איתור של פלורסנט אינטראקציות Nanoparticle עם אוכלוסיות ראשוניות של תא חיסון על ידי זרימת cytometry

ניתוח של אינטראקציה nanoparticle עם אוכלוסיות מוגדרות של תאי מערכת החיסון על ידי cytometry זרימה.

המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות אינטראקציות של ננו-חלקיקים פלואורסצנטיים עם תת-אוכלוסיות תאי חיסון ראשוניים על ידי ציטומטריית זרימה. זה מושג על ידי טיפול ראשון בתאים המעניינים עם הננו-חלקיקים. בשלב הבא, התאים מסומנים בנוגדנים כנגד סמני פני השטח הספציפיים לתא ולאחר מכן מנותחים על ידי ציטומטריית זרימה.

בסופו של דבר, ניתן למדוד את האינטראקציה של הננו-חלקיקים עם אוכלוסיות תאי חיסון בודדים. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו מיקרוסקופיה הוא שבעזרת טכניקה זו, ניתן לכמת וריאציות בעוצמות הקרינה הנגרמות על ידי ננו-חלקיקים באוכלוסיות תאים שאינן דבקות להפנמת ננו-חלקיקים בלויקוציטים בדם, או מונוציטים מטוהרים מתחילים בציפוי חמש פעמים 10 עד חמישית מהתאים המעניינים במיליליטר אחד לבאר. בכל באר של צלחת 12 בארות.

לאחר מכן הוסף 10 מיקרוליטר של תרחיף ננו-חלקיקי סיליקון דו חמצני פלואורסצנטי שהוכנו לאחרונה לכל באר ניסוי, והוסף נפח שווה של מדיום שלם לבארות הבקרה הלא מטופלות גם בשלב זה. לאחר הפנמה של שעה ב-37 מעלות צלזיוס, העבירו את הדגימות לצינורות פוליפרופילן בודדים של 1.5 מיליליטר, ולאחר מכן סובבו את הדגימות למשך שלוש דקות ב-6,000 פעמים G וטמפרטורת החדר כדי לצבוע את התאים ב-CD 14 באמצעות דגירה כחולה של 100 מיקרוליטר מכל תרחיף תאים ב-10 מיקרוליטר של הנוגדן האנושי ביחס של 1 ל-11 במאגר פועל למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר שטיפת הנוגדן הלא קשור במיליליטר אחד של מאגר רץ, השעו מחדש את התאים ב-200 מיקרוליטר של מאגר רץ טרי לניתוח זרימה ציטומטרי.

לאחר מכן, כדי להגדיר את פיצוי הזליגה הספקטרלי, פתח את תיבת הגדרות המכשיר בתוכנת ציטומטריית הזרימה, ולאחר מכן רכוש דגימה חופשית של ננו-חלקיקים ללא תווית של נוגדן במהירות נוזלית נמוכה. התאמת הגדרות הפיצוי בנוכחות ננו-חלקיקים פלואורסצנטיים היא החלק המסובך ביותר בהליך מכיוון שהננו-חלקיקים יכולים להפריע לפיזור הצד כדי להבטיח הצלחה, יש להגדיר שער של אוכלוסיית התאים המעניינת התאם ידנית את הפיזור קדימה והצד על ידי ויסות ערוצי המתח. לאחר מכן צייר שער גדול כראוי סביב אוכלוסיית התאים הרצויה.

טען דגימה נוספת ללא תווית, ופתח את לשונית הפיצוי בתיבת הגדרות המכשיר. התאם את גורם הפיצוי במהלך הרכישה עד שעוצמת הקרינה בערוץ הזליגה תהיה זהה בערך עבור האוכלוסיות החיוביות והשליליות של הפלואורוכרום. לבסוף, לאחר התאמת הפיצוי עבור כל צינור בקרה של פלואורוכרום מוכתם, קרא את הדגימות שטופלו בננו-חלקיקים במאמץ לאפיין טוב יותר את התנהגות תאי הדם הלבנים בתגובה לננו-חלקיקים, בוצעו בדיקות הפנמה כפי שהודגם זה עתה.

לדוגמה, בניסוי מייצג זה, שלוש תת-אוכלוסיות עיקריות של לויקוציטים בדם זוהו בבירור על ידי פיזור קדימה וצדדית לאחר בידוד PBMC. יתר על כן, לאחר טיפול בסיליקון דו חמצני fz, לימפוציטים, מונוציטים וגרנולוציטים הפגינו שיעורי הפנמה שונים של ננו-חלקיקים כפי שמצוין על ידי עוצמת הקרינה שלהם. בתמונות אלה, הפנמת ננו-חלקיקים מודגמת במונוציטים חיוביים ראשוניים CD 14 מטוהרים מ-pbmc.

תרשימי פיזור אלה מציגים מונוציטים חיוביים CD 14 בנוכחות ננו-חלקיקי הסיליקון הדו-חמצני של פיץ. ההיסטוגרמה ממחישה את הכימות של התאים החיוביים המתבטאים בעוצמת הקרינה. ניסויי הפנמה דומים בוצעו עם מונוציטים TP one שטופלו בריכוזים הולכים וגדלים של ננו-חלקיקי סיליקון דו חמצני של פיץ עם תאים לא מטופלים כביקורת שלילית.

תרשימי הנקודות ממחישים את העלייה התלויה במינון בפיזור הצד עם פיזור קדימה ללא שינוי בקו התא האחד TP לאחר הפנמת ננו-חלקיקים. הנתונים מהגרפים הללו מצביעים על כך שטיפול בננו-חלקיקי סיליקון דו חמצני של פיץ גורם להפנמה תלוית מינון במונוציטים המודגשת על ידי שיפור הגרעיניות התוך תאית כדי לקבל תובנה נוספת לגבי האינטראקציות בין תאי חיסון לננו-חלקיקים, מיקרוגליה תרבית במשך שבעה ימים במבחנה והודגרה עם ננו-חלקיקים למשך שעה. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית הצביעה על תרבית תאי גליה ראשונית מעורבת עם מספר רב של אסטרוציטים שליליים שאינם נדבקים ל-GFP וכמה תאים חיוביים ל-GFP.

בניסוי מייצג זה, ניתן היה להבחין בין שלוש תת-אוכלוסיות גליה על ידי זרימה ציטומטרית עם נוגדן CD 11 B יחיד שצובע CD 11 B, אסטרוציטים שליליים שליליים של GFP ותאי גליה אחרים, תאי GFP חיוביים למיקרוגליה CD 11 B חיוביים, ותת-אוכלוסייה חיובית ל-CD 11 B חיובית ל-GFP. שתי תת-האוכלוסיות האחרונות מסוגלות להפנים ננו-חלקיקים עם מחסור מוגבר מעט על ידי האוכלוסייה החיובית ל-GFP. ניתן לאמת עוד יותר את הפנמת הננו-חלקיקים על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית כפי שמודגם בתמונה זו באמצעות ננו-חלקיקי סיליקון דו חמצני של מוט דומין.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור את הדגימות בחושך כדי למנוע הלבנה של הצבעים הפלואורסצנטיים ולשמור את הדגימות בארבע מעלות במהלך הדגירה של הנוגדנים. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו מיקרוסקופיה קונפוקלית כדי לענות על שאלה נוספת לגבי לוקליזציה תוך-תאית של הננו-חלקיקים.