בידוד תאי מטרה מבוסס חוט פונקציונלי: טכניקת Ex Vivo לבידוד תאים סרטניים מדם היקפי קוצני

מולקולות הידבקות של תאי אפיתל, או EpCAMs, הן גליקופרוטאינים טרנסממברניים על פני השטח המתבטאים יתר על המידה בתאי אפיתל המתרבים במהירות בסרטן הערמונית. כדי לבודד תאים המבטאים EpCAM, התחל עם חוט בדרגה רפואית הנושא קצה מצופה זהב פונקציונלי. שכבות פונקציונליזציה ג'ל פולימרי המכיל נוגדנים ספציפיים ל-EpCAM קשורים קוולנטית.

טבלו את החוט בתרחיף דם היקפי המכיל תאים סרטניים המסומנים בפלואורסצנט. ודא שהחלק הפונקציונלי נשאר טבול בתרחיף הדם. ה-EpCAMs על תאי הסרטן מזהים ונקשרים לנוגדנים הספציפיים שלהם המתפקדים על החוט.

שטפו עם מאגר כדי להסיר תאים לא קשורים ממשטח החוט. כופפו את החוט והרכיבו אותו על מגלשת זכוכית המכילה מאגר, כאשר החלק הפונקציונלי שקוע במאגר. השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לבדוק פלואורסצנטיות בהירה מציטופלזמה וגרעינים של תאים ולאשר את נוכחותם של תאים שנלכדו על החוט.

טפל בחוט עם מאגר שחרור. האנזימים הפרוטאוליטיים במאגר מבקעים את הג'ל הפולימרי, ומשחררים את קומפלקסי תאי הנוגדנים-סרטן לתוך המאגר. צנטריפוגה את מכלול החוט כדי לאסוף את קומפלקסי תאי הנוגדנים המשוחררים בגלולה. הסר את החוט ואת הסופרנטנט המכיל אנזים. השעו מחדש את הגלולה המכילה תא מטרה במדיום מתאים.

ב-5 מיליליטר של דם היקפי, הוסיפו כ-500 עד 500,000 תאים ולאחר מכן ערבבו על ידי היפוך הצינור. לאחר הוצאת החוט מתא האחסון, הסר את מכסה הגומי המחזיק את החוט ושטוף את החוט במי מלח 1x חוצץ פוספט והתקן אותו במכסה הצינור. לאחר מכן, דגרו את הצינור על מערבל רולר מוטה ב -5 סיבובים לדקה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה יש לשטוף את החוט במי מלח 1x חוצץ פוספט שלוש פעמים. לאחר מכן, אחסן את החוט בצינור של 15 מיליליטר המכיל 1x מי מלח עם חוצץ פוספט בחושך.

צייר אזור מלבן על מגלשת זכוכית בעזרת עט שומן והוסף עליו 500 מיקרוליטר של מי מלח 1x חוצץ פוספט. כדי לטבול את החלק הפונקציונלי של החוט במי מלח 1x חוצץ פוספט, כופפו את החלק הלא פונקציונלי של החוט והניחו אותו על מגלשת הזכוכית. כדי לספור את מספר התאים שנלכדו, בדוק חזותית את שני צידי החוט. לאחר הבדיקה, העבירו את החוט בחזרה לצינור של 15 מיליליטר עם תמיסת מלח עם חוצץ פוספט 1x ושמרו בחושך.

ב-1 מיליליטר של מי מלח 1x חוצץ פוספט, ממיסים 4 מיליגרם מרכיב מאגר השחרור. לאחר מכן, סנן את התמיסה דרך מסנן סטרילי של 0.2 מיקרומטר כדי להשיג את המאגר המוכן לשימוש. לאחר מכן, יש לחמם את מאגר השחרור בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. לאחר החימום, העבירו 1.6 מיליליטר של מאגר שחרור כדי למלא לחלוטין צינור תגובה של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן, דגרו את החלק הפונקציונלי של החוט במאגר השחרור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באמבט מים למשך 20 דקות.

לאחר הדגירה, הניחו את החוט על שייקר במהירות של 500 סיבובים לדקה למשך 15 דקות. לאחר מכן, צנטריפוגה את החוט ב -300 x גרם למשך 10 דקות. לאחר סיום הצנטריפוגה, הזיזו את החוט מהצינור, סגרו את המכסה וצנטריפוגה את הצינור שוב ב-300 x גרם למשך 10 דקות.

• Epithelial Cell Adhesion Molecules (EpCAMs) – Overexpressed in rapidly proliferating cells in prostate cancers.
• Free Floating Cancer Cells – Malignant cells in blood that have detached from a primary tumor.
• Cytocentrifugation Method – A procedure used to concentrate cells from a fluid sample.
• Functionalization – Process of equipping the wire with EpCAM-specific antibodies.
• Mccoy's 5a Medium Modified – A commercially available solution for culturing human cells.

• The EpCAMs are surface transmembrane glycoproteins overexpressed in rapidly proliferating epithelial cells (e.g., prostate cancer).
• These molecules bind to specific antibodies bound to a functionalized wire in a fluid suspension (e.g., cytocentrifugation method).
• A washing step removes unattached cells, leaving only the target cells bound to the wire (e.g., free floating cancer cells).
• The immersing and release process allows for the focus on the captured cells on the wire, and their subsequent collection.

• What is an EpCAM and how does it relate to prostate cancer and the isolation process?
• How does cytocentrifugation assist in concentrating the target cells?
• How does the wire's functionalization and release process work in terms of capturing and collecting cells?

• Isolating EpCAM-expressing cells for study can lead to advancements in cancer research (e.g., free floating cancer cells).
• Techniques like cytocentrifugation have numerous applications in cell biology and medical diagnostics (e.g., cytocentrifugation method).
• The process provides greater insights into the nature and behavior of cancers cells, potentially leading to more effective treatments (e.g., EpCAMs).
• Focused studies of such nature often lead to significant scientific advancements in cancer research and treatment.