השיטה לחזות ולנתח חלבוני אינטראקצית ממברנה ידי הילוכים מיקרוסקופים אלקטרונים

המטרה הכוללת של הליך זה היא לדמיין את הקישור של חלבון ממברנה חיצונית על משטח ממברנת ננו-דיסק על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים להעברת כתמים שליליים כצעד ראשון לקראת קביעת מבנה ברזולוציה גבוהה של החלבון. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח במספר תחומי מחקר בכל הנוגע לפעילויות חלבון המתרחשות בקרומי התאים ועליהן. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא הערימות האופייניות של צורות ננו-דיסק אם החלבון אינו יכול להיקשר לממברנות.

ערימות אלה נראות בבירור על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת. ההשלכה של טכניקה זו משתרעת על פיתוח תרופות מכיוון שניתן לסנן בקלות תרכובות ליכולת לחסום או לאפשר אינטראקציות של חלבון הממברנה. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי התנאים האופטימליים לקשירת חלבון מונוטופי לממברנה שלך, היא גם מספקת מבנה ברזולוציה נמוכה של קומפלקס ננו-דיסק החלבון.

כדי להתחיל בהליך, יש לבטא ולטהר חלבון פיגומי ממברנה כגון MSP1E3D1. לאחר מכן, בעזרת מזרק זכוכית עם מחט מתכת, הוציאו 305 מיקרוליטר של 25 מיליגרם למיליליטר POPC בכלורופורם לבקבוק זכוכית עגול תחתון. לאדות את הכלורופורם תחת זרם עדין של גז חנקן במכסה אדים.

יבש את השומן הנותר למשך הלילה במייבש ואקום. לאחר מכן ממיסים את עוגת השומנים המיובשת ב-200 מיקרוליטר של מאגר סטנדרטי MSP מועשר ב-100 מילי-מולרי נתרן כולאט כחומר ניקוי. מערבלים את התערובת עד לשקיפות לקבלת תרחיף של 50 מילי-מולרי POPC במאגר.

לאחר מכן, שטפו חמישה גרם חרוזים הידרופוביים עם 30 מיליליטר של 100% מתנול ואז עם 40 מיליליטר מים טהורים במיוחד ולבסוף עם 10 מיליליטר של מאגר סטנדרטי MSP. אחסן את החרוזים מתחת ל -15 מיליליטר של חיץ סטנדרטי בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן שלב 190 מיקרוליטר של תמיסה של 0.124 מילי-מולרית של MSP1E3D1 ו-61.5 מיקרוליטר של תרחיף של 50 מילי-מולרי של POPC במאגר וכתוצאה מכך יחס מולרי של 1 ל-130 מולארי של MSP ל-POPC וריכוז נתרן כולאט של 25 מילי-מולארי.

היחס האידיאלי של השומן לכל MSP משתנה עם כל בחירה של סוג השומן ועדשת MSP ויש לבצע אופטימיזציה כדי להשיג הכנה הומוגנית של ננו-דיסקים. דגרו את התערובת על קרח רטוב למשך שעה. לאחר מכן הוסף את התמיסה לצינור המכיל 0.5 גרם שעועית הידרופובית שטופה למיליליטר של תערובת בנייה מחדש כדי להתחיל הרכבה עצמית של ננו-דיסק.

דגרו את התערובת בארבע מעלות צלזיוס למשך 16 שעות בשבע עד שמונה סיבובים לדקה. לאחר הדגירה, אפשר לחרוזים להתיישב על ידי כוח הכבידה. הסר ואחסן את הסופרנטנט בארבע מעלות צלזיוס עד שיהיה מוכן לבצע כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל.

לפני כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל, צנטריפוגה את התערובת ב-13,000 גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. שפכו את הסופרנטנט והשליכו את הכדור. איזון עמודת כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל עם מאגר סטנדרטי MSP עד שקו הבסיס ב-280 ננומטר יציב.

הזרקו את הסופרנטנט על העמודה ואספו את המוצר בשברים של 0.5 מיליליטר. מדוד את ספיגת השברים ב-280 ננומטר עם ספקטרופוטומטר UV vis. לחשב את ריכוז הננו-דיסקים באמצעות מקדם ההכחדה המולרית עבור ה-MSP הנבחר.

כדי לבצע אלקטרופורזה של ג'ל ללא דנטורציה, יש לערבב תחילה 15 מיקרוליטר מהדגימה עם חמישה מיקרוליטר של מאגר הטעינה המתאים. מלאו את מיכל הקתודה במאגר קתודה קל ואת מיכל האנודה במאגר פועל. טען את הדגימה על ג'ל Bis-Tris של 4 עד 16% והתחל לרוץ.

מכתים את הג'ל לפי הוראות יצרן הג'ל. כדי להתחיל בהכנה של קומפלקס חלבון מונוטופי ננו-דיסק עם חמישה ליפוקסיגנאז כחלבון, הכינו אצווה של בופר סטנדרטי MSP מועשר ב-1.5 מילי-מולרי סידן כלוריד. לשאוב ולטהר את חלבון 5LO.

