איתור של פלורסנט אינטראקציות Nanoparticle עם אוכלוסיות ראשוניות של תא חיסון על ידי זרימת cytometry
28 במרץ 2014
ניתוח של אינטראקציה nanoparticle עם אוכלוסיות מוגדרות של תאי מערכת החיסון על ידי cytometry זרימה.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות אינטראקציות של ננו-חלקיקים פלואורסצנטיים עם תת-אוכלוסיות תאי חיסון ראשוניים על ידי ציטומטריית זרימה. זה מושג על ידי טיפול ראשון בתאים המעניינים עם הננו-חלקיקים. בשלב הבא, התאים מסומנים בנוגדנים כנגד סמני פני השטח הספציפיים לתא ולאחר מכן מנותחים על ידי ציטומטריית זרימה.
בסופו של דבר, ניתן למדוד את האינטראקציה של הננו-חלקיקים עם אוכלוסיות תאי חיסון בודדים. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו מיקרוסקופיה הוא שבעזרת טכניקה זו, ניתן לכמת וריאציות בעוצמות הקרינה הנגרמות על ידי ננו-חלקיקים באוכלוסיות תאים שאינן דבקות להפנמת ננו-חלקיקים בלויקוציטים בדם, או מונוציטים מטוהרים מתחילים בציפוי חמש פעמים 10 עד חמישית מהתאים המעניינים במיליליטר אחד לבאר. בכל באר של צלחת 12 בארות.
לאחר מכן הוסף 10 מיקרוליטר של תרחיף ננו-חלקיקי סיליקון דו חמצני פלואורסצנטי שהוכנו לאחרונה לכל באר ניסוי, והוסף נפח שווה של מדיום שלם לבארות הבקרה הלא מטופלות גם בשלב זה. לאחר הפנמה של שעה ב-37 מעלות צלזיוס, העבירו את הדגימות לצינורות פוליפרופילן בודדים של 1.5 מיליליטר, ולאחר מכן סובבו את הדגימות למשך שלוש דקות ב-6,000 פעמים G וטמפרטורת החדר כדי לצבוע את התאים ב-CD 14 באמצעות דגירה כחולה של 100 מיקרוליטר מכל תרחיף תאים ב-10 מיקרוליטר של הנוגדן האנושי ביחס של 1 ל-11 במאגר פועל למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר שטיפת הנוגדן הלא קשור במיליליטר אחד של מאגר רץ, השעו מחדש את התאים ב-200 מיקרוליטר של מאגר רץ טרי לניתוח זרימה ציטומטרי.
לאחר מכן, כדי להגדיר את פיצוי הזליגה הספקטרלי, פתח את תיבת הגדרות המכשיר בתוכנת ציטומטריית הזרימה, ולאחר מכן רכוש דגימה חופשית של ננו-חלקיקים ללא תווית של נוגדן במהירות נוזלית נמוכה. התאמת הגדרות הפיצוי בנוכחות ננו-חלקיקים פלואורסצנטיים היא החלק המסובך ביותר בהליך מכיוון שהננו-חלקיקים יכולים להפריע לפיזור הצד כדי להבטיח הצלחה, יש להגדיר שער של אוכלוסיית התאים המעניינת התאם ידנית את הפיזור קדימה והצד על ידי ויסות ערוצי המתח. לאחר מכן צייר שער גדול כראוי סביב אוכלוסיית התאים הרצויה.
טען דגימה נוספת ללא תווית, ופתח את לשונית הפיצוי בתיבת הגדרות המכשיר. התאם את גורם הפיצוי במהלך הרכישה עד שעוצמת הקרינה בערוץ הזליגה תהיה זהה בערך עבור האוכלוסיות החיוביות והשליליות של הפלואורוכרום. לבסוף, לאחר התאמת הפיצוי עבור כל צינור בקרה של פלואורוכרום מוכתם, קרא את הדגימות שטופלו בננו-חלקיקים במאמץ לאפיין טוב יותר את התנהגות תאי הדם הלבנים בתגובה לננו-חלקיקים, בוצעו בדיקות הפנמה כפי שהודגם זה עתה.
