איתור של פלורסנט אינטראקציות Nanoparticle עם אוכלוסיות ראשוניות של תא חיסון על ידי זרימת cytometry
28 במרץ 2014
ניתוח של אינטראקציה nanoparticle עם אוכלוסיות מוגדרות של תאי מערכת החיסון על ידי cytometry זרימה.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות אינטראקציות של ננו-חלקיקים פלואורסצנטיים עם תת-אוכלוסיות תאי חיסון ראשוניים על ידי ציטומטריית זרימה. זה מושג על ידי טיפול ראשון בתאים המעניינים עם הננו-חלקיקים. בשלב הבא, התאים מסומנים בנוגדנים כנגד סמני פני השטח הספציפיים לתא ולאחר מכן מנותחים על ידי ציטומטריית זרימה.
בסופו של דבר, ניתן למדוד את האינטראקציה של הננו-חלקיקים עם אוכלוסיות תאי חיסון בודדים. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו מיקרוסקופיה הוא שבעזרת טכניקה זו, ניתן לכמת וריאציות בעוצמות הקרינה הנגרמות על ידי ננו-חלקיקים באוכלוסיות תאים שאינן דבקות להפנמת ננו-חלקיקים בלויקוציטים בדם, או מונוציטים מטוהרים מתחילים בציפוי חמש פעמים 10 עד חמישית מהתאים המעניינים במיליליטר אחד לבאר. בכל באר של צלחת 12 בארות.
לאחר מכן הוסף 10 מיקרוליטר של תרחיף ננו-חלקיקי סיליקון דו חמצני פלואורסצנטי שהוכנו לאחרונה לכל באר ניסוי, והוסף נפח שווה של מדיום שלם לבארות הבקרה הלא מטופלות גם בשלב זה. לאחר הפנמה של שעה ב-37 מעלות צלזיוס, העבירו את הדגימות לצינורות פוליפרופילן בודדים של 1.5 מיליליטר, ולאחר מכן סובבו את הדגימות למשך שלוש דקות ב-6,000 פעמים G וטמפרטורת החדר כדי לצבוע את התאים ב-CD 14 באמצעות דגירה כחולה של 100 מיקרוליטר מכל תרחיף תאים ב-10 מיקרוליטר של הנוגדן האנושי ביחס של 1 ל-11 במאגר פועל למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר שטיפת הנוגדן הלא קשור במיליליטר אחד של מאגר רץ, השעו מחדש את התאים ב-200 מיקרוליטר של מאגר רץ טרי לניתוח זרימה ציטומטרי.
לאחר מכן, כדי להגדיר את פיצוי הזליגה הספקטרלי, פתח את תיבת הגדרות המכשיר בתוכנת ציטומטריית הזרימה, ולאחר מכן רכוש דגימה חופשית של ננו-חלקיקים ללא תווית של נוגדן במהירות נוזלית נמוכה. התאמת הגדרות הפיצוי בנוכחות ננו-חלקיקים פלואורסצנטיים היא החלק המסובך ביותר בהליך מכיוון שהננו-חלקיקים יכולים להפריע לפיזור הצד כדי להבטיח הצלחה, יש להגדיר שער של אוכלוסיית התאים המעניינת התאם ידנית את הפיזור קדימה והצד על ידי ויסות ערוצי המתח. לאחר מכן צייר שער גדול כראוי סביב אוכלוסיית התאים הרצויה.
טען דגימה נוספת ללא תווית, ופתח את לשונית הפיצוי בתיבת הגדרות המכשיר. התאם את גורם הפיצוי במהלך הרכישה עד שעוצמת הקרינה בערוץ הזליגה תהיה זהה בערך עבור האוכלוסיות החיוביות והשליליות של הפלואורוכרום. לבסוף, לאחר התאמת הפיצוי עבור כל צינור בקרה של פלואורוכרום מוכתם, קרא את הדגימות שטופלו בננו-חלקיקים במאמץ לאפיין טוב יותר את התנהגות תאי הדם הלבנים בתגובה לננו-חלקיקים, בוצעו בדיקות הפנמה כפי שהודגם זה עתה.
לדוגמה, בניסוי מייצג זה, שלוש תת-אוכלוסיות עיקריות של לויקוציטים בדם זוהו בבירור על ידי פיזור קדימה וצדדית לאחר בידוד PBMC. יתר על כן, לאחר טיפול בסיליקון דו חמצני fz, לימפוציטים, מונוציטים וגרנולוציטים הפגינו שיעורי הפנמה שונים של ננו-חלקיקים כפי שמצוין על ידי עוצמת הקרינה שלהם. בתמונות אלה, הפנמת ננו-חלקיקים מודגמת במונוציטים חיוביים ראשוניים CD 14 מטוהרים מ-pbmc.
