ויזואליזציה של קליפת הארגון ואת הדינמיקה של מיקרואורגניזמים, באמצעות Fluorescence סה"כ פנימי מיקרוסקופית השתקפות

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להשיג תמונות באיכות גבוהה של מיקרואורגניזמים בעלי דופן תא, באמצעות פלואורסצנציה או TIRF (החזרה פנימית גבולה). זאת על ידי הכנה ראשונית של זריקות כיסויהים ותאים, ולאחר מכן כיוון מדויק של מערך המיקרוסקופ להשגת איכות תמונה אופטימלית.

בשלב הבא, נבחרים הזוויות, נקודות הפגיעה ותנאי הדמיות נכונים לצורך רכישת תמונות או סרטים. השלב האחרון הוא עיבוד לאחר הדמיה של התמונות שנרכשו. בסופו של דבר, מיקרוסקופיית turf משמשת לחקר הדינמיקה של לוקליזציית חלבונים בקורטקס התא.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות מיקרוסקופיה קונבנציונליות או קונפוקאליות הוא הניגודיות הגבוהה מאוד של התמונה במיקרוסקופיה, המאפשרת זמני רכישה מהירים וחשיפה לאור נמוכה. לפיכך, שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום חקר הממברנות, כגון מנגנוני הפרדה לטרלית של חלבונים או ניידות של חלבוני ממברנה. יש לנקות את לוחות הכיסוי (cover slips) מחלקיקי אבק לפני השימוש במיקרוסקופיה.

מכיוון ששיטת turf רגישה לאותי רקע הנובעים מאבק על לביש (cover slip) מלוכלך, נדרש לביש נקי עם פחות רקע כדי להתחיל את פרוטוקול ניקוי הלבישים. השתמשו בפינצטה כדי להניח את הלבישים במחזיק קרמי עם מכסה.

בשלב הבא, מלאו כלי זכוכית בנתרן הידרוקסיד בריכוז one molar. ניתן להשתמש בנתרן הידרוקסיד זה מספר פעמים. הניחו את מחזיק הקרמיקה המכיל את כיסויי הזריקה בתוך נתרן הידרוקסיד והדגריגו את כיסויי הזריקה למשך שעתיים תחת סיבוב רציף ואיטי.

אין לדגור למשך יותר משמונה שעות, שכן הדבר יגרום להיווצרות זכוכית כיסוי עכורה לאחר שעתיים; יש לשטוף את זכוכיות הכיסוי במים מזוקקים פעמיים למשך חמש דקות בכל פעם תחת סיבוב רציף ואיטי, ולאחסן את זכוכיות הכיסוי הנקיות במחזיק קרמי כשהן מכוסות ב-100% ethanol. כדי להכין תאי bacillus subtlest למיקרוסקופיה מסוג turf, יש לדלל ל-OD 600 של 0.01 עד 0.05 בחמישה מיליליטרים של מצע גידול מתאים ולגדל עד לשלב האקספוננציאלי. להכנת 1.25% aros במצע סינתטי, יש להמיס אבקת aros בשפופרת פלסטיק של 1.5 מיליליטר בטמפרטורה של 95 °C, ולאחר מכן לאחסן בבלוק חימום בטמפרטורה של 72 °C.

הוסיפו טיפה קטנה של aros למרכז של זכוכית כיסוי ובאמצעות זכוכית כיסוי שנייה, לחצו את ה-aros לצורת שכבה שטוחה לאחר שתי דקות לפחות, והפרידו בזהירות בין הזכוכיות. סובבו (Spin down) 500 µL של תאי bacillus subtlest במיקרו-צנטריפוגה במהירות של 12,000 RPM למשך דקה אחת. השליכו את העליון (supernatant) והשאיבו מחדש את המשקע (pellet) ב-50 µL מצע גידול.

הוסיפו שני עד ארבעה µL של תאים למרכז פד ה-aros. לאחר מכן, השתמשו בפינצטה כדי להוציא זכוכית כיסוי נקייה מהמכל הממולא באתנול וייבשו אותה בעזרת אוויר דחוס. הניחו בזהירות את זכוכית הכיסוי על הדגימה.

