מיקרוסקופי אלקטרונים בהירי-עור גומל באמצעות חלקיקי נקודה קוונטית

המטרה הכוללת של שיטה זו היא להשיג נתונים של מיקרוסקופיה אורית ואלקטרונית קורלטיבית, או נתוני CLEM, על ידי שילוב מידע של אימונוציטוכימיה פלואורסצנטית עם מורפולוגיה של מבנה על (ultra-structural morphology) ממיקרוסקופיה אלקטרונית חודרת בתמונה אחת. שיטה זו יכולה לסייע במענה על שאלות מפתח בתחום האימונוציטוכימיה והפתולוגיה, כגון עם איזה מבנה תת-תאי קשור חלבון מסוים שמעניינו החוקר. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא משתמשת באותה גשושית של ננו-חלקיק נקודת-קוונטום כדי להשיג הן את אות המיקרוסקופיה החיה מהחלבון המטרה והן את הלוקליזציה המבנית במיקרוסקופיה אלקטרונית.

לאחר קיבוע, טמיעה וחיתוך של רקמת גידול סומטוסטטינומה אנושית בהתאם לפרוטוקול הכתוב, הכין תמיסת דבק לחתכים על ידי הנחת 20 סנטימטרים של סרט דביק שקוף בתוך בקבוק של חמישה מיליליטר המכיל 2.0 מיליליטר של acetone והשאר למשך 10 דקות. הסר את הסרט טבול רשת ניקל בתמיסה, ולאחר מכן הוצא את הרשת והשאר אותה להתייבש באוויר. לאחר הייבוש, השתמש בצד הבלתי חד של הרשת כדי לאסוף חתך דק במיוחד.

קריטי לקבוע את זמן התאתוך הנכון עבור פורמולציית השרף שנבחרה. 30 דקות עובדות היטב עבור פורמולציה זו, אך ייתכן שיהיה צורך לחשב זאת מחדש עבור פורמולציות קשות או רכות יותר. הכין מיליליטר אחד של תמיסת תאתוך טרייה ורוויה של sodium metaperiodate במים מזוקקים והנח טיפות מהתמיסה על פני סרט מעבדה נקי.

הניחו רשמים (grids) יבשים לחלוטין עם חיתוכים על טיפות הנוזל והדגירו בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר מכן, העבירו את הרשמים לטיפות של מים מזוקקים למשך 60 שניות כדי לשטוף אותם. לצורך ביצוע סימון בנוגדנים ובנקודות קוונטיות (quantum dots, QD) על פני סרט מעבדה נקי, טפטפו טיפות של גליצין 0.05 מולרי ו-PBS.

הניחו את הרשתות על הטיפות והדגירו למשך 10 דקות כדי לחסום אלדהיד שארי למקטעים. כדי להסיר את חסימת האלדהיד, ספגו קלות את קצה הרשת. לאחר מכן, הניחו את הרשת על טיפה של 1% normal goat serum, או NGS, ו-1% BSAC ב-PBS למשך 10 דקות.

הכינו מיליליטר אחד של תמיסת חסימה על ידי הוספה של 10 µL של NGS ו-100 µL של BSAC ל-890 µL של PBS. לאחר מכן, בצעו התנייה של החתכים על ידי הנחתם על טיפה של מדלל נוגדנים למשך 10 דקות. השתמשו במדלל נוגדנים כדי לדלל נוגדן פוליקלונלי anti-somatostatin ביחס של 1:10, והניחו את הסריגים על טיפות של התמיסה.

הדגירה תתבצע בתא לח בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת. לאחר ההדגירה, יש להסיר את תמיסת הנוגדנים על ידי ספיחה של קצות הרשת. לאחר מכן, יש לשטוף את החתכים פעמיים למשך חמש דקות בכל פעם באמצעות מדלל נוגדנים.

