Name: מדידת דינמיקת בליטה בקצה התא במהלך ההתפשטות באמצעות מיקרוסקופיה של תאים חיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 50 s
Description: למד מדידת דינמיקת בליטות בקצה תאים מתפשטים באמצעות מיקרוסקופיה של תאים חיים וניתוח קימוגרפיה. שיטה זו מאפשרת זיהוי חלבונים ומנגנוני סיגנל קריטיים בתנועתיות תאים ללא צורך בתיוג פלואורסצנטי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים NIH MH115939, NS112121, NS105640, ו R56MH122449-01A1 (לאנתוני ג'יי קולסקה) ומהקרן הישראלית למדע (מענקים מספר 1462/17 ו-2142/21) (לחוה גיל-חן).

כל השיטות המתוארות בפרוטוקול זה אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ולשימוש (IACUC) של אוניברסיטת בר-אילן.
הערה: תיאור גרפי שלב אחר שלב של ההליך המתואר בסעיף זה מופיע באיור 1.
1. תרבות התא
הערה: התאים המשמשים בפרוטוקול הם פיברובלסטים עובריים של עכבר (MEFs) שנוצרו מ- E11.5-13.5 עוברים של עכברי C57BL/6 מסוג בר. MEFs ראשי נוצרו על פי פרוטוקול המעבדה נסיכים13. תאים מחמישה עוברים שונים חוברו יחד והונצחו על ידי זיהום עם וקטור רטרו-ויראלי המבטא אנטיגן T גדול SV40 ואחריו בחירה עם 4 mM Histidinol במשך 3 שבועות.
<ol><li>תאי תרבית בלוחות תרבית רקמות המכילים את מדיום הנשר המותאם (DMEM) של Dulbecco המכיל 1 גרם / L גלוקוז, 1% גלוטמין, 1% פניצילין-סטרפטומיצין, ו 10% סרום בקר עוברי (FBS) (ראה טבלת חומרים), בחממה לחה עם 5% CO2 ב 37 °C (37 °FC).</li>
	<li>תרבית את התאים עד למפגש של 90%-95% ותתפצל ביחס של 1:5 כל 2-3 ימים.</li>
</ol>2. ציפוי צלחת תחתית זכוכית
הערה: ציפוי צלחת תחתון זכוכית צריך להתבצע במכסה המנוע תרבית הרקמות בתנאים סטריליים.
<ol><li>מוסיפים 2 מ"ל של תמיסת HCl 1N במרכז צלחת זכוכית תחתונה (שולחן של חומרים) ודגור במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר (RT). הערה: שלב זה נועד להסיר שאריות מהזכוכית שעלולות להפריע להדמיה מאוחר יותר.</li>
	<li>לשטוף את צלחת הזכוכית התחתונה שלוש פעמים עם 2 מ"ל של 1x PBS (שולחן של חומרים) כל אחד.</li>
	<li>לדלל פיברונקטין (ראה טבלת חומרים) ל 10 מיקרוגרם / מ"ל ב 1x PBS. מוסיפים 200 μL של פתרון פיברונקטין מדולל למרכז הזכוכית של המנה. דגירה ב 37 °C ((אינקובטור תרבות רקמות) במשך 1 שעות. הערה: לחלופין, ניתן לדגור את המנה עם תחתית הזכוכית במהלך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס על משטח שטוח.</li>
	<li>במהלך זמן הדגירה של ציפוי פיברונקטין, הכן פתרון 1% BSA (טבלת חומרים) ב- 1x PBS, סנן דרך 0.2 מיקרומטר, ודנטורה על ידי דגירה ב 70 °C (70 °F) במשך 30 דקות באמבט מים שחומם מראש.</li>
	<li>לשטוף את צלחת הזכוכית התחתונה מצופה שלוש פעמים עם 2 מ"ל של 1x PBS כל אחד.</li>
	<li>הוסף 2 מ"ל של פתרון BSA denatured למרכז הזכוכית ודגר במשך 1 שעה ב 37 °C (חממה תרבית רקמות). הערה: לחלופין, ניתן לדגור את המנה עם תחתית הזכוכית במהלך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס על משטח שטוח.</li>
	<li>לשטוף את צלחת הזכוכית התחתונה 3 פעמים עם 2 מ"ל של 1x PBS כל אחד. הערה: דגירה של מנות תחתית זכוכית עם פיברונקטין צריך להתבצע לפחות 1 שעות ב 37 °C (37 °F) כדי לצפות את פני השטח כראוי. זמן דגירה קצר יותר לא יכול לייצר ציפוי מתאים, וכתוצאה מכך, פנוטיפ התא לא יכול להיות קשור להפעלה integrin. שכבת ה-BSA אינה פעילה ולא תשפיע על דינמיקת הבליטה ונועדה לחסום אתרים פוטנציאליים חופשיים להידבקות תאים בלתי תלויה אינטגרין. ה- BSA חייב להיות denatured לפני הציפוי כדי למנוע ממנו גרימת אפופטוזיס התא, אשר יכול להשפיע על דינמיקה של קצה התא.</li>