תרשימי פיזור אלה מציגים מונוציטים חיוביים CD 14 בנוכחות ננו-חלקיקי הסיליקון הדו-חמצני של פיץ. ההיסטוגרמה ממחישה את הכימות של התאים החיוביים המתבטאים בעוצמת הקרינה. ניסויי הפנמה דומים בוצעו עם מונוציטים TP one שטופלו בריכוזים הולכים וגדלים של ננו-חלקיקי סיליקון דו חמצני של פיץ עם תאים לא מטופלים כביקורת שלילית.
תרשימי הנקודות ממחישים את העלייה התלויה במינון בפיזור הצד עם פיזור קדימה ללא שינוי בקו התא האחד TP לאחר הפנמת ננו-חלקיקים. הנתונים מהגרפים הללו מצביעים על כך שטיפול בננו-חלקיקי סיליקון דו חמצני של פיץ גורם להפנמה תלוית מינון במונוציטים המודגשת על ידי שיפור הגרעיניות התוך תאית כדי לקבל תובנה נוספת לגבי האינטראקציות בין תאי חיסון לננו-חלקיקים, מיקרוגליה תרבית במשך שבעה ימים במבחנה והודגרה עם ננו-חלקיקים למשך שעה. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית הצביעה על תרבית תאי גליה ראשונית מעורבת עם מספר רב של אסטרוציטים שליליים שאינם נדבקים ל-GFP וכמה תאים חיוביים ל-GFP.
בניסוי מייצג זה, ניתן היה להבחין בין שלוש תת-אוכלוסיות גליה על ידי זרימה ציטומטרית עם נוגדן CD 11 B יחיד שצובע CD 11 B, אסטרוציטים שליליים שליליים של GFP ותאי גליה אחרים, תאי GFP חיוביים למיקרוגליה CD 11 B חיוביים, ותת-אוכלוסייה חיובית ל-CD 11 B חיובית ל-GFP. שתי תת-האוכלוסיות האחרונות מסוגלות להפנים ננו-חלקיקים עם מחסור מוגבר מעט על ידי האוכלוסייה החיובית ל-GFP. ניתן לאמת עוד יותר את הפנמת הננו-חלקיקים על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית כפי שמודגם בתמונה זו באמצעות ננו-חלקיקי סיליקון דו חמצני של מוט דומין.
בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור את הדגימות בחושך כדי למנוע הלבנה של הצבעים הפלואורסצנטיים ולשמור את הדגימות בארבע מעלות במהלך הדגירה של הנוגדנים. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו מיקרוסקופיה קונפוקלית כדי לענות על שאלה נוספת לגבי לוקליזציה תוך-תאית של הננו-חלקיקים.
סקירה
המחקר מתמקד באינטראקציה של ננו-חלקיקים פלואורסצנטיים עם תת-אוכלוסיות ראשוניות של תאי חיסון באמצעות ציטומטריה של זרימה. השיטה מאפשרת כימות של פנימיות ננו-חלקיקים בתאי חיסון שונים, ומספקת תובנות על התנהגותם.
רכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- אימונולוגיה
- ננו-טכנולוגיה
- ציטומטריה של זרימה
רקע
- ניתן להשתמש בננו-חלקיקים כדי לחקור אינטראקציות של תאי חיסון.
- ציטומטריה של זרימה מציעה יתרונות על פני מיקרוסקופיה להקצאת פלואורסצנציה.
- הבנת פנימיות הננו-חלקיקים יכולה להעיד על אסטרטגיות טיפוליות.
- סוגים שונים של תאי חיסון עשויים להפגין תגובות שונות לננו-חלקיקים.
מטרת המחקר
- לנתח את האינטראקציה של ננו-חלקיקים עם תת-אוכלוסיות של תאי חיסון.
- לכמת את שיעורי הפנימיות של ננו-חלקיקים בסוגי תאים שונים.
- לשפר את ההבנה של תגובות החיסון לטיפול בננו-חלקיקים.
שיטות ששימשו
- תאי חיסון ראשוניים טופלו בננו-חלקיקים פלואורסצנטיים של סיליקון דו-חמצני.
- התאים סומנו בנוגדנים ספציפיים לצורך ניתוח ציטומטרי של זרימה.