לדוגמה, בניסוי מייצג זה, שלוש תת-אוכלוסיות עיקריות של לויקוציטים בדם זוהו בבירור על ידי פיזור קדימה וצדדית לאחר בידוד PBMC. יתר על כן, לאחר טיפול בסיליקון דו חמצני fz, לימפוציטים, מונוציטים וגרנולוציטים הפגינו שיעורי הפנמה שונים של ננו-חלקיקים כפי שמצוין על ידי עוצמת הקרינה שלהם. בתמונות אלה, הפנמת ננו-חלקיקים מודגמת במונוציטים חיוביים ראשוניים CD 14 מטוהרים מ-pbmc.
תרשימי פיזור אלה מציגים מונוציטים חיוביים CD 14 בנוכחות ננו-חלקיקי הסיליקון הדו-חמצני של פיץ. ההיסטוגרמה ממחישה את הכימות של התאים החיוביים המתבטאים בעוצמת הקרינה. ניסויי הפנמה דומים בוצעו עם מונוציטים TP one שטופלו בריכוזים הולכים וגדלים של ננו-חלקיקי סיליקון דו חמצני של פיץ עם תאים לא מטופלים כביקורת שלילית.
תרשימי הנקודות ממחישים את העלייה התלויה במינון בפיזור הצד עם פיזור קדימה ללא שינוי בקו התא האחד TP לאחר הפנמת ננו-חלקיקים. הנתונים מהגרפים הללו מצביעים על כך שטיפול בננו-חלקיקי סיליקון דו חמצני של פיץ גורם להפנמה תלוית מינון במונוציטים המודגשת על ידי שיפור הגרעיניות התוך תאית כדי לקבל תובנה נוספת לגבי האינטראקציות בין תאי חיסון לננו-חלקיקים, מיקרוגליה תרבית במשך שבעה ימים במבחנה והודגרה עם ננו-חלקיקים למשך שעה. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית הצביעה על תרבית תאי גליה ראשונית מעורבת עם מספר רב של אסטרוציטים שליליים שאינם נדבקים ל-GFP וכמה תאים חיוביים ל-GFP.
בניסוי מייצג זה, ניתן היה להבחין בין שלוש תת-אוכלוסיות גליה על ידי זרימה ציטומטרית עם נוגדן CD 11 B יחיד שצובע CD 11 B, אסטרוציטים שליליים שליליים של GFP ותאי גליה אחרים, תאי GFP חיוביים למיקרוגליה CD 11 B חיוביים, ותת-אוכלוסייה חיובית ל-CD 11 B חיובית ל-GFP. שתי תת-האוכלוסיות האחרונות מסוגלות להפנים ננו-חלקיקים עם מחסור מוגבר מעט על ידי האוכלוסייה החיובית ל-GFP. ניתן לאמת עוד יותר את הפנמת הננו-חלקיקים על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית כפי שמודגם בתמונה זו באמצעות ננו-חלקיקי סיליקון דו חמצני של מוט דומין.
בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור את הדגימות בחושך כדי למנוע הלבנה של הצבעים הפלואורסצנטיים ולשמור את הדגימות בארבע מעלות במהלך הדגירה של הנוגדנים. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו מיקרוסקופיה קונפוקלית כדי לענות על שאלה נוספת לגבי לוקליזציה תוך-תאית של הננו-חלקיקים.
סקירה כללית
מחקר זה מתמקד באינטראקציה של ננו-חלקיקים פלואורסצנטיים עם תתי-אוכלוסיות של תאי חיסון ראשוניים באמצעות ציטומטריה של זרימה. שיטה זו מאפשרת כימות של הפנימה (internalization) של הננו-חלקיקים בתאי חיסון שונים, ומספקת תובנות לגבי התנהגותם.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- אימונולוגיה
- ננוטכנולוגיה
- ציטומטריית זרימה
רקע
- ניתן להשתמש בננו-חלקיקים כדי לחקור אינטראקציות של תאי מערכת החיסון.
- ציטומטריה של זרימה מציעה יתרונות על פני מיקרוסקופיה לצורך כימות פלואורסצנציה.
- הבנת הפנימה (internalization) של ננו-חלקיקים יכולה להנחות אסטרטגיות טיפוליות.
- סוגים שונים של תאי מערכת החיסון עשויים להפגין תגובות משתנות לננו-חלקיקים.
מטרת המחקר
- ניתוח האינטראקציה של ננו-חלקיקים עם תתי-אוכלוסיות של תאי מערכת החיסון.