</ol>3. הכנת תאים להדמיה
<ol><li>16 עד 18 שעות לפני הניסוי, צלחת התאים כדי להגיע 70%-80% מפגש ביום שלמחרת. עבור MEFs, צלחת 0.7 x 106 תאים לכל צלחת תרבית רקמות בקוטר 10 ס"מ יום לפני ביצוע הניסוי. הערה: לניסוי בליטה מוצלח, חשוב שהתאים ישמשו במהלך שלב הגדילה הלוגריתמי שלהם. כדי להשיג זאת, תאים צריכים להגיע 70%-80% מפגש ביום הניסוי. צפיפות גבוהה יותר של תאים תגרום לזמן התפשטות ארוך יותר ו/או מכשול בהחזקה במהלך הניסוי.</li>
	<li>ביום הניסוי, מוסיפים 2 מ"ל של תמיסת טריפסין (טבלת חומרים) לכל צלחת תרבית רקמות בקוטר 10 ס"מ ודוללים במשך 2-3 דקות בחממה של תרבית רקמות עד שהתאים מתנתקים. להשבית טריפסין על ידי הוספת 5 מ"ל של המדיום המלא.</li>
	<li>לספור את התאים באמצעות hemocytometer צלחת 20,000 תאים ב 2 מ"ל של המדיום השלם על צלחת זכוכית התחתונה מצופה כנ"ל (סעיף 2). הערה: מספר התאים לציפוי תלוי בגודל ובסוג התאים. עבור תאים גדולים יותר או יותר, צלחת רק 10,000 תאים יש מספיק תאים להדמיה. חשוב לבחור תאים בודדים שאינם נוגעים כמגע בין תא לתא יכולים לשנות התנהגויות של הפצת תאים-מהותיים.</li>
	<li>דגירה את הכלים התחתונים זכוכית עם תאים מצופים בחממה תרבית הרקמות במשך 15 דקות. הערה: במהלך שלב זה, תאים דבקים במצע הפיברונקטין ומתפשטים עליו. בעת מדידת בליטות במהלך התפשטות התא, יש לאפשר לתאים להתפשט במשך 15 דקות לאחר הציפוי ולפני ההדמיה. הדמיה יכולה להתבצע בתוך חלון זמן בין 15 דקות ל ~ 1 שעה לאחר ציפוי, ובכל מקרה, לפני התאים מתחילים לנדוד.</li>
</ol>4. הגדרת מיקרוסקופ והדמיה
הערה: מערכות מיקרוסקופיות שונות של תאים חיים זמינות. המערכת המשמשת כאן היא מיקרוסקופ הפוך Leica AF6000 המצויד בפחמן דו חמצני ויחידות חימום ומחובר למצלמת CMOS דיגיטלית ORCA-Flash 4.0 V2.
<ol><li>הפעל את יחידת החימום לפחות 1 שעות לפני הדמיה והגדר אותו ב 37 °C (50 °F).</li>
	<li>הפעילו את יחידת הפחמן הדו-חמצני לפחות 10 דקות לפני ההדמיה והגדירו אותה ב-5% CO2.</li>
	<li>הפעל את המיקרוסקופ, המצלמה והמחשב.</li>
	<li>פתח את תוכנת רכישת המיקרוסקופ (ראה טבלת חומרים). בחר את התיקיה לשמירת תמונות שנלכדו והקלד שם קובץ. שמור כל סרט כקובץ חדש.</li>
	<li>הגדר את ההגדלה בעדשה יבשה פי 40, ניגודיות פאזה. הגדר את מרווח הזמן על 5 שניות, משך הסרט הכולל 10 דקות.</li>
	<li>לאחר 15 דקות דגירה של התאים מצופים, מניחים את צלחת הזכוכית התחתונה עם תאים דבוקים לתוך המתאם ולתקן אותו. הכנס את המתאם עם המנה לחריץ שלו בשלב המיקרוסקופ.</li>
	<li>מורידים את כיסוי המנה ומניחים במקום זאת את מכסה הפחמן הדו-חמצני . פתח את שסתום הפחמן הדו חמצני . הערה: ודאו שכיסוי הפחמן הדו-חמצני נקי לפני שאתם מניחים אותו על גבי המנה התחתונה מזכוכית. כיסוי מלוכלך יפחית את איכות הסרטים. נגב את החלק התחתון של מכסה CO2 עם מגבון ללא מוך ספוג ב-70% אתנול להסרת אבק ולכלוך. יש לנגב בפעם השנייה עם מגבון יבש ללא מוך.</li>
	<li>הצג את התאים ומצא תא מתאים להדמיה. ודא שהתא נמצא בפוקוס והתחל ברכישת סרטים.</li>
</ol>5. ניתוח תמונה
