הדמיית דינמיקת סידן תת-תאית בתאי עצב של Caenorhabditis elegans

קח שני זני Caenorhabditis elegans טרנסגניים נפרדים על מגלשות עם רפידות אגר. הרפידות מכילות תמיסת גלגול עם חומר משתק הממזער את התנועה.

חוט העצב הגחוני של התולעים, או VNC, מכיל אינטרנוירונים מעוררים המבטאים מדדי סידן ציטופלזמיים בזן אחד ומדדי סידן מיטוכונדריאלי בשני.

הניחו כיסוי כדי לגלגל את התולעים, כוונו את ה-VNC להדמיה, ואז מקמו אותן מתחת למיקרוסקופ פלואורסצנטי.

השתמש באור נראה כדי לאתר את התולעים, ולאחר מכן עבור למצב פלואורסצנטי.

בתאי עצב במנוחה, סידן תוך-תאי נמוך שומר על האינדיקטורים לא קשורים, וכתוצאה מכך פלואורסצנטיות חלשה.

פעילות עצבית ספונטנית פותחת תעלות סידן מגודרות מתח, ומאפשרת זרימת סידן.

בזן עם אינדיקטורים ציטופלזמיים, סידן נקשר לאינדיקטורים, ומשפר את הקרינה הציטופלזמית.

עודף סידן ציטופלזמי נכנס למיטוכונדריה דרך תעלות. בזן עם אינדיקטורים מיטוכונדריאליים, קשירת הסידן מגבירה את הקרינה המיטוכונדריאלית.

דמיין את הנוירונים בשני הזנים כדי לנטר את דינמיקת הסידן התת-תאית.

בצינור תרבית זכוכית בגודל 13 על 100 מילימטר, הכינו 3 מיליליטר של אגר 10% על ידי המסת אגר בדרגה מולקולרית ב- M9 ומיקרוגל למשך מספר שניות. להכנת רפידות האגר, הכינו תחילה שתי שקופיות על ידי הוספת שתי שכבות של סרט מעבדה. לאחר מכן הנח שקופית מיקרוסקופ בין שתי השקופיות. חותכים את הקצה של קצה פיפטה של 1,000 מיקרוליטר ומשתמשים בו כדי לזרוק טיפה קטנה של אגר על מרכז הכיסוי.

משטחים את האגר על ידי לחיצה על מגלשה נוספת כלפי מטה על גבי האגר. לאחר הקירור, חותכים את האגר לדיסק קטן באמצעות פתח צינור של 10 מיליליטר ואז מסירים את האגר שמסביב. לאחר מכן, הכינו את תמיסת גלגול התולעים על ידי המסת אבקת שריר ב-M9 ליצירת מלאי של 30 מילי-מולאר. מדללים את המלאי ביחס של אחד לאחד עם חרוזי פוליסטירן כדי ליצור את תמיסת הגלגול.

כדי למקם את התולעת להדמיה, הניחו תחילה 1.6 מיקרוליטר מתמיסת הגלגול על מרכז כרית האגר. לאחר מכן, בעזרת קיסם תולעים מועדף, העבירו תולעת בגיל הרצוי לתמיסת הגלגול על כרית האגר. המתן כחמש דקות עד שהמוסימול יפחית את תנועת התולעת, ולאחר מכן זרוק כיסוי בגודל 22 על 22 מילימטר על גבי כרית האגר

להדמיית נויריטים בחוט העצב הגחוני, גלגל את התולעת על ידי החלקה קלה של הכיסוי. כדי להרכיב את התולעת על המיקרוסקופ, הניחו טיפת שמן טבילה על הכיסוי. מצא את התולעת באמצעות מטרת הגדלה נמוכה בשדה בהיר. לאחר מכן עבור לאובייקט 100X ואתר את נויריט ה-AVA באמצעות תאורה של GCaMP או mito-GCaMP עם לייזר הדמיה של 488 ננומטר.