטח ה-MEA העדין.

להכנת תא זכוכית סטרילי הניתן לאטימות להקלטות, חותכים תחילה גלילי זכוכית מושחלים עם מכסה פלסטיק טפלון, כשני מילימטרים מתחתית החוט. אלה נדרשים לסגירת תא תרבית מאובטחת ומהודקת. לאחר מכן נקו את טבעות הזכוכית על ידי שטיפתן במים שלוש פעמים, ולאחר מכן הרתיחו במשך חמש דקות באלכוהול אתילי 200 הוכחה.

הניחו אותם בצד לייבוש, נדרשת תמיסת סיליקון כדי לחבר את טבעות הזכוכית למשטח המזרח התיכון ואפריקה. השתמש בערכת אלסטומר סיליקון 180 4 מגן תאים וערבב היטב 15 מיליליטר של חלקים A ו-B. ואז בואו נשב 15 דקות כדי להסיר בועות אוויר.

הפרד את התמיסה למיליליטר Eloqua אחד, ואחסן במינוס 20 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי. כעת הדביקו טבעת זכוכית ל-MEA על ידי נטילת מיליליטר אחד של סיליקון ב-23 מעלות צלזיוס במזרק עם מחט קטנה ומריחתו על משטח החיתוך הלא מלוטש של טבעת הזכוכית. לאחר מכן מרכז את טבעת הזכוכית על ה-MEA והחל שכבה נוספת של סיליקון סביב החלק החיצוני של הטבעת לאיטום חזק יותר.

תנו לזה לרפא במשך שעה עד שעתיים בטמפרטורה של כ-60 מעלות צלזיוס על פלטה חמה. לאחר מכן, יש לעקר את תא ה-MEA ואת מכסי התא מתחת למכסה המנוע על ידי שטיפה שלוש פעמים במים נטולי יונים מאשר שלוש פעמים עם 70% אלכוהול בשטיפה האחרונה. תן לתא לשבת 10 דקות באלכוהול.

לאחר מכן חשיפת פנים החדר והכובע לאור UV למשך 10 דקות. חיטוי ב-120 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות. לאחר העיקור, הניחו להם להתייבש.

כעת מצפים את משטח ה-MEA בתוך תא התרבות בפולי D ליזין. מדידות חדשות כפי ששימשו בניסוי זה הן ליפופיליות למדי, ומכאן ציפוי על ידי טיפות חוזרות. שאיבת התמיסה מרשת האלקטרודות.

חבר את המכסה כדי לאטום את תא ה-MEA לאחסון ולשימוש עתידי. הליך זה מניב חתכי קליפת המוח וה-VTA למשך כ-12 תרביות משותפות ויש לבצע אותו בתוך מכסה המנוע של הלמינה בתנאים סטריליים תוך שימוש בבעלי חיים בריאים יום עד יומיים לאחר הלידה, הזמן הכולל לאיסוף רקמות צריך להיות פחות משעה. לאחר עריפת הראש התחל להסיר את המוח על ידי ביצוע שני חתכי מספריים לרוחב כדי להסיר את העור מהקרקפת.

הסר ואז חתוך את הגולגולת בעזרת מספריים עדינים לעיניים, ובצע חתך קו אמצע סגיטלי אחד על חתך עטרה אחד בצומת המוח הקטן. הפוך לאחור את כל ארבעת דשי הגולגולת הללו כדי לחשוף את המוח. לאחר מכן בעזרת מרית מושחזת, חותכים חזיתית דרך נורת הריח.

לאחר מכן קדם את המרית רבעון מתחת למוח. הרם בעדינות את המוח החוצה מהגולגולת ותן לו להחליק למבט צונן. פתרון לקירור מהיר ואחסון זמני.

חזור על ההליך לעיל עבור שני מוחות נוספים. כדי להשיג רקמת VTA, העבירו את המוח לצלחת פטרי יבשה סטרילית. בעזרת מרית קטנה, הסר את כל הנוזלים העודפים על ידי החלקה עדינה של כל מוח הצידה כסנטימטר אחד.

לאחר מכן השתמש בסכין גילוח כדי להסיר את גזע המוח על ידי ביצוע חתך אנכי עטרה בגובה המוח הקטן. כעת הדביקו גוש אגר על דיסק הרכבה לייצוב מכני של המוח במהלך הליך החיתוך. לאחר מכן הניחו קו דק של דבק סופר, כמה מילימטרים מול גוש האגר על הדיסק, אך הימנעו מכך שהדבק ייגע באגר באמצעות מרית קטנה.