המתינו לפחות שתי דקות לשקיעת התאים לפני הבחינה במיקרוסקופ. לצילום לטווח ארוך, אטמו את קצוות זכוכית הכיסוי באמצעות תערובת מחוממת של וסלין, לנולין ופרפין או Val app. כדי להכין תאי Saccharomyces visi למיקרוסקופיה של turf, מהלו תרבית מקדימה וגדלו במצע מתאים למשך חמש שעות לפחות.

לשלב ה wzrost האקספוננציאלי, קחו כיסוי זכוכית (cover slip) מהמכל הממולא באתנול וייבשו אותו באמצעות אוויר דחוס עם פותח פיפטה. טפטפו 5 µL מתמיסת Con A על כיסוי הזכוכית וייבשו באוויר דחוס. Con A נקשר לפחמימות של דופן תאי השמרים ומקבע את תאי השמרים.

בשלב הבא, העבירו 4.5 µL של תרחיף תאי שמרים לצד אחד של ה-con, כיסוי זכוכית מצופה. הניחו בזהירות את כיסוי הזכוכית כאשר צד הדגימה פונה כלפי מטה על עלית מיקרוסקופ, החל מקצה אחד תוך כדי הנמכה איטית. פעולה זו תמנע היווצרות של בועות אוויר.

הניחו לתאים לשקוע למשך שתי דקות לפחות לפני המיקרוסקופיה, ואטמו את קצוות כיסוי הזכוכית בעזרת val app לצורך הדמיה לטווח ארוך. כל הניסויים המוצגים בסרטון זה בוצעו במערך turf מותאם אישית המבוסס על מעמד IMEX אוטומטי לחלוטין עם עדשת Olympus 100 x 1.45 NA. מקורות האור ששימשו הם לייזרים מסוג דיודה, pumped solid state או DPSS בהספק של 75 milliwatt באורכי גל של 488 nanometers ו-561 nanometers.

זוויות Turf ופלואורסצנציה. ניתן להתאים באופן מיידי את ההתאוששות לאחר הלבנה פוטוכימית (photobleaching) או את מיקום ה-FRAP באמצעות שני גלווןומטרים. גלווןומטר שלישי משמש למעבר בין epi, פלואורסצנציה, FRAP ו-Turf.

הגלבנומטרים, הנשלטים ישירות באמצעות תוכנת הרכישה בזמן אמת, מאפשרים מדידה פשוטה של קינטיקת הלוקליזציה עבור עצמים שעוקבים אחריהם בתמונות דשא (turf images) שנאספות בעזרת מצלמת EM CCD ועדשה עם הגדלה של פי 2 לפני המצלמה. הרכישה נשלטת גם היא על ידי תוכנת הרכישה בזמן אמת. לפני העבודה עם הלייזר, הרכיבו משקפי מגן ללייזר, השליכו את קרן הלייזר על התקרה במצב דשא וכיילו את מיקום אפס המעלות כך שהלייזר יהיה בקו ישר.

במטרה למקסימום דיוק, מקד את נקודת הלייזר לגודל מינימלי לאחר כיוון אופטימלי; פרופיל הלייזר צריך ליצור נקודה מוגדרת היטב בעלת צורה עגולה בקירוב. בצע כיול לפני כל סשן. כדי להשיג איכות תמונה אופטימלית, יישור המיקרוסקופ של הדשא הוא קריטי להצלחת פרוצדורה זו.

יש לכוון בקפידה את הזווית, ההטיה והפרמטרים הנכונים לרכישת התמונה כדי להשיג איכות תמונה אופטימלית. כדי להתחיל ברכישת התמונה, זהו את מיקום התאים באמצעות תאורה בשדה בהיר (brightfield). נורות LED אדומות הן יעילות במיוחד כיוון שאינן גורמות לנזק פוטו-כימי משמעותי.