הערה: ניתוח תמונה מתבצע באמצעות ImageJ (טבלת חומרים) כדלקמן:
<ol><li>פתח את הסרט שנרכש ב- ImageJ.</li>
	<li>בעזרת הכלי ישר בסרגל הכלים הראשי, צור שמונה שורות של 20 יחידות שרירותיות כל אחת בניצב לבליטות, כולל ה-lamella וקצה התא, בסידור רדיאלי כל 45°, כפי שמוצג באיור 2A.</li>
	<li>בסרגל הכלים הראשי, עבור אל תמונה > ערימות >. זה יניב תמונת קימוגרפיה, המתארת את התנועה של נקודות בודדות בתוך קרום התא (איור 2B). יש לבצע פעולה זו עבור כל שורה מתוך שמונה השורות בנפרד.</li>
	<li>חלץ וספור ידנית מתמונות הקימוגרף המתאימות את מספר הבלטות, הנסיגה והקפלים בכל אחד משמונת האזורים בתא, המסומנים על-ידי קווי הרשת. מספרים אלה מייצגים את תדירות הבלטות, הנסיגה והקפלים לכל 10 דקות (איור 2C, D). הערה: ניתן להבחין בין קפלים למבנים אחרים בהתבסס על המראה הכהה שלהם במיקרוסקופיה ניגודית פאזה ותנועתם הצנטריפטלית, שמתחילה בקצה התא ומסתיימת בגבול גוף התא, אשר ניתן לראות בסרטים שנרכשו. שים לב, כאשר מכמתים בליטה, נסיגה ותדירות וולאנים, יש לראות בסרטים בקרה לכימות ובמיוחד להגדרת קפלים.</li>
	<li>קבע את התמדה הבליטה, המרחק והמהירות על-ידי ניתוח קימוגרפיה. עבור כל אחת מהקימוגרפיות שנוצרו, ציר ה- X מייצג מרחק וציר ה- Y מייצג זמן.</li>
	<li>כדי למדוד מרחק בליטה, בצע את השלבים 5.6.1-5.6.2.<ol>
<li>צייר קו מאונך מבסיס הבליטה לפסגה הגבוהה ביותר של הבליטה. הקש M ב- ImageJ כדי למדוד את אורך הקו בפיקסלים.</li>
		<li>להמרת האורך מפיקסלים למיקרומטר, ודאו שיחס הפיקסל למיקרומטר ידוע. הערה: יחס המיקרומטר לפיקסל הוא האורך הפיזי של פיקסל במצלמת CCD / הגדלה כוללת. גודל הפיקסלים אופייני לכל סוג של מצלמה. לדוגמה, עבור המצלמה המשמשת במחקר זה, גודל הפיקסלים הוא 6.5 מיקרומטר x 6.5 מיקרומטר, האורך הפיזי הוא 6.5 מיקרומטר וההגדלה בה השתמשנו היא 40x. לכן, יחס המיקרומטר לפיקסל של המצלמה שלנו הוא 0.1625 מיקרומטר /פיקסל. בניתוח, עבור קו באורך של 30 פיקסלים, מרחק הבליטה יהיה 30 פיקסלים x 0.1625 מיקרומטר / פיקסל = 4.875 מיקרומטר (איור 3).</li>
	</ol></li>
	<li>כדי למדוד את זמן הבליטה (התמדה; משך הזמן שהבלטה מבלה בבליטה לפני החזרה), בצע את השלבים 5.7.1-5.7.2.<ol>
<li>צייר קו אופקי מתחילת הבליטה (משמאל לימין) לאזור הפסגה הגבוהה ביותר. הקש M ב- ImageJ כדי למדוד את אורך הקו בפיקסלים.</li>
		<li>להמרת האורך מפיקסלים לדקות, חשבו את יחס הפיקסל לדקה. ערך זה תלוי במרווח הזמן בין התמונות. הערה: בדוגמה זו, המרווח בין התמונות הוא 5 s, יחס המינימום/פיקסל הוא 0.0833 ואורך הקו האופקי הוא 8 פיקסלים. לכן, זמן הבליטה הוא 8 פיקסלים x 0.0833 דקה /פיקסל = 0.6664 דקה.</li>
	</ol></li>
	<li>מדוד וחשב את זמן הנסיגה בדומה לזמן הבליטה עבור קו שצויר אופקית בבסיס הבליטה שממנו שיא הבליטה הוא לבסיסו מימין (קו X2 באיור 3).</li>
	<li>חשב את מהירות הבליטה על-ידי חלוקת מרחק הבליטה לפי זמן בליטה. חשב את מהירות הנסיגה על-ידי חלוקת מרחק הבליטה על-ידי זמן נסיגה. בדוגמה זו, מהירות הבליטה מחושבת כ- 4.875 מיקרומטר / 0.6664 דקות = 7.315 מיקרומטר / דקה, ומהירות הנסיגה זהה מכיוון שהקו המייצג את הזמן הוא באותו אורך. הערה: בהשוואת סוגי תאים שונים, כלומר, תאים המבטאים סוג בר ומבנים מוטנטיים של אותו חלבון, חובה לבצע ניתוח עיוור, כך שלא תוכנס הטיה.</li>
</ol>

