כימות מבוסס ננו-חלקיקים מצומדים באמצעות מיקרוסקופ שדה אפל: הליך ללכידה וכימות של אקסוזומים ספציפיים מנוזלי גוף

0 views • 4:43 min • April 30th, 2023

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אקסוזומים הם מבנים קטנים וסגורים בקרום המופרשים על ידי התאים לחלל החוץ-תאי. אקסוזומים נמצאים בשפע בנוזלים ביולוגיים.

כדי לזהות וללכוד אקסוזומים ספציפיים מנוזלי הגוף, התחל בביצוע שקופית בדיקה חיסונית מרובת בארות. שקופית זו מתפקדת עם חלבונים הפועלים כאנטיגנים ונקשרים לנוגדנים ספציפיים.

השלם את השקף בתמיסת הנוגדנים הראשונית הרצויה ודגירה. נוגדנים אלה נקשרים לאנטיגנים המצופים מראש על משטח המגלשה.

שאפו את התמיסה הנותרת כדי להסיר נוגדנים לא קשורים. כעת, הוסף מאגר חוסם שחוסם את האנטיגנים החופשיים, ובכך מונע קשירה לא ספציפית של אקסוזומים.

לאחר מכן, הסר את המאגר החוסם, טען את האקסוזומים המכילים תרחיף סרום על המגלשה ודגירה. זה מאפשר קשירה בלעדית של אקסוזומים ספציפיים למטרה לנוגדנים הראשוניים שנלכדו.

לאחר מכן, טען תרחיף של נוגדנים משניים מצומדים של ננו-חלקיקי זהב על משטח ההחלקה. נוגדנים אלה נצמדים לאקסוזומים הקשורים מראש ויוצרים קומפלקס זיהוי.

לבסוף, באמצעות פיפטה, השליכו את כל הנוגדנים המשניים הלא קשורים. דמיין את השקופיות תחת מיקרוסקופ שדה כהה. ננו-חלקיקי זהב הנמצאים על פני השטח של אקסוזומים מפזרים אור ומופיעים ככתמים בהירים על הרקע הכהה.

כדי להתחיל בהכנת השקופית, יש לדלל את הנוגדנים הרצויים ללכידת אקסוזום ל-0.025 מיליגרם למיליליטר ב-PBS. פיפטה 1 מיקרוליטר של התמיסה לכל באר של שקופית שטופלה בחלבון A/G מגובה בזכוכית בדרגה אופטית. לאחר מכן, העבירו את המגלשה לקופסת לחות כדי להבטיח שהבארות לא יתייבשו במהלך הדגירה.

דגרו את המגלשה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת כדי לשתק את נוגדני הלכידה. לאחר מכן, שאפו את התמיסה הנותרת כדי להסיר נוגדנים לא קשורים. שטפו את הבארות על ידי הוספה ושאיבה של 1 מיקרוליטר PBS שלוש פעמים. לאחר מכן, טען במהירות כל באר עם 1 מיקרוליטר של מאגר חסימה מבוסס PBS, ודגר את המגלשה ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים.

כאשר אנו פועלים סביב 15 דגימות, עלינו להשתמש בפיפטה של ערוץ יחיד כדי להעמיס מאגר עבודה על 120 בארות תוך פחות מ-5 דקות כדי למנוע אידוי של חומר חוסם.

התחל להכין תמיסה של ננו-מוטות זהב מצומדים לנוגדנים במהלך חסימת שקופיות. כ-30 דקות לפני סיום החסימה, הפשירו במהירות דגימות פלזמה או סרום באמבט מים בטמפרטורת החדר. מערבולת את הדגימות המופשרות למשך 30 שניות כדי להבטיח שהמתלים הומוגניים. לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימות ב-500 x גרם למשך 15 דקות כדי לזרז אגרגטים של חלבונים ופסולת אחרת.

העבירו 10 מיקרוליטר של הסופרנטנטים לצינורות טריים ובצעו דילולים אחד לאחד עם PBS. מערבבים את הדגימות המדוללות על ידי מערבולת עדינה או היפוך לפי הצורך. לאחר סיום חסימת המגלשות, שאפו את מאגר החסימה ושטפו את הבארות שלוש פעמים עם מנות של 1 מיקרוליטר של PBS. טען מיד את הדגימות לבארות עם 1 מיקרוליטר לבאר ו-8 שכפולים לדגימה.

טען תקני אקסוזומים לבארות המתאימות באותו אופן. דגרו את המגלשה למשך 12 עד 18 שעות במקרר בחום של 4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שאפו את הבארות ושטפו כל באר פעם אחת עם 1 מיקרוליטר PBS. טען 1 מיקרוליטר של תרחיף-הזהב המצומד לנוגדנים לתוך כל באר ודגר את המגלשה ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים.

לאחר מכן, שאפו את מתלה הננו-מוט ושטפו את השקופית ב-PBS בתוספת 0.01% פוליסורבט-20 למשך 10 דקות באמצעות מיקסר. לאחר מכן, שאפו את הבארות ושטפו את המגלשה במים נטולי יונים למשך 10 דקות על מערבל מסתובב. הסר את המים ואפשר למגלשה להתייבש באוויר בצלחת פטרי נקייה לפני הבאת המגלשה למיקרוסקופ השדה הכהה.

07:30

שיפור האות Nanoprobe מהירה על ידי באתרו בתוך Nanoparticle זהב סינתזה

Related Videos

0 Views

09:16

אפיון מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית מהירה של יחיד חוץ-תאית שלפוחית בדם אנושי עם ניתוח מעקב ננו-חלקיק

Related Videos

0 Views

09:09

הדמיה של דינמיקה דיפוזיונית של ננו-ירדס זהב על קרום התא באמצעות מיקרוסקופיה אחת של ננו-חלקיקים בדארקפילד

Related Videos

0 Views

09:43

בידוד ואפיון של RNA המכיל Exosomes

Related Videos

0 Views

11:38

שיטה חדשנית לExosome כימות ומדידה גודל

Related Videos

0 Views

07:31

איתור של פלורסנט אינטראקציות Nanoparticle עם אוכלוסיות ראשוניות של תא חיסון על ידי זרימת cytometry

Related Videos

0 Views

09:43

Nanoclusters סינתזה של Immunotargeted מגנטתי plasmonic

Related Videos

0 Views

11:16

מיקרוסקופי אלקטרונים בהירי-עור גומל באמצעות חלקיקי נקודה קוונטית

Related Videos

0 Views

09:30

שימוש Nanoplasmon-משופרת פיזור מיקרוסקופ נמוך הגדלה הדמיה כדי לכמת הגידול הנגזר בגידולים

Related Videos

0 Views

09:19

ניתוח מעקב חלקיקים לכימות וקביעת גודל של שלל חוץ-תאי

Related Videos

0 Views

Last updated: 11 July 2026