עברו להארה בלייזר ובחרו בשילובים המתאימים של לייזרים ומסננים כדי לעורר את הפלואורופורים הרצויים, וודאו שזווית ה-turf היא תת-קריטית. אחרת, אותות הנובעים מחלבוני איחוי עם GFP לא יזוהו. אתרו את החלק העליון של התא, שהוא הצד של התא הפונה לכיסוי הזכוכית (cover slip).

הגדילו בהדרגה את זווית הפגיעה של קרן הלייזר עד להיעלמות האותים, ולאחר מכן הקטינו באיטיות את הזווית עד לנקודה שבה הפלואורסצנציה על פני השטח של התא מופיעה שוב. כווןו מחדש את מיקוד ציר Z לקבלת המיקום האופטימלי על פני השטח. זוויות קבלה מקובלות אינן יוצרות הילה מטושטשת בקצה התא, כפי שמוצג בדוגמה זו של חלבון שמרים.

דימויים של PMA one GFP בזוויות פגיעה יורדות, מהפינה השמאלית העליונה לפינה הימנית התחתוית. התמונות מראות אובדן פתאומי של האות בזווית הקריטית וירידה הדרגתית במידע המבני וביחס אות לרעש; יש להתאים את עוצמות הלייזר ואת הגבר המצלמה כדי למקסם את הטווח הדינמי. בדרך כלל, מצלמות E-M-C-C-D הן האופטימליות לזיהוי אותות נמוכים מאוד ביחסי אות לרעש גבוהים.

מיקרוסקופיית שכבה דקה (Turf microscopy) רגישה מאוד להבדלי גובה קטנים של לכיסוי (cover slip), דבר שגורם לכך שרק מספר קטן של תאים יכולים להיות מדויקים (in focus) וניתנים לדימות בו-זמנית. תמונה זו של תמיסה דחוסה של חרוזי פלואורסצנציה מהווה דוגמה לשדה ראייה לא אחיד, שבו רק חלק משדה הראייה נמצא במיקוד.

לפיכך, עבור תאים קטנים, ניתן לעיתים קרובות לצמצם את אזור הרכישה לתת-אזור המכיל את האובייקט הנבחר. בניסויי צבע כפול, יש למזער את הדילף (bleed through) של פלואורופורים עבור זוגות R-F-P-G-F-P. השתמש במסנני פליטה נפרדים, כיוון ש-RFP מעורר באופן חלש על ידי אור של 488 nanometer.

כאן מוצג תהליך עבודה טיפוסי למניעת דליפת צבע (bleed through) והדמיה כפולה של צבעים. לאחר הדמיית התאים עם סטים נפרדים של מסננים, התמונות מופקות ומיושרות באמצעות חרוזי פלואורסצנציה לפני מיזוגן. לצורך ניתוח, פרמטר קריטי המשפיע על איכות התמונה הוא יישור הלייזר ועדשה נקייה. לאחר יישור הלייזר ומיקוד במיקום ה-Z המשמש להדמיית ה-turf, יש להוציא את הדגימה ולנקות את העדשה מכל השמן.

שאריות שמן יגרמו לעקיפה של קרן הלייזר ולמופע של נקודות (speckles) בפרופיל הקרן. ניתן להשתמש במיקרוסקופיית Turf כדי להמחיש את ההפצה של הומולוגים לאקטין ואנזימי דופן התא בתאים בקטריאליים. בתוצאה מייצגת זו, תאי bacillus subtles המבטאים חללוני GFP של actin hoog MBL או של הטרנספפטידאז PBPH צולמו בשיטת turf ובפלואורסצנציה אפיגנלית רגילה.

התמונות המוצגות כאן מייצגות השאות ממוצעות של סדרה زمنית כדי לציין את השטח המכוסה על ידי טלאי MBL ניידים שנוטרו בשיטות הדמיה שונות. המסגרת הכחולה בתמונת השכבה העליונה מציינת את גבול התא כפי שנראה בתמונת שדה בהיר (brightfield).

