מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת להדמיה של אירועים אקזוציטיים

התחל עם צלחת עם תחתית זכוכית המכילה נוירונים עובריים בקליפת המוח בשלב פלואורסצנטי השתקפות פנימי מלא או שלב מיקרוסקופ TIRF.

נוירונים אלה מבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק רגיש ל-pH או סמן שלפוחית מתויג GFP שזוהר ב-pH חוץ-תאי ניטרלי אך נשאר לא פלואורסצנטי בשלפוחיות חומציות.

עם היתוך השלפוחית עם קרום הפלזמה, חשיפה ל-pH חוץ-תאי גורמת לפלואורסצנטיות, ומסמנת את אירוע האקסוציטוזיס.

בחר את המטרה והגדר את מקדם השבירה כך שיתאים לנוירון.

כוון את קרן הלייזר בזווית לזכוכית, מה שגורם להשתקפות פנימית מוחלטת ויוצר גל חולף. גל זה מעורר באופן סלקטיבי סמני GFP ליד קרום הפלזמה.

הגדר את עומק החדירה של TIRF כך שלא יכלול סמני GFP מעל השדה החולף.

ראשית, השתמש בתאורה אפיפלואורסצנטית בשדה רחב כדי לאתר נוירונים המבטאים GFP.

לאחר מכן, עבור לתאורת TIRF לעירור ספציפי לממברנה.

רכוש תמונות זמן-lapse כדי לתעד את אירוע היתוך השלפוחית ולדמיין אקסוציטוזיס.

לאחר הגדרת מיקרוסקופ ה-TIRF והדגימה ומציאת מישור מוקד עצבי לפי פרוטוקול הטקסט, הפעל את תוכנת הלייזר והתחבר לתוכנת בקרת הלייזר. הגדר את התאורה לשדה רחב ובחר את המטרה. לאחר מכן הגדר את מקדם השבירה של הדגימה, והתאם את עוצמת הלייזר על ידי ביטול הסימון של TTL עבור לייזר 491.

אופטימיזציה של פרמטרי הדמיה חשובה במהלך הדמיה של שלפוחיות אקסוציטיות שלמות ברצפה כדי למנוע סחיפה של מיקוד, ופוטוטוקסיות תוך הפקת תמונות של יחס אות לרעש גבוה המספיק לניתוח.

התאם את המחוון ל- 100 ולאחר מכן הורד אותו בחזרה לערך שבין 20 ל- 40. לאחר מכן בדוק שוב את TTL. לאחר מכן, התמקדו שוב בדגימה בתאורת אור משודרת.

לאחר מכן, בתוכנת ההדמיה, בחר את תאורת הלייזר 491 ופתח את התריס. הנח את המעבה הפוך על הספסל האופטי כדי לא לשרוט את העדשה. כוונן בסדר את נקודת המוקד של הלייזר על התקרה.

וכאשר הקבל, מרכז את הנקודה למרכז דיאפרגמת השדה הסגור. ואז החלף את הקבל. ובתוכנת TIRF, הגדר את עומק החדירה ל-110 ננומטר. לאחר מכן עבור מתאורת שדה רחב למצב תאורת TIRF להדמיה.

כעת, באמצעות אפיפלואורסצנציה בשדה רחב, מצא תאים המבטאים פלורין VAMP2 דרך העיניים. לאחר מכן, כדי להפחית את ההלבנה והפוטוטוקסיות, התאם את פרמטרי ההדמיה כדי למקסם את יחס האות לרעש ואת הטווח הדינמי באמצעות זמן חשיפה מינימלי ועוצמת לייזר. הגדר מיקוד אוטומטי רציף לכל תא. לאחר מכן רכוש סט תמונות זמן-lapse עם רכישה המתרחשת כל 0.5 שניות למשך 5 דקות.