לאחר דילול הנוגדן המשני ביחס של 1:10 והכנת טיפות, הדגרו את הסריגים על הטיפות בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת. לאחר מכן, הסירו את תמיסת הנוגדן ושטפו את החתכים פעמיים. דללו QDs המשוררים לסטרפטאווידין ביחס של 1:10 והדגרו את הדגימות על טיפות מהתמיסה בחושך, בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת.

לאחר מכן, יש לשטוף את הסריגים פעמיים באמצעות מדלל נוגדנים, בכל פעם למשך חמש דקות, ולייבש את שולי הסריגים. לאחר מכן, יש לשטוף את הסריגים במים מזוקקים למשך שתי דקות לפני ייבוש השוליים. יש להניח את חיתוך הסריג הצבוע אימונוהיסטוכימית בטיפת מים על עלית זכוכית ולכסותו בעזרת כיסוי זכוכית.

לביצוע מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, הכניסו קוביית מסננים בעלת המאפיינים הבאים והשתמשו בתאורה של LED ב-365 nanometer. הניחו את החיתוך הצבוע אימונולוגית על שולחן מיקרוסקופ האימונופלואורסצנציה. השתמשו במיקרוסקופיה של אור כדי להעריך את תבנית הסימון, את רמת הסימון הבלתי ספציפי ולוודא שהביקורות השליליות נקיות.

בשלב הבא, זהו את ה-ROIs ביחס לפס grid. לאחר מכן, הגדר מצלמה דיגיטלית צבעונית מלאה ל-FL auto color והגדר מאזן לבן ל-3,200 K. הגדר את המצלמה למצב חשיפה אוטומטי עם הגדרת גמא בין 0.45 ל-1.00 כדי למטב את מראה התמונות, ואת הגבר האנלוגי (analog gain) ל-one X. לחץ על סמל המצלמה בממשק הגרפי של תוכנת ZEN Two Light כדי להפעיל תצוגה חיה. לאחר מכן, בצע פוקוס לתמונה ולחץ על Snap בממשק הגרפי של תוכנת ZEN Two Light כדי לשמור את התמונה במאגר הפריימים.

שמרו את התמונות כקבצי tf כדי למנוע דחיסה ופיקסלציה. הכינו הדפסה המראה את מיקום ה-ROI ביחס לפס רשת הסמירה או לסימני רקמה משמעותיים אחרים. לאחר מכן הסירו את רשת הסמירה מהסרט, שטפו במים מזוקקים, ויבשו בעדינות את הקצוות בניגוב.

לביצוע מיקרוסקופיה אלקטרונית חודרת (TEM), העבירו את הרשת למיקרוסקופ לבדיקה תוך שימוש במתח מאיץ של 100 kilovolts. התחילו בהגדלה נמוכה של כ-1,400X כדי לנווט ברשת ולאתר את ה-ROIs שזוהו במיקרוסקופיה של אור. צפו בנקודות קוונטיות (QDs) בודדות בהגדלה של 70,000X ומעלה.

הן יופיעו כמבנים גבישיים לא סדירים בעלי צפיפות אלקטרונים מתונה. לאחר מכן, באמצעות מצלמה דיגיטלית בעלת חיישן מונוכרומטי של 1,392 על 1,040 פיקסלים בממשק הגרפי של תוכנת הדימיון, לחצו על סמל המצלמה כדי להפעילה ולרכוש תמונות. העבירו את סמל המצלמה למצב כבוי כדי לשמור את התמונה במאגר הפריימים (frame store).

לביצוע הדמיית CLEM, השתמשו בהדפסה של הדמיית המיקרוסקופיה האורית כדי לאתר תחומי עניין (ROIs) תואמים באמצעות TEM. מאפיינים מבניים של הרקמה מסייעים בניווט בתוך החתך. צלמו תמונה של ה-ROI התואם באמצעות TEM.