הכינו מיד תערובת של 100 מיקרוליטר של 0.8 מיקרו-מולרי 5LO ו-0.8 מיקרו-מולרי ננו-דיסקים במאגר סטנדרטי MSP מועשר בסידן. הדוגמה שלנו לפרוטאינאז מונוטופי חמש ליפוקסיגנאז תלויה בכמויות הסידן כדי להיקשר לממברנה. 5LO רגיש מאוד ויש להשתמש בו תוך מספר שעות מההכנה.

דגרו את התערובת על קרח למשך 10 דקות. אחסן את דגימת קומפלקס חלבון הננו-דיסק המתקבלת בארבע מעלות צלזיוס למשך עד חודש. כדי להתחיל בהכנה לניתוח TEM, ממיסים גרם אחד של מלח נתרן פוספוטונגסטט ב-50 מיליליטר מים טהורים במיוחד בטמפרטורת החדר.

התאם את ה-pH של התמיסה ל-7.4 עם תמיסה מולרית אחת של נתרן הידרוקסיד. סנן את תמיסת הנתרן הפוספוטונגסטית דרך מסנן מזרק של 0.22 מיקרומטר ואחסן את התמיסה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, פריקה זוהרת של רשת נחושת מצופה פחמן 400 רשת למשך 20 שניות ב-30 מיליאמפר כדי להפוך את משטח הרשת להידרופילי.

הנח בין 2.5 לחמישה מיקרוליטר של דגימת קומפלקס החלבון המונוטופי של הננו-דיסק על הרשת ואפשר לדגימה לשבת במשך 30 שניות. לאחר מכן השתמש בנייר סינון כדי למחוק עודפי תמיסה מהרשת. מרחו מיד טיפה של תמיסת נתרן פוספוטונגסטט ותנו לתמיסה לשבת למשך 30 שניות.

כתם את התמיסה העודפת ואפשר לרשת להתייבש באוויר. בצע מיקרוסקופ אלקטרונים שידור עם מתח מואץ של 120 עד 200 קילו-וולט. אל תכלול תמונות המציגות ערימות ארוכות בעיבוד התמונה הבא.

עבור התמונות שנבחרו, השתמש בשיטות עיבוד סטנדרטיות כדי לקבוע את ממוצעי המחלקה וליצור מודל תלת מימד ברזולוציה נמוכה של החלבון המונוטופי הננו-דיסק. בשיטה זו הוכנו ננו-דיסקים ריקים עם יחס של 1 ל-130 של חלבוני פיגומי ממברנה לשומנים. רק שיא עיקרי אחד נצפה במהלך כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל ורק פס אחד נצפתה באלקטרופורזה של ג'ל כחול טבעי.

כאשר מטפלים בננו-דיסקים הריקים בתמיסת מלח נתרן פוספוטונגסטית, נוצרת ערימה. לאחר מכן ניתן לצפות בערימות הארוכות הללו על ידי TEM. ערימה זו לא הופרעה על ידי הכללת יוני סידן בתמיסת הננו-דיסק לפני יישום תמיסת הנתרן הפוספוטונגסטית.

כאשר חלבון מונוטופי כמו חמישה ליפוקסיגנאז נקשר למשטח הננו-דיסק, הערימה מונעת על ידי חסימה סטארית על ידי החלבון. שני הצדדים של הננו-דיסק זמינים לקשירה, ומאפשרים היווצרות של קומפלקסים של ננו-דיסק 5LO אחד לאחד ושניים לאחד. הדגימה של שניים לאחד קומפלקסים של ננו-דיסקים 5LO הציגה פחות ערימה מהדגימה של אחד לאחד.

קשירת 5LO דורשת נוכחות של יוני סידן. זה אושר על ידי תצפית על ערימה בתערובת של 5LO וננו-דיסקים ללא סידן, מה שהצביע על כך ש-5LO לא נקשר למשטחי הממברנה. לאחר הכנת החלבון המונוטופי והננו-דיסקים, ניתן לבצע הערכה של קשירת החלבון לממברנה שלך בשעות אחר הצהריים אם היא מבוצעת כראוי.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב להעריך את שטח החלבון על הננו-דיסק כדי לבחור את אורך ה-MSP הנכון. עבור גדלים מותאמים היטב, מקסימום שני חלבונים חיצוניים עשויים להיקשר אחד בכל צד של הדיסק. חשוב גם להשתמש במלח הנתרן של פוסופוטונגסטן למעמד השלילי כדי להבטיח ערימה מקסימלית שכן הקישור מאושר על ידי השוואה של היעדר ערימות לערימות הארוכות של דגימה ללא חלבון מונוטופי.

השימוש בננו-דיסקים במקום בליפוזומים מאפשר שימוש בפיזור אור דינמי, פיזור קרני רנטגן בזווית קטנה כדי לענות על שאלות נוספות לגבי הומוגניות הדגימה, גודל או מבנה מולקולרי. המבנה התלת-ממדי ברזולוציה נמוכה של חלבון ממברנה מונוטופי הקשור לננו-דיסק יכול להיות צעד ראשון נגיש בדרך למבנה ברזולוציה גבוהה של אותם חלבונים קשורים.