- הגדרות הפיצוי הותאמו כדי לחשב את ההפרעה של הננו-חלקיקים.
- בוצעו מבחני פנימיות כדי להעריך את קליטת הננו-חלקיקים.
תוצאות עיקריות
- אוכלוסיות שונות של תאי חיסון הראו שיעורים שונים של פנימיות ננו-חלקיקים.
- ציטומטריה של זרימה הבדילה ביעילות בין סוגי התאים על בסיס עוצמת הפלואורסצנציה.
- הפנימיות אושרה באמצעות טכניקות מיקרוסקופיות נוספות.
- התוצאות הצביעו על קשר תלוי-מינון בקליטת ננו-חלקיקים במונות.
מסקנות
- המחקר מדגים את התועלת של ציטומטריה של זרימה בניתוח האינטראקציות של ננו-חלקיקים עם תאי חיסון.
- הממצאים תורמים להבנת האופן שבו ננו-חלקיקים יכולים להשפיע על תגובות החיסון.
- מחקר נוסף עשוי לחקור יישומים טיפוליים של ננו-חלקיקים באימונולוגיה.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This method enables quantitative assessment of nanoparticle internalization in primary immune cell subpopulations, supporting target validation and mechanistic de-risking in nanotherapeutic development. By providing dose-dependent and cell-type-specific uptake data, it enhances predictive confidence in early discovery and informs go/no-go decisions for nanoparticle-based interventions. The approach addresses a key discovery-stage challenge: translating nanoparticle-cell interactions into actionable, reproducible metrics for portfolio prioritization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying nanoparticle uptake across immune subsets, clarifying which cell populations engage with nanocarriers.
- Operational Value: Enables biological de-risking through standardized, reproducible measurement of internalization via fluorescence intensity and side-scattered light shifts.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying cell types with high or low nanoparticle affinity, guiding target selection for immunomodulatory nanotherapies.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated immune cell systems for downstream screening by establishing baseline nanoparticle interaction profiles.
- Quantitative Outputs: Generates fluorescence intensity and SSC metrics that enable standardized, comparable readouts across conditions and time points.
- Platform Reuse: Supports scalable screening workflows through consistent gating, compensation, and antibody labeling protocols applicable to diverse nanoparticle formulations.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Extends to primary microglia from mutant mice, enabling CNS-targeted nanoparticle studies in disease-relevant immune models.
- Translational Continuity: Connects flow cytometry findings to confocal microscopy confirmation, strengthening mechanistic interpretation for preclinical validation.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs advancement decisions by revealing differential internalization rates, such as GFP-positive microglial subpopulations showing altered nanoparticle uptake.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target engagement screening to preclinical mechanistic evaluation, particularly for immunomodulatory nanotherapies where immune cell interaction profiles are critical.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking nanoparticle exposure to measurable changes in cell granularity and fluorescence, clarifying mechanisms of immune cell activation or modulation.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized isolation, labeling, and compensation steps that ensure reproducible quantification of nanoparticle-cell interactions.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements (fluorescence intensity, SSC shifts) that enable comparison of internalization across cell types, concentrations, and time points.
- Translational Research: Connects to preclinical validation via orthogonal confirmation with confocal microscopy, aligning with biomarker-aligned mechanistic de-risking.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability across nanoparticle formats (e.g., FITC-SiO₂, Rhodamine-SiO₂) and immune models (human blood leukocytes, murine microglia), reducing redundant method development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by delivering cell-resolved, quantitative data on nanoparticle internalization, improving target confidence in immunomodulatory strategies.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through defined compensation protocols and antibody panels, minimizing variability across users and sites.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying early which immune subsets are prone to nanoparticle engagement, reducing late-stage biological risk in nanotherapeutic development.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by highlighting nanoparticle formulations with favorable or undesirable immune cell interaction profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry compensation, particularly to address nanoparticle-induced side-scattering interference during spectral overlap correction.
- Dependent on access to flow cytometers with fluorescence and scatter detection capabilities, along with antibody panels for immune cell subset identification.
- Necessitates cross-team standardization of gating strategies and compensation settings to ensure consistent data interpretation between discovery and preclinical groups.
- Requires adaptation when applied to different model systems (e.g., adherent vs. non-adherent cells, human vs. murine primary cells) to maintain assay fidelity.
- Practical limitation: Nanoparticle fluorescence or scatter properties may interfere with certain fluorochromes, requiring careful panel design and compensation validation as noted in the protocol.
