ניתוח מבני עמילואיד במקטע רקמה באמצעות מיקרוסקופ הדמיה פלואורסצנטי לכל החיים

קח קטע רקמה עם אגרגטים עמילואידים המייצגים משקעי חלבון חריגים.

הרקמה מוכתמת בצבע הפלואורסצנטי heptamer-formyl thiophene acidtic acid או hFTAA, אשר נקשר במיוחד למבני יריעות בטא של סיבי עמילואיד.

צלם את השקופית באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי המצויד ביחידת מיקרוסקופ הדמיה פלואורסצנטית, המודדת את אורך החיים הקרינה של מולקולות הצבע.

בצע אופטימיזציה של הגדרות המיקרוסקופ לעירור יעיל של מולקולות הצבע.

כאשר אור לייזר מאיר את הרקמה, hFTAA מעורר וזוהר.

כריכת צבע חזקה יותר במבנים קומפקטיים מביאה לתוחלת חיים ארוכה יותר, בעוד שכריכת צבע חלשה יותר במבנים פחות קומפקטיים מובילה לתוחלת חיים קצרה יותר.

מאוחר יותר, התוכנה יוצרת תמונה מקודדת צבע של הצבירה.

צבעים, כגון אדום וצהוב, מופיעים בפריפריה, ומציינים תקופות חיים פלואורסצנטיות קצרות יותר המשקפות מבני עמילואיד פחות קומפקטיים ולא יציבים.

בעוד שצבעים כמו כחול וירוק בליבה מייצגים אורך חיים ארוך יותר של פלואורסצנטיות, המשקפים מבני עמילואיד קומפקטיים ויציבים יותר.

ביום הצביעה, טבלו את החלקים באמבטיות רצופות של 99% אתנול, 70% אתנול, dH_2O ו-PBS למשך 10 דקות בכל פעם, ולאחר מכן הניחו לקטעי הרקמות להתייבש בתנאי הסביבה. בזמן שהרקמה מתייבשת, הכינו תמיסת עבודה של HFTAA על ידי דילול המלאי מ-1 עד 10,000 ב-PBS. כאשר הרקמה יבשה, הוסף טיפות של תמיסת העבודה HFTAA לכל חלק רקמה כדי לכסות אותו. דגירה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.

יש לשטוף את תמיסת הצביעה עם 500 מיקרוליטר PBS, ואז לטבול את השקופית באמבט PBS למשך 10 דקות. לאחר שאפשרת לחלק להתייבש בתנאי הסביבה, הרכבה באמצעות מדיום הרכבה פלואורסצנטי. אפשר למדיום ההרכבה להתיישב למשך הלילה.

גילוי עמילואיד יכול להתבצע ישירות לאחר ההרכבה או אפילו ללא הרכבה. עם זאת, אם מטרת הניסוי היא לאסוף מידע ספקטרלי באיכות גבוהה, עדיפה דגירה למשך הלילה.

העבר את המיקרוסקופ למצב FLIM, הגדר את חור הסיכה ל-20, את אורך גל העירור ל-490 ננומטר ואת עוצמת הלייזר ל-0.5%. השתמש בלייזרים פועמים ב-40 מגה-הרץ. בתוכנת FLIM, הגדר ספירת פוטונים מעל 550 ננומטר. בחלון פרמטרי תצוגה, עקוב אחר ספירת הפוטונים עד שהספירה המקסימלית תהיה בסביבות 4,000 ספירות פוטונים. שמור את הקובץ וייצא אותו כתמונת SPC.