- כימות שיעורי הפנימה של ננו-חלקיקים בסוגי תאים שונים.
- שיפור ההבנה של תגובות מערכת החיסון לטיפול בננו-חלקיקים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- תאי חיסון ראשוניים טופלו בננו-חלקיקים פלואורסצנטיים של סיליקה (silicon dioxide).
- התאים סומנו באמצעות נוגדנים ספציפיים לצורך אנליזה בציטומטריית זרימה.
- הגדרות הפיצוי (compensation) הותאמו כדי להתחשב בהפרעה שגרמו הננו-חלקיקים.
- בוצעו בדיקות אינטרנליזציה כדי להעריך את קליטת הננו-חלקיקים.
תוצאות עיקריות
- אוכלוסיות שונות של תאי מערכת החיסון הראו שיעורים משתנים של הפנמה של ננו-חלקיקים.
- ציטומטריה של זרימה בידלה ביעילות בין סוגי תאים על בסיס עוצמת הפלואורסצנציה.
- ההפנמה אוששה באמצעות טכניקות מיקרוסקופיה נוספות.
- התוצאות הצביעו על קשר תלוי-מינון בספיגת ננו-חלקיקים על ידי מונוציטים.
מסקנות
- המחקר מדגים את התועלת של ציטומטריית זרימה בניתוח אינטראקציות של ננו-חלקיקים עם תאי מערכת החיסון.
- הממצאים תורמים להבנה כיצד ננו-חלקיקים עשויים להשפיע על תגובות חיסוניות.
- מחקרים עתידיים עשויים לבחון יישומים טיפוליים של ננו-חלקיקים באימונולוגיה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו מאפשרת הערכה כמותית של הפנמה (internalization) של ננו-חלקיקים בתתי-אוכלוסיות של תאי חיסון ראשוניים, ובכך היא תומכת בתיקוף מטרה ובצמצום סיכונים מכניסטיים בפיתוח ננו-תרפויטיקה. על ידי אספקת נתוני בליעה התלויים במינון ובסוג התא, השיטה מגבירה את הביטחון החזוי בשלבי הגילוי המוקדמים ומספקת בסיס לקבלת החלטות לגבי המשך הפיתוח (go/no-go) עבור התערבויות מבוססות ננו-חלקיקים. גישה זו נותנת מענה לאתגר מרכזי בשלב הגילוי: תרגום אינטראקציות בין ננו-חלקיקים לתאים למדדים ניתנים לביצוע ולשחזור לצורך תיעדוף תיקי פיתוח.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות על ידי כימות הספיגה של ננו-חלקיקים בתתי-אוכלוסיות של תאי מערכת החיסון, ובכך מבהיר אילו אוכלוסיות תאים מקיימות אינטראקציה עם נשאי הננו.
- ערך תפעולי: מאפשר הפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות מדידה סטנדרטית וניתנת לשחזור של הפנימה (internalization) באמצעות עוצמת פלואורסצנציה ושינויים בפיזור אור צדי (side-scattered light).
- ערך ניבוי: תומך במיון תיקי פיתוח על ידי זיהוי סוגי תאים בעלי זיקה גבוהה או נמוכה לננו-חלקיקים, ובכך מכוון את בחירת המטרה עבור ננו-טיפולים אימונו-מודולטוריים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: מכינה מערכות תאי חיסון שעברו ולידציה לסריקות המשך, על ידי קביעת פרופילי אינטראקציה בסיסיים של ננו-חלקיקים.
- תוצרים כמותיים: מייצרת מדדי עוצמת פלואורסצנציה ו-SSC המאפשרים קריאות סטנדרטיות וניתנות להשוואה בין תנאים ונקודות זמן שונות.
- שימוש חוזר בפלטפורמה: תומכת בתזרימי עבודה של סריקה ניתנים להרחבה באמצעות פרוטוקולים עקביים של gating, פיצוי (compensation) וסימון נוגדנים, הישימים לפורמולציות מגוונות של ננו-חלקיקים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: ניתן להרחבה למיקרוגליה ראשונית מעכברים מוטנטיים, מה שמאפשר מחקרי ננו-חלקיקים המכוונים למערכת העצבים המרכזית (CNS) במודלים חיסוניים הרלוונטיים למחלה.