<ol><li>Kurosaka, S., Kashina, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+embryonic+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Research+Part+C+-+Embryo+Today%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cell biology of embryonic migration.</a> Birth Defects Research Part C - Embryo Today: Reviews. 84 (2), 102-122 (2008).</li>
<li>Pollard, T. D., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+motility+driven+by+assembly+and+disassembly+of+actin+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments.</a> Cell. 112 (4), 453-465 (2003).</li>
<li>Ponti, A., Machacek, M., Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+distinct+actin+networks+drive+the+protrusion+of+migrating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two distinct actin networks drive the protrusion of migrating cells.</a> Science. 305 (5691), 1782-1786 (2004).</li>
<li>Chesarone, M. A., DuPage, A. G., Goode, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unleashing+formins+to+remodel+the+actin+and+microtubule+cytoskeletons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Unleashing formins to remodel the actin and microtubule cytoskeletons.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (1), 62-74 (2010).</li>
<li>Chesarone, M. A., Goode, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+nucleation+and+elongation+factors%3A+mechanisms+and+interplay%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Actin nucleation and elongation factors: mechanisms and interplay.</a> Current Opinion in Cell Biology. 21 (1), 28-37 (2009).</li>
<li>Lee, J. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLee%2C+JM+%22The+Actin+Cytoskeleton+and+the+Regulation+of+Cell+Migration.+Colloquium+series+on+building+blocks+of+the+cell%3A+cell+structure+and+function%22">The Actin Cytoskeleton and the Regulation of Cell Migration. Colloquium series on building blocks of the cell: cell structure and function</a>. , Morgan and Claypool Life Sciences, Morgan and Claypool Publishers. (2013).</li>
<li>Giannone, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lamellipodial+actin+mechanically+links+myosin+activity+with+adhesion-site+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Lamellipodial actin mechanically links myosin activity with adhesion-site formation.</a> Cell. 128 (3), 561-575 (2007).</li>
<li>Tojkander, S., Gateva, G., Lappalainen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+stress+fibers--assembly%2C+dynamics+and+biological+roles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Actin stress fibers--assembly, dynamics and biological roles.</a> Journal of Cell Science. 125, Pt 8 1855-1864 (2012).</li>
<li>Wilson, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+II+contributes+to+cell-scale+actin+network+treadmilling+through+network+disassembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Myosin II contributes to cell-scale actin network treadmilling through network disassembly.</a> Nature. 465 (7296), 373-377 (2010).</li>
<li>Chhabra, E. S., Higgs, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+many+faces+of+actin%3A+matching+assembly+factors+with+cellular+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The many faces of actin: matching assembly factors with cellular structures.</a> Nature Cell Biology. 9 (10), 1110-1121 (2007).</li>
<li>Hinz, B., Alt, W., Johnen, C., Herzog, V., Kaiser, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+lamella+dynamics+of+cultured+cells+by+SACED%2C+a+new+computer-assisted+motion+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Quantifying lamella dynamics of cultured cells by SACED, a new computer-assisted motion analysis.</a> Experimental Cell Research. 251 (1), 234-243 (1999).</li>
<li>Bear, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonism+between+Ena%2FVASP+proteins+and+actin+filament+capping+regulates+fibroblast+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Antagonism between Ena/VASP proteins and actin filament capping regulates fibroblast motility.</a> Cell. 109 (4), 509-521 (2002).</li>
<li>Jacks laboratory protocol. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://jacks-lab.mit.edu/protocols/making_mefs">http://jacks-lab.mit.edu/protocols/making_mefs</a> (2021).</li>
<li>Doggett, T. M., Breslin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+the+actin+cytoskeleton+in+live+endothelial+cells+expressing+GFP-actin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP-actin.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3187(2011).</li>
<li>Miller, A. L., Wang, Y., Mooseker, M. S., Koleske, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Abl-related+gene+%28Arg%29+requires+its+F-actin-microtubule+cross-linking+activity+to+regulate+lamellipodial+dynamics+during+fibroblast+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Abl-related gene (Arg) requires its F-actin-microtubule cross-linking activity to regulate lamellipodial dynamics during fibroblast adhesion.</a> Journal of Cell Biology. 165 (3), 407-419 (2004).</li>
<li>Bryce, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortactin+promotes+cell+motility+by+enhancing+lamellipodial+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Cortactin promotes cell motility by enhancing lamellipodial persistence.</a> Current Biology. 15 (14), 1276-1285 (2005).</li>
<li>Lapetina, S., Mader, C. C., Machida, K., Mayer, B. J., Koleske, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arg+interacts+with+cortactin+to+promote+adhesion-dependent+cell+edge+protrusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Arg interacts with cortactin to promote adhesion-dependent cell edge protrusion.</a> Journal of Cell Biology. 185 (3), 503-519 (2009).</li>
<li>Miller, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+actin+polymerization+and+adhesion-dependent+cell+edge+protrusion+by+the+Abl-related+gene+%28Arg%29+tyrosine+kinase+and+N-WASp%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Regulation of actin polymerization and adhesion-dependent cell edge protrusion by the Abl-related gene (Arg) tyrosine kinase and N-WASp.</a> Biochemistry. 49 (10), 2227-2234 (2010).</li>
<li>Lukic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyk2+regulates+cell-edge+protrusion+dynamics+by+interacting+with+Crk%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Pyk2 regulates cell-edge protrusion dynamics by interacting with Crk.</a> Molecular Biology of the Cell. , (2021).</li>
</ol>

