מיקרוסקופי אלקטרונים בהירי-עור גומל באמצעות חלקיקי נקודה קוונטית

המטרה הכוללת של שיטה זו היא להשיג מיקרוסקופ אור ואלקטרונים מתאם, או נתוני CLEM, על ידי שילוב מידע אימונוציטוכימי פלואורסצנטי עם מורפולוגיה אולטרה-מבנית ממיקרוסקופ אלקטרונים שידור בתמונה אחת. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האימונוציטוכימיה והפתולוגיה, כגון לאיזה מבנה תת-תאי קשור חלבון מסוים מעניין. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא משתמשת באותה בדיקה של ננו-חלקיקים קוונטיים כדי להשיג הן את אות המיקרוסקופ החי מחלבון המטרה והן את הלוקליזציה המבנית של מיקרוסקופ האלקטרונים.

לאחר קיבוע, הטמעה וחתך של רקמת גידול סומטוסטטינומה אנושית על פי פרוטוקול הטקסט, הכינו תמיסת דבק חתך על ידי הנחת 20 סנטימטרים של סרט דבק שקוף לבקבוק של חמישה מיליליטר המכיל 2.0 מיליליטר אצטון ותנו לו לעמוד במשך 10 דקות. הסר את הסרט וטבל רשת ניקל בתמיסה, ואז הסר את הרשת ואפשר לה להתייבש באוויר. לאחר הייבוש, השתמש בצד העמום של הרשת כדי להרים קטע דק במיוחד.

זה קריטי לקבוע את זמן החריטה הנכון עבור נוסחת השרף שנבחרה. 30 דקות עובדות היטב עבור ניסוח זה, אך ייתכן שיהיה צורך לחשב אותו מחדש עבור ניסוחים קשים או רכים יותר. הכינו מיליליטר אחד של תמיסת תחריט נתרן רווי טרי במים מזוקקים והניחו טיפות של התמיסה על משטח סרט מעבדה נקי.

מניחים רשתות יבשות לחלוטין עם חלקים על הטיפות ומדגרים בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר מכן, העבירו את הרשתות לטיפות מים מזוקקות למשך 60 שניות כדי לשטוף אותן. כדי לבצע תיוג נוגדנים ונקודה קוונטית, או QD, על משטח סרט מעבדה נקי, טיפות פיפטה של 0.05 גליקן מולרי ו-PBS.

הניחו את הרשתות על הטיפות ודגרו במשך 10 דקות כדי לחסום שאריות אלדהיד על החלקים. כדי להסיר את גוש האלדהיד, מחק לזמן קצר את קצה הרשת. לאחר מכן הנח את הרשת על טיפה של אחוז אחד סרום עיזים רגיל, או NGS, ואחוז אחד BSAC ב-PBS למשך 10 דקות.

הכן מיליליטר אחד של תמיסת חסימה על ידי הוספת 10 מיקרוליטר של NGS ו-100 מיקרוליטר של BSAC ל-890 מיקרוליטר של PBS. לאחר מכן, מרכך את החלקים על ידי הנחתם על טיפה של מדלל נוגדנים למשך 10 דקות. לאחר מכן, השתמש בדילול נוגדנים כדי לדלל נוגדן רב-שבטי אנטי-סומטוסטטין מאחד עד 10, והנח את הרשתות על טיפות של התמיסה.

דגירה בתא לח בטמפרטורת החדר למשך שעה. לאחר הדגירה, הסר את מגיב הנוגדנים על ידי ספיגת קצה הרשת. לאחר מכן השתמש במדלל נוגדנים כדי לשטוף את החלקים פעמיים במשך חמש דקות כל אחד.

לאחר דילול נוגדן משני 1 עד 10 והכנת טיפות, דגרו את הרשתות על הטיפות בטמפרטורת החדר למשך שעה. לאחר מכן, הסר את תמיסת הנוגדנים ושטוף את החלקים פעמיים. יש לדלל את ה-QDs המצומדים מ-1 עד 10 ולדגור את הדגימות על טיפות של התמיסה בחושך, בטמפרטורת החדר למשך שעה.

לאחר מכן השתמש במדלל נוגדנים כדי לשטוף את הרשתות פעמיים, בכל פעם למשך חמש דקות, ולמחוק את קצה הרשתות. לאחר מכן, שטפו את הרשתות במים מזוקקים למשך שתי דקות לפני ייבוש הקצוות. הנח את קטע הרשת המוכתמת בזרם מים על מגלשת זכוכית והשתמש בכיסוי זכוכית כדי לכסות אותו.

לביצוע מיקרוסקופ אור פלואורסצנטי, הכנס קוביית פילטר עם המאפיינים הבאים והשתמש בתאורת LED של 365 ננומטר. הנח את החלק הצבוע במערכת החיסון על שלב המיקרוסקופ האימונופלואורסצנטי. השתמש במיקרוסקופ אור כדי להעריך את דפוס התיוג, את הרמה של כל תיוג לא ספציפי וכדי לקבוע שהפקדים השליליים ברורים.

לאחר מכן, זהה החזר ROI ביחס לסרגלי רשת. לאחר מכן הגדר מצלמה דיגיטלית בצבע מלא לצבע אוטומטי FL והגדר את איזון הלבן ל-3, 200 K.הגדר את המצלמה למצב חשיפה אוטומטי עם הגדרת גמא בין 0.45 ל-1.00 כדי למטב את מראה התמונות, והגבר אנלוגי מוגדר ל-X אחד.לחץ על סמל המצלמה בממשק הגרפי של תוכנת ZEN Two Light כדי לחיות. לאחר מכן התמקד בתמונה ולחץ על הצמד בממשק הגרפי של תוכנת ZEN Two Light כדי ללכוד את התמונה לחנות המסגרות.

