כימות היווצרות קפלים ממברניים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק

ממריצים חיצוניים מפעילים תאים וגורמים לבליטה תלת מימדית של קרום מעגלי, או היווצרות סלסול ממברנה, החיונית לפעילויות תאיות שונות.

כדי לדמיין היווצרות סלסול קרום, התחל עם צלחת מרובת בארות המכילה כיסוי בבסיס. בחלק העליון של הכיסוי יש מקרופאגים מתורבתים.

טפל במקרופאגים אלה באמצעות מולקולות ממריצות המפעילות את התאים, ומקלות על ארגון מחדש של שלד הציטו והיווצרות בליטת הממברנה. שכבו את התאים בתמיסה מקבעת, קשרו את החלבונים ושמרו על המבנה התאי.

טפל במקרופאגים הקבועים עם ריכוזי אלכוהול הולכים וגדלים להתייבשות מוחלטת. ייבשו את המקרופאגים הללו באמצעות מייבש נקודתי קריטי, תוך ביטול עקבות מים להדמיה טובה יותר.

התקן את הכיסוי על מיקרוסקופ אלקטרונים סורק, או SEM, מחזיק דגימה באמצעות סרט מוליך. מקרטע ציפוי את הכיסוי המכיל מקרופאגים בשכבת מתכת דקה, מה שמבטיח מוליכות אלקטרונית טובה במהלך ההדמיה.

הנח את הכיסוי בתא ה- SEM. מקד את קרן האלקטרונים על הכיסוי. קרן האלקטרונים פוגעת בקרום המקרופאג המצופה מתכת, וגורמת ליצירת אלקטרונים משניים באנרגיה נמוכה מפני השטח של הממברנה.

הבליטות התלת-ממדיות מפזרות אלקטרונים באופן שונה משאר הממברנה, ומדגישות את התכונות הללו על פני התא. הגלאי אוסף את האלקטרונים המפוזרים מאזורי פני התא השונים, ויוצר תמונת ניגודיות.

בתמונת ה-SEM, מקרופאגים נראים כהים יותר עם בליטות עגולות בהירות על פני השטח, מה שמאשר היווצרות סלסולים.

התחל בהנחת כיסויי זכוכית סטריליים בבארות של צלחת של 24 בארות באמצעות מלקחיים חיטוי. לאחר מכן, זרעו RAW 264.7 מקרופאגים על הכיסוי בצפיפות של 10⁶ תאים למיליליטר, ודגרו את הצלחת למשך הלילה באינקובטור לח ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני.

למחרת, החלף את המדיה בכל באר ב-500 מיקרוליטר של מדיה שלמה טרייה, ולאחר מכן, טפל מראש במקרופאגים למשך 30 דקות עם בקרת רכב כגון DMSO או מעכב מקרופינוציטוזיס כגון EIPA. לאחר מכן, כדי לקדם סלסול ממברנה, טפל בתאים במשך 30 דקות עם ממריצי מקרופינוציטוזיס, כגון תמיסת PMA של 1 מיקרומולרית או 100 ננוגרם למיליליטר של גורם מגרה מושבת מקרופאגים.

כדי לתקן את התאים לסריקת מיקרוסקופ אלקטרונים, שאפו את המדיה מהבארות ושטפו את הכיסויים פעמיים עם PBS קר כקרח. לאחר מכן, דגרו את החלקות הכיסוי בקיבוע למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן דגירה למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס.

למחרת, מבלי להפריע לשכבת התא החד-שכבתית, יש לשטוף בעדינות, ולאחר מכן, לדגור את הכיסויים ב -500 מיקרוליטר של 0.1 קקודילאט נתרן מולארי למשך 15 דקות. לאחר שתי כביסות עם 500 מיקרוליטר מים מזוקקים, שטפו את הכיסויים פעמיים ב-500 מיקרוליטר מסדרת אתנול מדורגת עם דגירה של 10 דקות בכל כביסה.

כדי לבצע ייבוש נקודה קריטית, הנח את הכיסויים במייבש נקודות קריטיות, וכסה אותם ב-100% אתנול, ולאחר מכן, לחץ על לחצן ההפעלה ופתח את מיכל הפחמן הדו חמצני. לחץ על כפתור הקירור למשך כ-30 שניות עד שהטמפרטורה יורדת ל-0 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, לחץ על כפתור המילוי עד להופעת בועה בחלון החדר.

לאחר מכן, לחץ על כפתור הטיהור עד שריח האתנול מפליטת הטיהור ייעלם. לאחר מכן, לחץ שוב על כפתור הקירור, עד שהטמפרטורה יורדת ל-0 מעלות צלזיוס. לחץ שוב על הלחצנים מילוי וניקוי כדי לכבות אותם. לאחר מכן, סגור את מיכל הפחמן הדו חמצני. לחץ שוב על כפתור הקירור כדי לכבות אותו, ולאחר מכן לחץ על כפתור החום. הגדר את הטמפרטורה ל-42 מעלות צלזיוס ואת הלחץ ל-1,200 פאונד לאינץ' מרובע.

לאחר שהלחץ והטמפרטורה מתייצבים, לחץ על כפתור הגלישה כדי לאפשר ללחץ לרדת לאט. לאחר שלחץ התא מגיע ל-150 פאונד לאינץ' מרובע, לחץ על כפתור האוורור והמתן עד שהלחץ ירד ל-0 פאונד לאינץ' מרובע. כבה את מייבש הנקודות הקריטיות והסר את החלקות הכיסוי.

לאחר מכן, באמצעות לשוניות דבק פחמן, התקן את החלקות הכיסוי על תושבות דגימת האלומיניום לסריקת מיקרוסקופ אלקטרונים. לאחר מכן, המשך לציפוי מקרטע באמצעות זהב או פלדיום בציפוי מקרטע.

הפעל את לחצן ההפעלה של ציפוי המקרטע. לאחר שהוואקום מגיע ל-30 מיליטור, יש לשטוף את החדר כדי להסיר לחות ואוויר על ידי כיבוי מתג הגז וסיבוב שסתום הגז הדק נגד כיוון השעון. לאחר שהוואקום גדל ל-200 מיליטור, כבה את מתג הגז והמתן עד שהוואקום יגיע ל-30 מיליטור, לאחר מכן, שטוף שוב את החדר כדי להסיר לחות ואוויר כפי שהודגם. לאחר שטיפת התא שלוש פעמים, לחץ על לחצן הטיימר וכוונן את כרךtagכפתור עד שהמד יקרא 10 מיליamperes. לאחר מכן, הסר את הכיסויים המצופים מהחדר.

כדי לדמיין ולכמת את סלסולי הממברנה, הכנס את כיסויי הדגימה לתא של מיקרוסקופ אלקטרונים סורק. סגור את הדלת ולחץ על כפתור הפינוי. פתח את תוכנת ההפעלה של המיקרוסקופ והגדר את מתח ההאצה ל -15 קילו-וולט ואת מרחק העבודה ל -10 מילימטרים. לחצו על כפתור הקואורדינטות והסתובבו בבקר עד שהתאים יופיעו במרכז מסך התצפית. הגדר את ההגדלה ל-3500x, ודמיין את הדגימה על ידי לחיצה על כפתור תמונה.