ויזואליזציה של קליפת הארגון ואת הדינמיקה של מיקרואורגניזמים, באמצעות Fluorescence סה"כ פנימי מיקרוסקופית השתקפות

המטרה הכוללת של הליך זה היא לרכוש תמונות באיכות גבוהה, השתקפות פנימית מוחלטת, פלואורסצנטית או דשא של מיקרואורגניזמים נושאי דופן התא. זה מושג על ידי הכנת פתקי כיסוי ותאים תחילה. השלב השני הוא ליישר במדויק את הגדרת המיקרוסקופ לאיכות תמונה אופטימלית.

לאחר מכן, האירועים, הזוויות ותנאי ההדמיה הנכונים נבחרים לרכישת תמונות או סרטים. השלב האחרון הוא עיבוד הדמיה לאחר התמונות שנרכשו. בסופו של דבר, מיקרוסקופ דשא משמש לחקר הדינמיקה של לוקליזציה של חלבונים בקליפת התא.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני מתכות חריגות כמו קונבנציונאלי או קונפוקלי למיקרוסקופיה, הוא שניגודיות התמונה במיקרוסקופיה היא גבוהה מאוד, ומאפשרת זמנים מהירים ותאורה חלשה. ככזה, שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום חקר הממברנות, כגון מנגנוני הפרדת חלבונים לרוחב, או הניידות של חלבוני ממברנה. יש לנקות את החלקות הכיסוי למיקרוסקופ דשא מחלקיקי אבק לפני השימוש.

מכיוון שדשא רגיש לאותות רקע הנובעים מאבק על החלקת כיסוי מלוכלכת. נדרשת החלקת כיסוי נקייה עם פחות רקע כדי להתחיל בהליך לניקוי החלקות כיסוי. השתמש במלקחיים כדי להניח את החלקות הכיסוי במחזיק קרמי עם מכסה.

לאחר מכן, מלאו מיכל זכוכית בנתרן הידרוקסיד טוחנת אחת. ניתן לעשות שימוש חוזר בנתרן הידרוקסיד זה מספר פעמים. הנח את מחזיק הקרמיקה המכיל את החלקות הכיסוי לתוך הנתרן הידרוקסיד ודגר את החלקות הכיסוי למשך שעתיים בסיבוב רציף איטי.

אין לדגור יותר משמונה שעות, מכיוון שהדבר ייצור החלקות כיסוי אטומות לאחר שעתיים, שטפו את החלקות הכיסוי במים מזוקקים פעמיים למשך חמש דקות בכל פעם בסיבוב רציף איטי, אחסן את החלקות הכיסוי הנקיות במחזיק הקרמיקה המכוסה באתנול 100%. כדי להכין תאים עדינים ביותר של בצילוס למיקרוסקופ דשא, יש לדלל ל-OD 600 של 0.01 עד 0.05 בחמישה מיליליטר של מצע גידול מתאים ולגדול לשלב אקספוננציאלי. הכינו 1.25% במדיום סינטטי ממיסים אבקת ארוס בצינור פלסטיק של 1.5 מיליליטר ב-95 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן אחסנו בבלוק חימום ב-72 מעלות צלזיוס.

הוסף טיפה קטנה של ארוס לאמצע שקופית ועם שקופית שנייה, לחץ על הארוס למשטח שטוח לאחר שתי דקות לפחות, הפרד בזהירות את השקופיות. סובב 500 מיקרוליטר של תאים עדינים ביותר של בצילוס במיקרו צנטריפוגה במהירות של 12,000 סל"ד למשך דקה אחת. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הגלולה במדיום של 50 מיקרוליטר.

הוסף שניים עד ארבעה מיקרוליטרים של תאים למרכז כרית הארוס. לאחר מכן, השתמש במלקחיים כדי להסיר החלקת כיסוי נקייה מהמיכל המלא באתנול ולייבש אותו באוויר בלחץ. הנח בזהירות את החלקת הכיסוי על הדגימה.

תן לתאים להתיישב לפחות שתי דקות לפני המיקרוסקופיה. להדמיה ארוכת טווח, אטמו את שולי החלקת הכיסוי בתערובת המחוממת של וזלין, לנולין ופרפין או אפליקציית Val. להכנת תאי Saccharomyces visi למיקרוסקופ דשא, יש לדלל תרבית מוקדמת ולגדל במדיה מתאימה למשך חמש שעות לפחות.

לשלב האקספוננציאלי, קח פתק כיסוי מהמיכל המלא באתנול וייבש אותו באוויר בלחץ עם פיפטה. חמישה מיקרוליטר, קונבל ו- או קון תמיסה על הכריכה. להחליק ולייבש עם אוויר בלחץ A נקשר לפחמימות של דופן תא השמרים ומשתק את תאי השמרים.