הטרנספפטידאז PBPH המבוטא שבועייתית ממוקם בכתמים קורטיקליים שכמעט ואינם נראים במיקרוסקופיה פלואורסצנטית אפיפוסקלית (epi fluorescence), אך ניתן להבחין בהם בבירור באמצעות turf. ניתן להבחין בצורה הטובה ביותר בחדירות המופחתת של אות P-B-P-H-G-F-P ב-SEPTA המצוינים על ידי החיצים, אשר מופיעים כקווים במיקרוסקופיה פלואורסצנטית אפיפוסקלית, אך כנקודות ב-turf. קבוצת התמונות הבאה מציגה השוואה בין תאורה פלואורסצנטית אפיפוסקלית לבין תאורת turf של רכיב קומפלקס ה-TOR, bit 61 ב-Saccharomyces visi.

חלבון זה מבוטא באופן חלש ויוצר טלאים קורטיקליים קטנים עם עותקים בודדים של החלבון בכל טלא. במיקרוסקופיית פלואורסצנציה אפי-אנורית (epi-fluorescence) נראים רק מספר טלאים בודדים מעל הרקע החזק, בעוד שבשיטת TURF ניתן לצלם את הטלאים עם יחס אות לרעש טוב מאוד. ניתן להשיג שיפור נוסף בניגודיות התמונה באמצעות שלבים שונים של עיבוד תמונה, כגון חיסור של תמונות עם טשטוש גאוסיאני או טשטוש חציוני, בעוד שחיסור רקע מקומי מסיר רעשים ומחדד מבנים בעצימות גבוהה.

דבר זה קורה לעיתים קרובות במחיר של אובדן מבנים עדינים והגברה מוגזמת של אזורים בעצימות גבוהה. כפי שמצוין על ידי החץ, הליך עדיף הוא דקונבולוציה דו-ממדית (2D deconvolution), אותה ניתן לבצע באמצעות חבילות תוכנה חינמיות או מסחריות. העלייה בניגודיות לאחר הדקונבולוציה מודגמת בסרט time-lapse זה של GFP RAs two, המציג תמונות גולמיות ותמונות שעברו דקונבולוציה לסירוגין.

מכיוון ש-GFP RAs two הוא חלבון בעל ניידות מהירה, זמני רכישה מהירים הם חיוניים כדי להבחין בהתנהגותו הדינמית. עיבוד תמונות הוא חשוב במיוחד לצורך ניתוחי קולוקליזציה, כפי שמוצג בסרטון time lapse דו-צבעי זה של חלבוני שמרים, FET 3G FP ו-PMA one RFP.

10 הפריימים הראשונים מייצגים תמונות גולמיות והפריימים הנותרים הם תמונות שעברו דקונבולוציה. כדי לאפשר ניתוח, קריטי להגביר את הניגודיות למקסימום ולהדגיש את התמונות הגולמיות המטושטשות. Turf ו-frap מציעים שילוב עוצמתי לחקר הדינמיקה של חלבונים קורטיקליים. שימוש בטכניקה זו בתאי B subtlest המבטאים G-F-P-M-B-L שלל את ה-treadmilling כמנגנון לתנועתיות שנצפתה בכתמים המכילים MBL.

גרף ה-chm של הפס הנע ופרופיל העוצמה לאורך גרף ה-chm המסומן בקו המקווקו מוצגים באופן דומה ל-turf frap של ממברנה הפלזמה של השמרים. TPAs PMA one חשף ארגון מחדש איטי של חלבוני ממברנה הפלזמה של השמרים, המתחלקים לדומיינים דמויי רשת המכסים את כל שטח התא לאחר התפתחותם. טכניקה זו סללה את הדרך למחקרים בתחום הביולוגיה של תאי חיידקים כדי לחקור את מנגנון הסינתזה של דופן התא ב-BA subtilis.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להשיג תמונות turf של מיקרואורגניזמים כגון שמרים וחיידקים, וכיצד טכניקה זו יכולה לסייע בחקר תכונות דינמיות של חלבונים קורטיקליים.