העבירו והרכיבו כל מוט קדמי במוח כלפי מטה. ודא שהמוטות הקדמיים מודבקים לדיסק ההרכבה ושהצדדים הגחוניים נוגעים באגר ללא שאריות דבק. זה מבטיח ייצוב מכני תקין במהלך החיתוך והרמה קלה של פרוסות חתוכות.

לאחר מכן, טבלו בזהירות ואבטחו את דיסק ההרכבה עם המוחות המותקנים במגש ויברם מלא בתמיסת מבט צוננת. לאחר מכן, עם חיתוך סכין גילוח שניקה בקפידה, חלקים קורונליים בעובי 400 מיקרומטר של המוח התיכון בתדר הרטט הגבוה ביותר ובמהירות קדימה נמוכה יחסית באמצעות פיפטת פסטה הפוכה עם נורת יניקה, אוספים ומעבירים את הפרוסות המכילות את ה-VTA לצלחות פטרי בגודל 35 על 10 מילימטר מלאות בתמיסת מבט צונן סטרילית לחלקים בקליפת המוח. חזור על שלבי החיתוך הקודמים, אך החל חתך אנכי בין קליפת המוח למוח הקטן והרכיב את ארבעת המוחות עם הקוטב הקדמי כלפי מעלה.

אוספים כשלוש פרוסות עטרה בעובי 350 מיקרומטר החל מגובה הסטריאטום. כעת, באמצעות מיקרו סכין העשויה מסכיני גילוח שבורים, נתחו חלקים עטרתיים ברוחב של כשני מילימטרים של קליפת המוח הקדמית ואזורי המוח התיכון המכילים את ה-VTA תחת מיקרוסקופ סטריאו. אוספים את קטע הרקמות בנפרד בכלים קטנים מלאים בתמיסת מבט צוננת.

כדי להתחיל להרכיב את הרקמה בתא MEA במצב הראשון, ה-MEA בטמפרטורת החדר תחת מיקרוסקופ סטריאו עם מערך האלקטרודות בפוקוס. לאחר מכן מרכז טיפת פלזמה של 25 מיקרוליטר על מטריצת מערך האלקטרודות הנקייה נטולת האבק והסטרילית. בעזרת מרית קטנה החלק בזהירות קטע קליפת המוח וה- VTA לתוך טיפת הפלזמה.

כעת הנח את ה-MEA על צלחת קירור ומקד מחדש את התצוגה. הניחו לזה להתקרר כ-15 שניות לפני הוספת 25 מיקרוליטר תרומבין לתוך טיפת הפלזמה. לאחר מכן בעזרת קצה פיפטת התרומבין, מורחים בזהירות את תערובת תרומבין הפלזמה בתנועות מעגליות קטנות על פני ה- MEA.

היזהר לא לגעת ישירות במערך האלקטרודות השביר. לאחר מכן, מקם בעדינות את קליפת המוח על המערך עם גבול הגב לאורך שורת האלקטרודות השנייה של המערך. בדרך זו, השכבות השטחיות המתפתחות יכסו בסופו של דבר את שארית המערך.

לאחר מכן מקם את ה- VTA בסמוך לגבול הגחון של קטע קליפת המוח. כעת מכסה וסגור באופן רופף את תא ה-MEA כדי לשמור על לחות גבוהה. אפשר למכלול תרבית MEA לשבת כשש דקות בתוך מכסה המנוע בטמפרטורת החדר כדי לאפשר תרומבין פלזמה, קרישה, התרוממות רוח.

בינתיים, חזור על ההליך להכנת שלוש תרבויות נוספות. לאחר מכן, בטיפות קטנות הוסף בזהירות 600 מיקרוליטר של מדיום תרבית לתאי התרבית, באמצעות מזרק סמ"ק אחד עם מחט בגודל 25 על חמש שמינית. לאחר מכן סגור היטב את תא ה-MEA והנח את מכלול תרבית ה-MEA על מגש אחסון הנדנדה בתוך החממה.

לאחר יומיים, במבחנה, הוסף 10 מיקרוליטר מעכב מיטוזה. לאחר מכן רענן את אמצעי התרבות ב-60% בארבעה ימים במבחנה וכל ארבעה ימים לאחר מכן. במהלך צמיחה רגילה, התרבות תשתטח באופן משמעותי ותתרחב מעט בגב.