בשלב הבא, כדי להכין תמונת CLEM, ודאו שתמונת ה-TEM מכוונת כראוי ומוגדלת לאותו גודל ורזולוציה של תמונת מיקרוסקופ האור, במקרה זה, 300 pixels per inch. הרחיבו את גודל קנבס תמונת מיקרוסקופ האור למכפלה מגודלו. לאחר מכן, העתיקו והדביקו את תמונת ה-TEM לצד תמונת הפלואורסצנציה.

כדי ליצור שכבת עמידה (overlay) פלואורסצנטית ב-Photoshop CS2, לחצו על כלי הבחירה המלבני (rectangular marquee tool), בחרו את התמונה הפלואורסצנטית וצרו ממנה שכבה משוכפלת. התאימו את אפשרויות המיזוג (blending options) של סגנון השכבה לשקיפות של 30 עד 40%. לאחר מכן, לחצו על כלי ההזזה (move tool) וגררו את שכבת העמידה הפלואורסצנטית מעל תמונת ה-TEM המתאימה, ויישרו את התמונות.

לאחר יישור התמונות, בצעו את פעולת ההשטחה (flatten) של התמונה כדי להפיק את השכבה העליונה (overlay) הסופית. לאחר מכן, השתמשו בכלי הבחירה המלבני (rectangular marquee tool) כדי לבחור את תמונת השכבה העליונה החדשה והעתיקו אותה למשטח עבודה (canvas) חדש. לבסוף, שמרו את התמונה כקובץ tf.

בתמונה זו של מיקרוסקופיית פלואורסצנציה, תאי גידול בודדים של סומטוסטטינומה מכילים גרנולות הפרשה רבות וסומנו באופן חיובי להורמון הסומטוסטטין. הגרעינים הופיעו כחורים כהים, ובהגדלה נמוכה נצפתה פלואורסצנציה גרנולרית של QD בגוון כתום ובעוצמות משתנות בציטופלזמה. ה-ROI שנבחר באמצעות מיקרוסקופיית אור זוהה ודוייק באמצעות TEM, תוך התייחסות לתמונת מיקרוסקופיית אור בהגדלה של 20X, כפי שמתואר כאן.

בהגדלה גבוהה יותר, התא מראה פלואורסצנציה בהירה וסימון QD אינטנסיבי בגרנולות ציטופלזמיות. החלפת נתוני הפלואורסצנציה על גבי תמונות TEM, כפי שניתן לראות בדוגמה זו, מעידה כי סימון חיובי חזק תואם לגרנולות המכילות חומר בעל דחיסות אלקטרונית מתונה בתוך ממברנת המגבלה של הוסיקולה. לבסוף, כפי שנראה כאן בהגדלה גבוהה יותר, הגרנולות בעלות הדחיסות האלקטרונית המתונה הראו סימון אימונו-פלואורסצנצי עם ננו-גבישי QD אינטנסיבי.

לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בשמונה שעות אם היא מבוצעת כהלכה. במהלך ביצוע הפרוצדורה, חשוב לזכור לטפל ברשתות בזהירות, מהשוליים בלבד. נגיעה בחתך בעת הרמת הרשת עלולה לגרום להתנתקות החתך מהרשת.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון סימון אימונולוגי מרובה (multiplex immunolabeling) על מנת לענות על שאלות נוספות, כגון האם החלבון הנחקר נמצא במיקום משותף (co-localize) עם חלבון אחר. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום הפתולוגיה לבחון לוקליזציה של חלבונים ברקמות אנושיות מארכיונים שעובדו עבור מיקרוסקופיה אלקטרונית. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי השילוב של מידע אימונוסייטוכימי ממיקרוסקופיה פלואורסצנטית עם מבנה אולטרה מהמיקרוסקופיה אלקטרונית חודרת (transmission electron microscopy).

יש לזכור כי עבודה עם אוסמיום טטר tanggalאקסיד עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט באמצעי זהירות כגון לבישת ציוד מגן, עבודה תחת מapay מ hút ופינוי נאות של פסולת בעת ביצוע הליך זה.