לאחר מכן, העבירו 4.5 מיקרוליטר של מתלה תאי שמרים לצד אחד של הקונט, החלקת כיסוי מצופה. הנח בזהירות את דגימת החלקת הכיסוי כלפי מטה על שקופית מיקרוסקופ החל מקצה אחד והניח לטיפות לאט. זה ימנע היווצרות בועות אוויר.

תן לתאים להתיישב לפחות שתי דקות לפני המיקרוסקופיה לאטום את קצוות הכיסוי עם אפליקציית val להדמיה ארוכת טווח. כל הניסויים המוצגים בסרטון זה מבוצעים על מערך דשא מותאם אישית המבוסס על מעמד IMEX אוטומטי לחלוטין עם יעד אולימפוס 100 x 1.45 NA. מקורות האור המשמשים הם דיודה של 75 מילי-וואט, מצב מוצק שאוב או לייזרים DPSS ב-488 ננומטר ו-561 ננומטר

זוויות דשא ופלואורסצנטיות. ניתן לכוונן את ההתאוששות לאחר פוטו-הלבנה או מיקום פראט באופן מיידי באמצעות שני גלוונומטרים. גלוונומטר שלישי משמש למעבר בין אפי, פלואורסצנטי, פראפ ודשא.

הגלוונומטרים, הנשלטים ישירות מתוכנת הרכישה החיה, מאפשרים מדידה פשוטה של קינטיקה של לוקליזציה עבור אובייקטים שאותרו בתמונות דשא נאספות באמצעות מצלמת EM CCD ועדשת הגדלה פי 2 מול המצלמה. הרכישה נשלטת גם על ידי תוכנת הרכישה החיה. לפני העבודה עם הלייזר, הרכיבו משקפי בטיחות בלייזר, הקרינו את הלייזר על התקרה במצב דשא וכיול את מיקום האפס מעלות כך שהלייזר יהיה בקו ישר.

עם המטרה, למקד את נקודת הלייזר לגודל מינימלי לאחר התאמה אופטימלית, פרופיל הלייזר צריך ליצור נקודה מוגדרת היטב עם צורה עגולה בערך. בצע כיול לפני כל מפגש. כדי להשיג איכות תמונה אופטימלית, יישור מיקרוסקופ הדשא הוא קריטי להצלחת הליך זה.

יש להתאים בקפידה את השכיחות, הזוויות והפרמטרים הנכונים לרכישת תמונה לאיכות תמונה אופטימלית. כדי להתחיל ברכישת תמונה, זהה את מיקום התאים באמצעות תאורת שדה בהיר. נוריות LED אדומות טובות במיוחד מכיוון שהן אינן גורמות לנזק משמעותי לצילום.

עבור לתאורת לייזר ובחר לייזרים מתאימים ושילובי מסננים כדי לרגש את הפלואורופורים הנבחרים, וודא שזווית הדשא היא תת-קריטית. אחרת לא יתגלו אותות הנובעים מחלבוני היתוך GFP. מצא את החלק העליון של התא, שנמצא בצד התא הפונה להחלקת הכיסוי.

הגדל בהדרגה את זווית הפגיעה של קרן הלייזר עד שהאותות נעלמים, ולאחר מכן הקטן לאט את הזווית עד לנקודה שבה הקרינה על פני התא מופיעה שוב. כוונן שוב את מיקוד Z למיקום אופטימלי על פני השטח. זוויות דשא מקובלות אינן יוצרות הילה מטושטשת בקצה התא כפי שמודגם בדוגמה זו של חלבון שמרים.

PMA GFP אחד צולם עם זוויות שכיחות יורדות משמאל למעלה לימין למטה. התמונות מראות אובדן פתאומי של אות בזווית הקריטית וירידה הדרגתית במידע המבני וביחס האות לרעש, התאמת עוצמות הלייזר ורווח המצלמה כדי למקסם את הטווח הדינמי. בדרך כלל, מצלמות E-M-C-C-D הן אופטימליות לזיהוי אותות נמוכים מאוד ביחסי אות לרעש גבוהים.

מיקרוסקופ דשא רגיש מאוד לגובה קטן. הבדלים בהחלקת הכריכה וכתוצאה מכך רק תאים בודדים שניתן לצלם בו זמנית. תמונה זו של השעיה צפופה של חרוזים פלואורסצנטיים היא דוגמה לשדה ראייה לא אחיד שבו רק חלק משדה הראייה נמצא בפוקוס.

לכן, עבור תאים קטנים, לעתים קרובות ניתן לצמצם את אזור הרכישה לתת-אזור המכיל את מושא הבחירה. עבור ניסויי דשא בצבע כפול יש למזער את הדימום של פלואורופורים עבור זוגות R-F-P-G-F-P. השתמש במסנני פליטה נפרדים מכיוון ש-RFP נרגש מדי שבוע על ידי אור של 488 ננומטר.