למחברים אין ניגוד אינטרסים לחשוף.

דינמיקת בליטה בקצה התא, המורכבת מהבלטות, נסיגה וקפלים, היא גם תנאי מוקדם וגם אירוע פוטנציאלי להגבלת קצב בתנועתיות התאים. כאן אנו מתארים שיטה מהירה ופשוטה למדידת הדינמיקה של בליטות בקצה התא במהלך ההתפשטות. שיטה זו מאפשרת הדמיה לזמן קצר, מייצרת כמות משמעותית של נתונים, אינה דורשת תיוג פלואורסצנטי של תאים או ציוד מיקרוסקופיה פלואורסצנטי יקר, ויכולה לשמש כשיטה ראשונית לבדיקת דינמיקה של שלד ציטוסקיל המעורבת בתנועתיות התאים לפני שתחליט לבצע שיטות תובעניות יותר למשאבים. יתר על כן, ניתן להשתמש בתאי נוקאאוט או נוקאאוט ו /או מוטצי...

הגירת תאים היא תהליך קריטי השולט בהתפתחות ובתפקוד של כל האורגניזמים החיים. נדידת תאים מתרחשת הן במצבים פיזיולוגיים, כגון עוברים, ריפוי פצעים ותגובה חיסונית, והן במצבים פתולוגיים, כגון גרורות סרטן ומחלות אוטואימוניות. למרות ההבדלים בסוגי התאים שלוקחים חלק באירועים נודדים שונים, כל אירועי תנועתיות התאים חולקים מנגנונים מולקולריים דומים, שנשמרו באבולוציה מפרוטוזואה ליונקים, וכוללים מנגנוני בקרה ציטו-שלדיים נפוצים שיכולים לחוש את הסביבה, להגיב לאותותים ולווסת את התנהגות התאים בתגובה1.
שלב ראשוני בנדידת תאים יכול להיות היווצרות של בליטות דינמיות מאוד בקצה המוביל של התא. מאחורי lamellipodium ניתן למצוא את lamella, אשר זוגות פועלים כדי myosin II בתיווך התכווצות ומתווך הידבקות למצע הבסיסי. Lamellipodia מושרה על ידי גירויים חוץ תאיים כגון גורמי גדילה, ציטוקינים, קולטני הידבקות תאים, מונעים על ידי פילמור actin, אשר מספק את הכוח הפיזי שדוחף את קרום הפלזמה קדימה2,3. חלבונים רבים מאותתים ומבניים היו מעורבים בכך; ביניהם הם Rho GTPases, אשר פועלים בתיאום עם אותות אחרים להפעלת חלבונים מווסת actin כגון קומפלקס Arp 2/3, חלבונים משפחתיים WASP, ובני משפחות פורמן וספיר ב lamellipodia2,4,5.
בנוסף פילמור אקטין, פעילות myosin II נדרשת ליצירת כוחות התכווצות ב lamellipodium ואת lamella הקדמי. התכווצויות אלה, המוגדרות גם כנסיגה בקצה התא, יכולות גם לנבוע מדה-פילמוריזציה של אקטין דנדריטי בפריפריה של התא והן קריטיות לפיתוח הקצה המוביל של lamellipodial ולאפשר לבלט לחוש את הגמישות של המטריצה החוץ-תאית ותאים אחרים ולקבוע את כיוון הנדידה6,7,8 . בליטות בקצה התא שאינן יכולות להיצמד למצע ייצרו קפלים של קרום היקפי, מבנים דמויי גיליון המופיעים על פני השטח הגחוניים של lamellipodia ו lamella ולנוע אחורה ביחס לכיוון הנדידה. כאשר הלמליפודיום אינו מתחבר למצע, נוצר מתחתיו למליפודיום אחורי ודוחף באופן מכני את הלאמליפודיום הראשון לכיוון פני השטח הגחוניים העליונים. חוטי האקטין בקפלים שבעבר היו מקבילים למצע הופכים כעת לאנכים לו, והרכישה ממוקמת כעת מעל למליפודיום המתקדם. ההמולה הנעה אחורה חוזרת לציטוסול ומייצגת מנגנון תאי למיחזור אקטין לאמליפודיאלי9,10.
כאן, אנו מתארים בדיקה למדידה של דינמיקת בליטה בקצה התא. בדיקת הבליטה משתמשת במיקרוסקופיית וידאו לשגות זמן כדי למדוד דינמיקת בליטה בקצה תא בודד במשך 10 דקות במהלך שלב ההתפשטות של התא. דינמיקת בליטה מנותחת על ידי יצירת kymographs מסרטים אלה. באופן עקרוני, קימוגרף מקנה נתונים כמותיים מפורטים של חלקיקים נעים בעלילה מרחבית כדי להניב הבנה איכותית של הדינמיקה של קצה התא. עוצמת החלקיק הנע מותווה עבור כל ערימות התמונה בזמן לעומת תרשים חלל, כאשר ציר ה- X וציר ה- Y מייצגים זמן ומרחק, בהתאמה11. שיטה זו משתמשת בניתוח קימוגרפיה ידני עם ImageJ כדי לקבל נתונים כמותיים מפורטים, המאפשרים אחזור מידע מסרטים ותמונות במקרה של יחס אות לרעש נמוך ו/או צפיפות תכונות גבוהה, וניתוח תמונות שנרכשו במיקרוסקופיית אור ניגודיות פאזה או באיכות תמונה ירודה.
בדיקת הדינמיקה של בליטה בקצה התא המתוארת כאן היא שיטה מהירה, פשוטה וחסכונית. ככזה, ומכיוון שהוא הוכח בקורלציה ישירה עם העברת תאים11,12, זה יכול לשמש כשיטה ראשונית לבדיקת דינמיקה של שלד cytoskeal מעורב תנועתיות התא לפני שתחליט לבצע שיטות תובעניות יותר משאבים. יתר על כן, הוא גם מאפשר מדידה כמותית של האופן שבו מניפולציות גנטיות (נוקאאוט, נוקאאוט או מבני הצלה) של חלבונים ציטוסקיליים משפיעים על הדינמיקה של השלד באמצעות פלטפורמה פשוטה. הבדיקה היא מודל מאלף לחקר הדינמיקה של השלד הציטוטי בהקשר של נדידת תאים ויכולה לשמש להבהרת המנגנונים והמולקולות שבבסיס תנועתיות התאים.