בשל התפתחות שכבות קליפת המוח השטחיות, תרבות בריאה מזוהה על ידי הרקמה האפרפר האטומה שלה בשדה בהיר. לעומת זאת, שלפוחיות רפלקטיביות בהירות, אופייניות לתאים ניווניים מתים כ-10 עד 12 ימים לאחר הכנת התרביות, הן מוכנות לרישום וגירוי. כדי להתחיל סשן הקלטה, ה-MEA מועבר ממגש האחסון לשלב ראש ההקלטה.

כדי להקליט פוטנציאל שדה מקומי או LFP, השתמש במסנן מעבר פס של 1 עד 200 הרץ. ניתן לחקור פעילות מרובת יחידות גם באמצעות מסנן מעבר פס של 300 עד 3000 הרץ. פעילות ספונטנית בריאה נוטה להתרחש בהתפרצויות בגדלים ומשך מגוונים.

כדי לחקור את הקשר בין LFP לפעילות יחידה, אנו עשויים לחשב ממוצעים המופעלים על ידי ספייק של LFP. עבור תרביות קליפת המוח הללו, סטיות LFP שליליות נמצאות בקורלציה עם זינוק עצבי כדי לתעד פעילות מעוררת גירוי. ראשית, צורת הגל הזמנית והמשרעת של הגירויים מוגדרים באמצעות תוכנה השולטת במחולל גירויים.

פרדיגמת גירוי שימושית היא הלם יחיד ניטרלי מטען מבוקר זרם עם צורת גל ריבועית דו קוטבית. לאחר מכן, נבחרת אלקטרודה, שתשמש להעברת הגירויים. תגובות LFP אופייניות המעוררות גירוי נראות דומות לפרצי פעילות ספונטניים.

מעגלי ריקון מנתקים את המגברים במהלך הגירוי כדי להפחית את חפצי הגירוי ולמנוע רוויה של המגבר. אלקטרודת הגירוי דורשת מספר שניות להתאושש מהגירוי ולכן לא ניתן להשתמש בה כדי לתעד את פעילות התגובה. ב-MEA נוטה להופיע באשכולות מרחביים-זמניים עם פעילות באלקטרודה אחת, לעתים קרובות מלווה בפעילות באתרים אחרים.

יחד עם זאת, צורות גל טיפוסיות של LFP במהלך תקופות פעילות כאלה מוצגות כאן על ידי התוויית יתר של שלושה צבירים המתרחשים בהפרש של מספר שניות עבור כל אשכול. ניתן לראות סטיות LFP שליליות במספר אלקטרודות בחלון של שנייה אחת בעת חילוץ פסגות NLFP החוצות סף של sd שלילי מרובה, הפעילות בצורה של זמני שיא NLFP מודגמת בנוחות בראסטה שבה עמודות של נקודות מייצגות NPS כמעט מקרי באלקטרודות שונות. הארגון המרחבי-זמני של פעילות זו מורכב למדי.

עמודות שנראות פחות או יותר הומוגניות ברזולוציה זמנית נמוכה מורכבות מאשכולות נפרדים ברזולוציה זמנית גבוהה יותר וכן הלאה. הופעתם של אשכולות חלל, GEOTEMPORAL ו-LFP מאורגנת מאוד ברשתות קליפת המוח. ליתר דיוק, הארגון הוא בקנה מידה בגרסה עבור מפולות עצביות.

זה מודגם על ידי חישוב ההסתברות של גדלי אשכולות ברזולוציה זמנית נתונה. אשכולות Delta T.Here מורכבים מ-NL FPS המתרחשים באותו סלי זמן או עוקבים כאשר גודלו של אשכול כזה מתבטא במספר הכולל של NFPS לכל אשכול או אמפליטודות NLFP משולבות לכל אשכול, התפלגות גודל האשכול חושפת חוק הספק עם מעריך קרוב למינוס 1.5. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לנתח בזהירות רקמת מוח ולגדל תרביות על מערכי אלקטרודות מרובות על מנת לחקור את הארגון העצמי של הפעילות העצבית.

שיטות אלה שימשו גם לחקר הקשר בין פעילות ספונטנית לפעילות מעוררת גירוי ברשתות קליפת המוח.