- המשכיות תרגומית: מקשר בין ממצאים של ציטומטריית זרימה לאישור באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית, ובכך מחזק את הפרשנות המכניסטית לצורך תיקוף פרה-קליני.
- קידום מותאם סיכון: מסייע בקבלת החלטות לגבי קידום המחקר על ידי חשיפת שיעורי הפנימה (internalization) דיפרנציאליים, כגון תתי-אוכלוסיות של מיקרוגליה חיוביות ל-GFP המראות ספיגה משתנה של ננו-חלקיקים.
שילוב תהליכי עבודה וקווי עיבוד
השיטה נשארת בתוך רצף הגילוי, החל מסריקת מעורבות של מטרות בשלב מוקדם ועד להערכה מכניסטית פרה-קלינית, במיוחד עבור ננו-תרפיה אימונו-מודולטורית שבה פרופילי האינטראקציה של תאי מערכת החיסון הם קריטיים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות על ידי קישור חשיפה לננו-חלקיקים לשינויים מדידים בגרנולריות של תאים ובפלואורסצנציה, ובכך מבהיר מנגנונים של הפעלה או ויסות של תאי מערכת החיסון.
- סריקה: מספק מוכנות לבדיקה באמצעות שלבי בידוד, סימון ופיצוי סטנדרטיים המבטיחים כימות הדיר בשיחזור של אינטראקציות בין ננו-חלקיקים לתאים.
- אנליטיקה: מספקת מדידות כמותיות של משתנים תלויים (עוצמת פלואורסצנציה, הסטות ב-SSC) המאפשרות השוואה של הפנימה (internalization) בין סוגי תאים, ריכוזים ונקודות זמן שונות.
- מחקר תרגומי: מקשר לתיקוף פרה-קליני באמצעות אישור אורתוגונלי עם מיקרוסקופיה קונפוקלית, בהלימה להפחתת סיכונים מנגנונית המותאמת לסמנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: משמש כיכולת הניתנת לשימוש חוזר על פני פורמטים שונים של ננו-חלקיקים (למשל, FITC-SiO₂, Rhodamine-SiO₂) ומודלים חיסוניים (לוקוציטים מדם אנושי, מיקרוגליה עכברית), ובכך מפחית פיתוח שיטות כפול.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית על ידי אספקת נתונים כמותיים ברזולוציית תא על הפנטראליזציה של ננו-חלקיקים, ובכך משפר את הוודאות לגבי המטרה באסטרטגיות אימונו-מודולטוריות.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה ושחזוריות באמצעות פרוטוקולי פיצוי ופאנלים של נוגדנים מוגדרים, ובכך ממזער שונות בין משתמשים ואתרים שונים.
- ערך אסטרטגי: משפר קבלת החלטות מסוג go/no-go על ידי זיהוי מוקדם של תתי-אוכלוסיות חיסוניות הנוטות למעורבות עם ננו-חלקיקים, ובכך מפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים של פיתוח ננו-תרפויטיקה.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכון על ידי הדגשת פורמולציות של ננו-חלקיקים בעלות פרופילי אינטראקציה עם תאי מערכת החיסון, בין אם חיוביים ובין אם לא רצויים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בפיצוי (compensation) של ציטומטריית זרימה, במיוחד כדי להתמודד עם הפרעות בפיזור צדי (side-scattering) הנגרמות מננו-חלקיקים במהלך תיקון חפיפה ספקטרלית.
- תלוי בגישה לציטומטרים של זרימה עם יכולות גילוי פלואורסצנציה ופיזור, יחד עם פאנלים של נוגדנים לזיהוי תתי-אוכלוסיות של תאי מערכת החיסון.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של אסטרטגיות gating והגדרות פיצוי כדי להבטיח פרשנות נתונים עקבית בין קבוצות הגילוי לקבוצות הפרה-קליניות.
- דורש התאמה כאשר הוא מיושם על מערכות מודל שונות (למשל, תאים נצמדים לעומת תאים שאינם נצמדים, תאי מקור אנושיים לעומת תאי מקור עכבריים) כדי לשמור על נאמנות הבדיקה.
- מגבלה מעשית: תכונות פלואורסצנציה או פיזור של ננו-חלקיקים עלולות להפריע לפלואורוכרומים מסוימים, דבר הדורש תכנון קפדני של הפאנל ותיקוף של הפיצוי כפי שצוין בפרוטוקול.