<table><tbody><tr><td>צלחות תרבית תאים 10 ס"מ</td><td>Greiner</td><td>P7612-360EA</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' מדיום נשר מותאם (DMEM)</td><td>תעשיות ביולוגיות, ישראל</td><td>01-055-1A</td><td>מדיום מכיל גלוקוז גבוה (4.5 גרם/ליטר D-גלוקוז)</td></tr><tr><td>Dulbecco' s תמיסת מלח חוצצת פוספט (1xDPBS)</td><td>תעשיות ביולוגיות, ישראל</td><td>02-023-1A</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>תעשיות ביולוגיות, ישראל</td><td>04-001-1A</td><td></td></tr><tr><td>פיברונקטין מפלזמה אנושית, נוזלי, 0.1%, מתאים לתרבית תאים</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0895</td><td></td></tr><tr><td>כלי תחתית זכוכית</td><td>Cellvis</td><td>D35-20-1.5-N</td><td>צלחת תחתית זכוכית 35 מ"מ, גודל צלחת 35 מ"מ, גודל באר 20 מ"מ, זכוכית כיסוי #1.5 (0.16-0.19 מ"מ).</td></tr><tr><td>תוכנת ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>Feely זמינה בכתובת:</td></tr><tr><td>https://imagej.nih.gov/ij/download.html LAS-AF Leica Application Suite 3.2</td><td></td><td></td><td>תוכנת רכישת מיקרוסקופ המצוידת במיקרוסקופ CMOS דיגיטלי ORCA-Flash 4.0 V2</td></tr><tr><td>Leica AF6000</td><td>Leica</td><td></td><td>מיקרוסקופ שדה בהיר הפוך (40x, NA 1.3) מצויד באופטיקה עם ניגודיות פאזה, חממה ויחידת CO2 עם תוכנת רכישת LAS AF המצוידת ב מצלמת CMOS דיגיטלית ORCA-Flash 4.0 V2 .</td></tr><tr><td>תמיסת L-גלוטמין</td><td>תעשיות ביולוגיות, ישראל</td><td>03-020-1B</td><td></td></tr><tr><td>מצלמת CMOS דיגיטלית ORCA-Flash 4.0 V2</td><td>Hamamatsu Photonics תמיסת</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>תעשיות ביולוגיות, ישראל</td><td>03-031-1B</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת טריפסין-EDTA B (0.25%), EDTA (0.05%)</td><td>תעשיות ביולוגיות, ישראל</td><td>03-052-1A</td><td></td></tr></tbody></table>

מדידת דינמיקת בליטה בקצה התא במהלך ההתפשטות באמצעות מיקרוסקופיה של תאים חיים

Measuring Cell-Edge Protrusion Dynamics during Spreading using Live-Cell Microscopy

ההתפתחות וההומיאוסטזיס של אורגניזמים רב-תאיים מסתמכים על רגולציה מתואמת של נדידת תאים. נדידת תאים היא אירוע חיוני בבנייה והתחדשות של רקמות, והיא קריטית בהתפתחות העוברית, בתגובות אימונולוגיות ובריפוי פצעים. דיסרגציה של תנועתיות התא תורמת להפרעות פתולוגיות, כגון דלקת כרונית וגרורות סרטן. נדידת תאים, פלישת רקמות, אקסון וצמיחת דנדריט יוזמות כולן עם בליטות של קצה התא בתיווך אקטין פילמור. כאן אנו מתארים שיטה פשוטה, יעילה וחוסכת זמן להדמיה וניתוח כמותי של דינמיקת בליטה בקצה התא במהלך ההתפשטות. שיטה זו מודדת תכונות נפרדות של דינמיקת קרום קצה התא, כגון בליטות, נסיגה וקפלים, וניתן להשתמש בה כדי להעריך כיצד מניפולציות של רגולטורים actin מפתח להשפיע על בליטות קצה התא בהקשרים מגוונים.

בניסוי המתואר באיור 2, MEFs מונצחים היו מצופים על כלים עם תחתית זכוכית מצופים מראש בפיברונקטין כדי להפעיל איתותים בתיווך אינטגרין, שנחסמו על ידי BSA מפוטר, כדי לחסום אתרים פוטנציאליים חופשיים להידבקות בתאים שאינם תלויים בהפעלה אינטגרית. כדי להגיע לשלב הצמיחה הלוגריתמי במפגש של 70%-80% של תאים ביום הניסוי, 0.7 x 106 MEFs היו מצופים בלוח תרבית רקמות בקוטר 10 ס"מ 16 שעות לפני הניסוי. ביום הניסוי, תאים עברו טריפסין ונספרו, ו-20,000 תאים היו מצופים בצלחת זכוכית מצופה פיברונקטין/BSA. המ...

פרוטוקול זה נועד למדוד את הפרמטרים הדינמיים (בליטות, נסיגה, קפלים) של בליטות בקצה של תאים מתפשטים.

The development and homeostasis of multicellular organisms rely on coordinated regulation of cell migration. Cell migration is an essential event in the ...

