כימות מבוסס ננו-חלקיקים מצומדים באמצעות מיקרוסקופ שדה אפל: הליך ללכידה וכימות של אקסוזומים ספציפיים מנוזלי גוף

אקסוזומים הם מבנים קטנים וסגורים בקרום המופרשים על ידי התאים לחלל החוץ-תאי. אקסוזומים נמצאים בשפע בנוזלים ביולוגיים.

כדי לזהות וללכוד אקסוזומים ספציפיים מנוזלי הגוף, התחל בביצוע שקופית בדיקה חיסונית מרובת בארות. שקופית זו מתפקדת עם חלבונים הפועלים כאנטיגנים ונקשרים לנוגדנים ספציפיים.

השלם את השקף בתמיסת הנוגדנים הראשונית הרצויה ודגירה. נוגדנים אלה נקשרים לאנטיגנים המצופים מראש על משטח המגלשה.

שאפו את התמיסה הנותרת כדי להסיר נוגדנים לא קשורים. כעת, הוסף מאגר חוסם שחוסם את האנטיגנים החופשיים, ובכך מונע קשירה לא ספציפית של אקסוזומים.

לאחר מכן, הסר את המאגר החוסם, טען את האקסוזומים המכילים תרחיף סרום על המגלשה ודגירה. זה מאפשר קשירה בלעדית של אקסוזומים ספציפיים למטרה לנוגדנים הראשוניים שנלכדו.

לאחר מכן, טען תרחיף של נוגדנים משניים מצומדים של ננו-חלקיקי זהב על משטח ההחלקה. נוגדנים אלה נצמדים לאקסוזומים הקשורים מראש ויוצרים קומפלקס זיהוי.

לבסוף, באמצעות פיפטה, השליכו את כל הנוגדנים המשניים הלא קשורים. דמיין את השקופיות תחת מיקרוסקופ שדה כהה. ננו-חלקיקי זהב הנמצאים על פני השטח של אקסוזומים מפזרים אור ומופיעים ככתמים בהירים על הרקע הכהה.

כדי להתחיל בהכנת השקופית, יש לדלל את הנוגדנים הרצויים ללכידת אקסוזום ל-0.025 מיליגרם למיליליטר ב-PBS. פיפטה 1 מיקרוליטר של התמיסה לכל באר של שקופית שטופלה