שמור את התמונות כקבצי tf כדי למנוע דחיסה ופיקסלים. הכן הדפס המציג את מיקום ההחזר על ההשקעה ביחס לסרגלי הרשת או ציוני דרך משמעותיים אחרים ברקמות. לאחר מכן הסר את הרשת מהמגלשה, שטוף במים מזוקקים ומחק בעדינות את הקצוות יבשים.

לביצוע מיקרוסקופ אלקטרונים הולכה יש להעביר את הרשת למיקרוסקופ לבדיקה באמצעות מתח מאיץ של 100 קילו-וולט. התחל בהגדלה נמוכה של כ-1,400X כדי לנווט ברחבי הרשת ולמצוא את ההחזר על ההשקעה עם אלה שנמצאו במיקרוסקופ אור. התבונן ב-QDs בודדים בהגדלה של 70, 000X ומעלה.

הם יופיעו כמבנים גבישיים לא סדירים עם צפיפות אלקטרונים בינונית. לאחר מכן, באמצעות מצלמה דיגיטלית עם חיישן מונוכרום של 1, 392 על 1, 040 פיקסלים בממשק הגרפי של תוכנת ההדמיה, לחץ על סמל המצלמה כדי להפעיל וקבל תמונות. העבר את סמל המצלמה למצב כבוי כדי לאחסן את התמונה במאגר המסגרות.

כדי לבצע הדמיית CLEM, השתמש בהדפסה מהדמיית מיקרוסקופ האור כדי לאתר החזר ROI מתאים על ידי TEM. תכונות ארכיטקטוניות של רקמות שימושיות לניווט סביב הקטע. צלם תמונה של החזר ה-ROI המתאים על ידי TEM.

לאחר מכן, כדי להכין תמונת CLEM, ודא שתמונת ה-TEM מכוונת כהלכה ומוגדלת לאותו גודל ורזולוציה כמו תמונת מיקרוסקופ האור, במקרה זה, 300 פיקסלים לאינץ'. הרחב את גודל בד הציור של תמונת מיקרוסקופ האור כדי להכפיל את גודלו. לאחר מכן העתק והדבק את תמונת ה-TEM לצד תמונת הקרינה.

ליצירת כיסוי פלואורסצנטי ב- Photoshop CS2, לחצו על הכלי סימון סימון מלבני, בחרו בתמונה הפלואורסצנטית וצרו ממנה שכבה כפולה. התאימו את אפשרויות המיזוג של סגנון השכבה לשקיפות של 30% עד 40%. לאחר מכן לחץ על כלי ההזזה וגרור את שכבת שכבת שכבת הקרינה מעל תמונת ה-TEM המתאימה, ויישר את התמונות.

לאחר יישור התמונות, שטחו את התמונה כדי ליצור את הכיסוי הסופי. לאחר מכן השתמשו בכלי סימון הסימון המלבני כדי לבחור את תמונת הכיסוי החדשה ולהעתיק אותה לבד ציור חדש. לבסוף, שמור את התמונה כקובץ tf.

בתמונת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית זו, תאי גידול סומטוסטטינומה בודדים מכילים גרגירי הפרשה בשפע ותויגו באופן חיובי להורמון הסומטוסטטין. הגרעינים הופיעו כחורים כהים ובהגדלה נמוכה נראתה פלואורסצנטית QD כתומה גרגירית בעוצמה משתנה בציטופלזמה. ההחזר על ההשקעה שנבחר על ידי מיקרוסקופ אור זוהה וצולם באמצעות TEM על ידי התייחסות לתמונת מיקרוסקופ אור פי 20 כפי שמצוין כאן.

בהגדלה גבוהה יותר, התא מפגין פלואורסצנטיות בהירה ותיוג QD אינטנסיבי בגרגירים ציטופלזמיים. שכבת העל של נתוני הקרינה בתמונות TEM, כמו בדוגמה זו, מצביעה על תיוג חיובי חזק המתאים לגרגירים המכילים חומר צפוף אלקטרונים בינוני בתוך הממברנה המגבילה את השלפוחית. לבסוף, כפי שניתן לראות כאן בהגדלה גבוהה יותר, הגרגירים הצפופים לאלקטרונים בינוניים הראו תיוג אימונולוגי אינטנסיבי של ננו-גבישים QD.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שמונה שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון ההליך, חשוב לזכור לטפל ברשתות בזהירות, בקצוות בלבד. נגיעה בקטע בזמן הרמת הרשת עלולה לנתק את הקטע מהרשת.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו תיוג חיסוני מרובה על מנת לענות על שאלות נוספות, כגון האם החלבון המעניין שלך מתמקם יחד עם חלבון אחר. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הפתולוגיה לחקור לוקליזציה של חלבונים בתהליך ארכיוני של רקמות אנושיות למיקרוסקופ אלקטרונים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לשלב מידע אימונוציטוכימי ממיקרוסקופ אור פלואורסצנטי עם מבנה אולטרה ממיקרוסקופ אלקטרונים שידור.

אל תשכח שעבודה עם אוסמיום טטרוקסיד עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט באמצעי זהירות כגון לבישת ציוד מגן, עבודה במכסה אדים ופינוי פסולת נכון בעת ביצוע הליך זה.