בדיקת הבליטה של קצה התא הוכחה כמתאמת ישירות עם העברת תאים. לכן זה יכול לשמש כשיטה ראשונית לזיהוי חלבונים קריטיים ומנגנוני איתות המעורבים תנועתיות התא. השיטה מהירה, פשוטה, חסכונית ואינה דורשת תיוג פלואורסצנטי או שימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי יקר.מי שתדגים את ההליך תהיה מיכל גנדלר, סטודנטית מהמעבדה שלי. מוסיפים שני מיליליטרים של תמיסת חומצה הידרוכלורית רגילה אחת במרכז צלחת תחתונה מזכוכית ודגורים במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את המנה שלוש פעמים עם שני מיליליטר של PBS.מדללים פיברונקטין בריכוז של 10 מיקרוגרם למיליליטר ב-PBS ומוסיפים 200 מיקרוליטרים של התמיסה המדוללת לצלחת מרכז הזכוכית. דגירה במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס. הכן פתרון 1%BSA ו- PBS והעבר אותו דרך מסנן 0.2 מיקרומטר.Denature את הפתרון על ידי דגירה ב 70 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות באמבט מים שחומם מראש. לשטוף את צלחת הזכוכית התחתונה מצופה עם שני מיליליטר של PBS שלוש פעמים. מוסיפים שני מיליליטר של תמיסת BSA מפורקת ודוללים את המנה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת.לשטוף את צלחת הזכוכית עם שני מיליליטרים של PBS שלוש פעמים. לפני 16 עד 18 שעות של ניסוי ב 0.7 מיליון תאים לכל צלחת תרבית רקמות בקוטר 10 ס"מ כדי להשיג 70 עד 80% מפגש. למחרת, מוסיפים שני מיליליטר של פתרון טריפסין לצלחת תרבית הרקמה ודגרים במשך שתיים עד שלוש דקות עד שהתאים מתנתקים.הוסף חמישה מיליליטר של המדיום כדי להשבית את הטריפסין. באמצעות hemacytometer, לספור את התאים צלחת 20, 000 תאים בשני מיליליטר של המדיום השלם בצלחת התחתונה. לאחר מכן לדגור על המנה עם תאים מצופים באינקובטור במשך 15 דקות.הפעל את יחידת החימום והגדר אותה ב 37 מעלות צלזיוס שעה אחת לפני הדמיה. כמו כן, להפעיל את יחידת דו תחמוצת הפחמן ולהגדיר אותו ב 5%10 דקות לפני הדמיה. הפעל את המיקרוסקופ והמצלמה.הפעל את המחשב ופתח את תוכנת רכישת המיקרוסקופ. הגדר את ההגדלה על ניגודיות פאזה של עדשה יבשה פי 40. הגדר את משך הסרט הכולל ל- 10 דקות עם מרווח זמן של חמש שניות.לאחר 15 דקות של דגירה, מניחים את צלחת הזכוכית התחתונה עם תאים דבוקים לתוך מתאם ולתקן את זה. הכנס את המתאם עם המנה לחריצים בשלב המיקרוסקופ. מורידים את כיסוי המנה, מניחים את מכסה הפחמן הדו-חמצני ופותחים את שסתום הפחמן הדו-חמצני.אתר תא מתאים להדמיה. התחל רכישת סרטים לאחר התמקדות בתא. כדי לבצע את ניתוח התמונה, בחר את הכלי הישר בתוכנת ניתוח התמונה והפוך שמונה שורות של 20 יחידות שרירותיות בניצב לבליטות בסידור רדיאלי בכל 45 מעלות, כולל lamella וקצה תא.בסרגל הכלים הראשי, עבור אל תמונה, בחר ערימות ולאחר מכן לחץ על Reslice כדי ליצור תמונת kymograph המתארת את התנועה של נקודות בודדות בתוך קרום התא. באמצעות תמונות kymograph, לחלץ ולספור באופן ידני את מספר בליטות, נסיגה וקפלים בכל אחד משמונת האזורים בתא מסומן על ידי קווי הרשת. מספרים אלה מייצגים את התדירות של בליטות, נסיגה וקפלים לכל 10 דקות.קבעו את התמדה הבליטה, המרחק והמהירות על ידי ניתוח קימוגרפיה. כדי לקבוע את מרחק הבליטה, לצייר קו מאונך מבסיס הבליטה אל הפסגה הגבוהה ביותר של הבליטה. הקש M כדי למדוד את אורך הקו בפיקסלים וודא שיחס הפיקסל למיקרומטר ידוע כממיר את האורך במיקרומטרים.כימות הבלטות, התגובות והקפלים בוצע באופן ידני לכל 10 דקות והתדירות הממוצעת שהושגה עבור בליטות ונסיגה הייתה 5.1 ו -2.1 לקפלים. לקימוגרפיה הייצוגית היה מרחק בליטה של כ-4.8 מיקרומטר וזמן בליטה של כ-0.6 דקות. דוגמה לתא שיש לא לכלול בניתוח מיוצגת.ניתוח הקימוגרף גילה כי התא לא היה נוכח בשלב ההתפשטות שלו ולא הראה בליטות ממברנה ברורות. הדבר החשוב ביותר הוא לבחור תאים נכונים להדמיה. תא תקין צריך להיות בשלב ההתפשטות שלו ולא צריך לגעת בתאים אחרים כדי למנוע תקשורת תא-תא ואיתות.השיטה יכולה לשמש ככלי ראשוני לבדיקת דינמיקה של שלד ציטו-שלד המערבת תנועתיות תאים לפני שתחליט לבצע תוצאות נוספות הדורשות בדיקות של העברת תאים.

measuring-cell-edge-protrusion-dynamics-during-spreading-using-live

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הדמיה מיקרוסקופית של תאים אנדותל לחיות להביע GFP-אקטין מאפשר אפיון של שינויים דינמיים מבנים cytoskeletal. שלא כמו טכניקות להשתמש דגימות קבוע, שיטה זו מספקת הערכה מפורטת של השינויים הזמני cytoskeleton אקטין בתאי אותו לפני, במהלך ואחרי גירויים פיזיים, תרופתי, או דלקתיים שונים.

