מדידת דינמיקת בליטה בקצה התא במהלך ההתפשטות באמצעות מיקרוסקופיה של תאים חיים

בדיקת הבליטה של קצה התא הוכחה כמתאמת ישירות עם העברת תאים. לכן זה יכול לשמש כשיטה ראשונית לזיהוי חלבונים קריטיים ומנגנוני איתות המעורבים תנועתיות התא. השיטה מהירה, פשוטה, חסכונית ואינה דורשת תיוג פלואורסצנטי או שימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי יקר.

מי שתדגים את ההליך תהיה מיכל גנדלר, סטודנטית מהמעבדה שלי. מוסיפים שני מיליליטרים של תמיסת חומצה הידרוכלורית רגילה אחת במרכז צלחת תחתונה מזכוכית ודגורים במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את המנה שלוש פעמים עם שני מיליליטר של PBS.

מדללים פיברונקטין בריכוז של 10 מיקרוגרם למיליליטר ב-PBS ומוסיפים 200 מיקרוליטרים של התמיסה המדוללת לצלחת מרכז הזכוכית. דגירה במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס. הכן פתרון 1%BSA ו- PBS והעבר אותו דרך מסנן 0.2 מיקרומטר.

Denature את הפתרון על ידי דגירה ב 70 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות באמבט מים שחומם מראש. לשטוף את צלחת הזכוכית התחתונה מצופה עם שני מיליליטר של PBS שלוש פעמים. מוסיפים שני מיליליטר של תמיסת BSA מפורקת ודוללים את המנה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת.

לשטוף את צלחת הזכוכית עם שני מיליליטרים של PBS שלוש פעמים. לפני 16 עד 18 שעות של ניסוי ב 0.7 מיליון תאים לכל צלחת תרבית רקמות בקוטר 10 ס"מ כדי להשיג 70 עד 80% מפגש. למחרת, מוסיפים שני מיליליטר של פתרון טריפסין לצלחת תרבית הרקמה ודגרים במשך שתיים עד שלוש דקות עד שהתאים מתנתקים.

הוסף חמישה מיליליטר של המדיום כדי להשבית את הטריפסין. באמצעות hemacytometer, לספור את התאים צלחת 20, 000 תאים בשני מיליליטר של המדיום השלם בצלחת התחתונה. לאחר מכן לדגור על המנה עם תאים מצופים באינקובטור במשך 15 דקות.

הפעל את יחידת החימום והגדר אותה ב 37 מעלות צלזיוס שעה אחת לפני הדמיה. כמו כן, להפעיל את יחידת דו תחמוצת הפחמן ולהגדיר אותו ב 5%10 דקות לפני הדמיה. הפעל את המיקרוסקופ והמצלמה.

הפעל את המחשב ופתח את תוכנת רכישת המיקרוסקופ. הגדר את ההגדלה על ניגודיות פאזה של עדשה יבשה פי 40. הגדר את משך הסרט הכולל ל- 10 דקות עם מרווח זמן של חמש שניות.

לאחר 15 דקות של דגירה, מניחים את צלחת הזכוכית התחתונה עם תאים דבוקים לתוך מתאם ולתקן את זה. הכנס את המתאם עם המנה לחריצים בשלב המיקרוסקופ. מורידים את כיסוי המנה, מניחים את מכסה הפחמן הדו-חמצני ופותחים את שסתום הפחמן הדו-חמצני.

אתר תא מתאים להדמיה. התחל רכישת סרטים לאחר התמקדות בתא. כדי לבצע את ניתוח התמונה, בחר את הכלי הישר בתוכנת ניתוח התמונה והפוך שמונה שורות של 20 יחידות שרירותיות בניצב לבליטות בסידור רדיאלי בכל 45 מעלות, כולל lamella וקצה תא.

בסרגל הכלים הראשי, עבור אל תמונה, בחר ערימות ולאחר מכן לחץ על Reslice כדי ליצור תמונת kymograph המתארת את התנועה של נקודות בודדות בתוך קרום התא. באמצעות תמונות kymograph, לחלץ ולספור באופן ידני את מספר בליטות, נסיגה וקפלים בכל אחד משמונת האזורים בתא מסומן על ידי קווי הרשת. מספרים אלה מייצגים את התדירות של בליטות, נסיגה וקפלים לכל 10 דקות.

קבעו את התמדה הבליטה, המרחק והמהירות על ידי ניתוח קימוגרפיה. כדי לקבוע את מרחק הבליטה, לצייר קו מאונך מבסיס הבליטה אל הפסגה הגבוהה ביותר של הבליטה. הקש M כדי למדוד את אורך הקו בפיקסלים וודא שיחס הפיקסל למיקרומטר ידוע כממיר את האורך במיקרומטרים.

כימות הבלטות, התגובות והקפלים בוצע באופן ידני לכל 10 דקות והתדירות הממוצעת שהושגה עבור בליטות ונסיגה הייתה 5.1 ו -2.1 לקפלים. לקימוגרפיה הייצוגית היה מרחק בליטה של כ-4.8 מיקרומטר וזמן בליטה של כ-0.6 דקות. דוגמה לתא שיש לא לכלול בניתוח מיוצגת.

ניתוח הקימוגרף גילה כי התא לא היה נוכח בשלב ההתפשטות שלו ולא הראה בליטות ממברנה ברורות. הדבר החשוב ביותר הוא לבחור תאים נכונים להדמיה. תא תקין צריך להיות בשלב ההתפשטות שלו ולא צריך לגעת בתאים אחרים כדי למנוע תקשורת תא-תא ואיתות.

השיטה יכולה לשמש ככלי ראשוני לבדיקת דינמיקה של שלד ציטו-שלד המערבת תנועתיות תאים לפני שתחליט לבצע תוצאות נוספות הדורשות בדיקות של העברת תאים.