תהליך עבודה טיפוסי למניעת דימום והדמיה בצבע כפול מוצג כאן. לאחר הדמיית התאים עם ערכות פילטרים נפרדות, התמונות מואצלות ומיושרות באמצעות חרוזי פלורסנט לפני מיזוגן לצורך ניתוח, פרמטר קריטי המשפיע על איכות התמונה הוא יישור לייזר ומטרה נקייה. לאחר יישור הלייזר והתמקדות במיקום Z המשמש להדמיית דשא, הסר את הדגימה ונקה את המטרה מכל השמן.

שאריות שמן יובילו לעקיפה של אור הלייזר וכתמים בפרופיל האלומה. ניתן להשתמש במיקרוסקופ דשא כדי לדמיין את התפלגות הומולוגי האקטין ואנזימי דופן התא בתאי חיידקים. בתוצאה מייצגת זו, תאים עדינים של בצילוס המבטאים היתוך GFP של האקטין הוג MBL או הטרנספפטידאז PBPH צולמו על ידי דשא ופלואורסצנציה אפי רגילה.

התמונות כאן מייצגות תחזיות ממוצעות של סדרת זמן כדי לציין את האזור המכוסה על ידי תנועה. תיקוני MBL מנוטרים עם מצבי הדמיה שונים. קו המתאר הכחול בתמונת שכבת-העל מציין את גבול התא המוצג מתמונת שדה בהיר.

הטרנספפטידאז PBPH המתבטא בשבוע מתמקם בכתמים קליפת המוח שבקושי נראים על ידי אפי פלואורסצנטי, אך ניתן להבחין ביניהם בבירור על ידי דשא. ניתן להבחין בצורה הטובה ביותר בחדירה המופחתת עבור אות P-B-P-H-G-F-P ב-SEPTA המצוין על ידי החצים, המופיע כקווים ב-epi fluorescence, אך כנקודות בדשא. קבוצת התמונות הבאה מציגה השוואה בין פלואורסצנטיות אפי לתאורת דשא של רכיב קומפלקס TOR, סיבית 61 ב-Saccharomyces visi.

חלבון זה מתבטא מדי שבוע ויוצר מדבקות קטנות בקליפת המוח עם עותקי חלבון בודדים בלבד בכל מדבקה. באפי פלואורסצנטי ניתן לראות רק כמה טלאים מעל הרקע החזק בעוד שניתן לצלם טלאים עם יחס אות לרעש טוב מאוד בדשא. ניתן להשיג שיפור נוסף של ניגודיות התמונה באמצעות שלבי עיבוד תמונה שונים, כגון חיסור של תמונות מטושטשות גאוס או חציוניות בעוד חיסור רקע מקומי מסיר רעש ומחדד מבנים בעוצמה גבוהה.

לעתים קרובות זה בא במחיר של אובדן מבנים עדינים והגברה מוגזמת של אזורים בעוצמה גבוהה. כפי שמצוין על ידי החץ, הליך מעולה הוא דה-קונבולוציה דו-ממדית, שניתן לבצע עם חבילות תוכנה חינמיות או זמינות מסחרית. עליית הניגודיות לאחר דה-קונבולוציה מודגמת על ידי סרטון זמן-lapse זה של GFP RAs 2 המציג תמונות דשא גולמיות ומפוזרות לסירוגין.

מכיוון ש-GFP RAs 2 הוא חלבון שנע במהירות, חשוב לפתור זמני רכישה מהירים. ההתנהגות הדינמית שלו. עיבוד תמונה חשוב במיוחד לניתוחי קולוקליזציה כפי שמוצג בסרט זה בצבע כפול של חלבוני שמרים, FET 3G FP ו-PMA RFP אחד.

10 הפריימים הראשונים מייצגים תמונות גולמיות והפריימים הנותרים הם תמונות מואצלות כדי לאפשר ניתוח, חשוב למקסם את הניגודיות ולחדד את התמונות הגולמיות המטושטשות. דשא ופראפ מציעים שילוב רב עוצמה לחקר הדינמיקה של חלבונים בקליפת המוח. שימוש בטכניקה זו בתאים העדינים ביותר של B המבטאים G-F-P-M-B-L שלל הליכון כמנגנון לתנועתיות הנצפית של טלאים המכילים MBL.

גרף ה-chm של התיקון הנע ופרופיל העוצמה לאורך גרף ה-chm המצוין על ידי הקו המקווקו מוצגים בצורה דומה של קרום הפלזמה של השמרים. TPAs PMA חשף את הסידור מחדש האיטי של חלבוני קרום פלזמה שמרים, המתפשטים לתחומים דמויי רשת המכסים את כל פני התא לאחר התפתחותו. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה של תא החיידקים לחקור את המנגנון של סינתזת דופן התא בסבטיליס.

אחרי הצפייה בסרטון הזה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לרכוש תמונות דשא של מיקרואורגניזמים כמו שמרים וחיידקים, וכיצד השיטה הזו יכולה לסייע בחקר תכונות דינמיות של חלבונים בקליפת המוח.