עיון cytoskeleton אקטין ב לתאי אנדותל חיים הבעת GFP-אקטין

פרוטוקול הדמיה חדשני פותח באמצעות מפעיל מכני מונע מנוע מותאם אישית כדי לאפשר מדידה של תגובות בזמן אמת למתח מכני בתאים חיים. רלוונטית למכניוביולוגיה, המערכת יכולה ליישם זנים של עד 20% תוך שהיא מאפשרת הדמיה כמעט בזמן אמת עם מיקרוסקופ כוח קונפוקלי או אטומי.

הדמיה של תא חי במהלך מכאני למתוח

אנו מציגים פתרון תוכנה למעקב חצי אוטומטי של ריכוז חלבון יחסי לאורך של בליטות תאיות דינמיות.

ממשק משתמש גרפי למעקב בסיוע תוכנה של ריכוז חלבון בהפרעות ניידות דינמיות

כאן, אנחנו מפרטים את הטכניקות ניסיוני המשמשים להערכת כוחות בליטה podosomes להחיל על סרט תואם, משלב הכנת הסרט לניתוח אוטומטי של תמונות הטופוגרפי.

בליטה מיקרוסקופ כוח: שיטה לכמת כוחות שפותחה על ידי בליטות תא

נתאר כמה מיקרו - photomanipulation טכניקות כגון FRAP photoactivation לאפשר קביעת פרמטרים תנועתיות ואת הדינמיקות ייתכן של חלבונים בתוך מעביר תאים. ניסיוני הקריאות הבאות כוללות דינמיקה subcellular מחזור של הרגולטורים תנועתיות או של שלד התא המשמש כבסיס של אקטין.

בטכניקות המיקרומניפולציה המאפשר ניתוח של דינמיקה Morphogenetic מחזור של הרגולטורים Cytoskeletal

באמצעות התקן שתוכנן בעבר כדי להחיל זן מכני לתאים חסיד, נייר זה מתאר גיאומטריה תת שכבה מחדש מכשיר מותאם אישית עבור ברזולוציה גבוהה תא יחיד הדמיה של תאים מתוחים עם המטרה טבילה 100x שמן.

ברזולוציה גבוהה הדמיה של דינמיקה גרעינית בתאים חיים תחת מתיחה Uniaxial המתח

שיטה זו שימושית לכמת את הדינמיקה המוקדמת של הדבקה תאית והפצת תאים התלויים באנקורג ' בתוך הפיברוטין. יתר על כן, שינוי זה ניתן להשתמש כדי לחקור את ההשפעות של שינוי הומאוסטזיס מחדש על התפשטות התא ו/או הדבקה תא הקשורות מסלולים תאיים איתות.

בחינת הדינמיקה של הדבקה תאית והפצת תאים אפיתל על Fibronectin במהלך לחץ חמצוני

הדמיה חיה של אקסוציטוזיס ליזומלי על תאים מיקרו-פטרניים מאפשרת כימות מרחבית של תהליך זה. נורמליזציה מורפולוגית באמצעות מיקרו-פטרנים היא כלי יוצא מן הכלל לחשיפת כללים כלליים לגבי ההפצה המרחבית של תהליכים סלולריים.

כימות פרמטרים Spatiotemporal של אקסוציטוזיס תאי בתאים Micropatterned

בפרוטוקול זה, אנו מציגים את ההליכים הניסיוניים של בדיקה מתפשטת של תא המבוססת על מיקרוסקופיה של תאים חיים. אנו מספקים כלי חישובי קוד פתוח עבור פילוח משוחד של תאים בעלי תווית פלואורסצנטית וניתוח כמותי של דינמיקת lamellipodia במהלך התפשטות התא.

ניתוח כמותי של דינמיקת קצה התא במהלך הפצת תאים

מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט של צעדים כיצד להשתמש במערכת רב-תכליתית משולבת הניתנת לתכנות על-ידי המשתמש המאפשרת הדמיה רב-ערוצית אוטומטית וניתוח מכנוביולוגי כדי להבהיר את הרגישות המכנית של חלבון הקשור ל-Yes (YAP).

חקירה מכנוביולוגית כל אופטית של חלבון הקשורים כן בסרטן אנושי ותאים רגילים באמצעות מערכת רב תפקודית

כאן, אנו מציגים מכשיר מתיחה שווה צירי רב-תכליתי המופעל פניאומטית ותואם למיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה.

מכשיר מתיחה שווה צירי למיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונפוקלית של תאים חיים בהגדלה גבוהה

למד מדידת דינמיקת בליטות בקצה תאים מתפשטים באמצעות מיקרוסקופיה של תאים חיים וניתוח קימוגרפיה. שיטה זו מאפשרת זיהוי חלבונים ומנגנוני סיגנל קריטיים בתנועתיות תאים ללא צורך בתיוג פלואורסצנטי.

מדידת דינמיקת בליטה בקצה התא במהלך ההתפשטות באמצעות מיקרוסקופיה של תאים חיים

גלה סרטונים נוספים