מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת להדמיה של אירועים אקזוציטיים

התחל עם צלחת עם תחתית זכוכית המכילה נוירונים עובריים בקליפת המוח בשלב פלואורסצנטי השתקפות פנימי מלא או שלב מיקרוסקופ TIRF.

נוירונים אלה מבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק רגיש ל-pH או סמן שלפוחית מתויג GFP שזוהר ב-pH חוץ-תאי ניטרלי אך נשאר לא פלואורסצנטי בשלפוחיות חומציות.

עם היתוך השלפוחית עם קרום הפלזמה, חשיפה ל-pH חוץ-תאי גורמת לפלואורסצנטיות, ומסמנת את אירוע האקסוציטוזיס.

בחר את המטרה והגדר את מקדם השבירה כך שיתאים לנוירון.

כוון את קרן הלייזר בזווית לזכוכית, מה שגורם להשתקפות פנימית מוחלטת ויוצר גל חולף. גל זה מעורר באופן סלקטיבי סמני GFP ליד קרום הפלזמה.

הגדר את עומק החדירה של TIRF כך שלא יכלול סמני GFP מעל השדה החולף.

ראשית, השתמש בתאורה אפיפלואורסצנטית בשדה רחב כדי לאתר נוירונים המבטאים GFP.

לאחר מכן, עבור לתאורת TIRF לעירור ספציפי לממברנה.

רכוש תמונות זמן-lapse כדי לתעד את אירוע היתוך השלפוחית ולדמיין אקסוציטוזיס.

לאחר הגדרת מיקרוסקופ ה-TIRF והדגימה ומציאת מישור מוקד עצבי לפי פרוטוקול הטקסט, הפעל את תוכנת הלייזר והתחבר לתוכנת בקרת הלייזר. הגדר את התאורה לשדה רחב ובחר את המטרה. לאחר מכן הגדר את מקדם השבירה של הדגימה, והתאם את עוצמת הלייזר על ידי ביטול הסימון של TTL עבור לייזר 491.

אופטימיזציה של פרמטרי הדמיה חשובה במהלך הדמיה של שלפוחיות אקסוציטיות שלמות ברצפה כדי למנוע סחיפה של מיקוד, ופ