שיווי משקל ניטור שינויים ב-RNA על ידי מבנה 'Peroxidative' ו 'חמצוני "footprinting רדיקלי הידרוקסיל

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לוודא כיצד מולקולות RNA מתקפלות באמצעות טביעת רגל רדיקלית הידרוקסילית. זה מושג על ידי תיוג קצה, טיהור ג'ל וקיפול מקדים של ה-RNA, מה שמבטיח שלמות אישור של ה-RNA לפני קיפול בתיווך מגנזיום כשלב הבא, ריאגנטים של פנטון מעורבבים ליצירת רדיקלים הידרוקסיליים, שיכולים לאחר מכן לבקע את עמוד השדרה של ה-RNA בהתאם לנגישות הממס שלו. לאחר מכן, תוצרי מחשוף ה-RNA מופרדים על ידי דנטורציה של אלקטרופורזה של ג'ל פולי אקרילאמיד, ומודגמים על ידי רדיוגרפיה אוטומטית.

אינטגרלי הלהקה מכומתים על ידי תוכנת ניתוח טביעת רגל אוטומטית למחצה. המטרה הסופית היא ליצור איזותרמיות מתקפלות המשקפות היווצרות מבנה שלישוני של RNA. זה מושג על ידי שינוי קנה המידה של אינטגרלי הפס המנורמל לרוויה חלקית.

לאחר מכן ניתן להתאים את האיזותרמיות למשוואת הגבעה. היתרון העיקרי של טביעת רגל הידרוקסית הוא שאתה מקבל מידע על מבנה שלישוני של RNA באמצעות כימיקלים זולים בשל הפעילות הגבוהה יותר ברדיקלים הידרוקסיים בגודל קטן הם בדיקות מושלמות להבחנה בין נוקלאוטידים נגישים לממס וקבורים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה המבנית של RNA.

לדוגמה, כיצד ריבוזומים משתמשים ביוני מתכת כדי להגיע לאישור הפעיל שלהם? ניתן להשתמש בטביעת רגל רדיקלית הידרוקסית כדי להבין את היסודות של ספציפיות וזיהוי RNA. מלבד חשיפת מידע על המבנה השלישוני של RNA, ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לקבוע את אתרי קשירת החלבון המדויקים ב-RNA או במולקולות DNA.

האתגרים העיקריים בשיטה זו הם מניעת פירוק הדגימה על ידי ריבונוקלאז ואופטימיזציה של ריכוז הברזל על מנת להשיג את הכמות הנכונה של מחשוף RNA. כמו כן, ניתוח הפירוט של מרווחי הלהקה יכול להיות די מסובך. היתרון העיקרי של סרטון זה הוא לעזור לקהל להבין את שלבי התכנון והביצוע המוצלח של ניסוי טביעת רגל רדיקלית הידרוקסית לפני תחילת פרוטוקול זה, הכינו את כל טביעת הרגל בריאגנטים כמתואר בפרוטוקול הכתוב.

בליווי סרטון זה, ניתן לייצר RNA DFOs ארבעה קשורים ומסומנים כמתואר שם. טהר את ה-RNA המסומן רדיואקטיבי באמצעות אלקטרופרזיס ג'ל דנטור. שחזר את ה-RNA המטוהר על ידי שתי מיצוי ג'ל עוקבות באמצעות 0.3 נתרן אצטט מולארי.

לאחר מכן זרז את ה- RNA על ידי ערבוב של 0.5 מיליליטר מהתמיסה המימית עם מיליליטר אחד של אתנול. דגרו את התערובת למשך דקה על קרח יבש לאחר סיבוב הדגימה, השליכו את הסופינאט. שוטפים את כדור ה-RNA עם אתנול 70%.

הסר את הספינאט לאחר צנטריפוגה נוספת וייבש את הגלולה בוואקום. לאחר מכן, ממיסים את דגימות ה-RNA המטוהרות המסומנות ב-P 32. ב-330 מיקרוליטר של פיפטת חיץ תגובה חד פעמית 30 מיקרוליטר מתמיסת ה-RNA לתוך צינור תגובה חדש.

לזרז את ה-RNA באתנול ולאחר מכן לייבש את הגלולה בוואקום לאחר הייבוש, ניתן להשתמש בגלולה זו ליצירת סולם הייחוס כמתואר בנוהל הכתוב לטבע את תמיסת ה-RNA המאגר שנותרה על ידי חימום ב-95 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות. קרא לדגימות לטמפרטורת החדר למשך 15 דקות והמשיך בסיבוב מהיר כדי להחזיר את הקונדנסט לתמיסה. כדי להתחיל בניסוי טביעת הרגל, הגדר 27 צינורות תגובה למספיק דגימות כדי למלא ג'ל אלקטרופורזה של 30 בארות.

לאחר הכללת הסולמות והבקרה השסועה, קבע את ריכוזי הברזל הסופיים של המגנזיום כך שהם יהיו מרווחים באופן שווה בקנה מידה לוגריתמי על פני כמה סדרי גודל סביב הכנת נקודת האמצע של יוני המגנזיום בפעם אחת מאגר התגובה מתואר בטקסט בנפרד. דגרו את ה-RNA ואת תמיסות יוני המגנזיום ב-50 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר מכן מערבבים 10 מיקרוליטר מתמיסת ה- RNA עם 90 מיקרוליטר מהכמות המקבילה של תמיסת ברזל מגנזיום.

כדי להגיע לנפח סופי של 100 מיקרוליטר, דגרו כל תערובת למשך 30 דקות של 50 מעלות צלזיוס. לאחר מכן אפשר לתמיסות להתייצב ב-25 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת בזמן שמתרחש קיפול RNA. בינתיים, מיד לפני התחלת טביעת הרגל הרדיקלית של ההידרוקסיל בתגובה, הכינו את תערובת תגובת הפנטום כמתואר בפרוטוקול הכתוב.

הכן את תגובת החמצון על ידי פיפטינג של שתי טיפות מיקרוליטר כל אחת של ברזל EDTA, נתרן אסקורבט ומי חמצן בחלק העליון של צינור התגובה המכיל את תמיסת ה-RNA כך שהטיפות לא ייגעו. התחל את תגובת טביעת הרגל על ידי ערבוב נמרץ. לאחר 15 שניות, עצור את התגובה על ידי הוספת 300 מיקרוליטר אתנול קר טהור.

סובב את הצינורות שלוש עד חמש פעמים. לבסוף, לזרז, לשטוף ולייבש את הגלולה כפי שבוצע קודם לכן כחלופה לתגובה החמצונית, תגובת ההידרוקסיל החמצונית תתבצע על ידי הוספת חמישה מיקרוליטרים מתערובת תגובת הפנטון שהוכנה לאחרונה לדגימות. דגרו על תגובת החמצון למשך 30 דקות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן הוסף 300 מיקרוליטר אתנול קר טהור כדי להרוות את התגובה ולערבב על ידי סיבוב הצינורות. שוב, לזרז. שטפו וייבשו את הגלולה עם השלמת התגובה החמצונית או החמצונית.

ממיסים את כדורי ה-RNA המיובשים בשמונה מיקרוליטרים של צבע טעינת ג'ל שתיים. ודא כי ה-RNA המסומן P 32 מושעה מחדש על ידי שימוש במונה גיר הכינו ג'ל ריצוף פולי אקרילאמיד 8% על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. בעזרת מסרק של 30 באר טען את הדגימות, כולל שתי הפניות ובקרה שסועה.

הפרד את שברי ה- RNA ב 60 עד 75 וואט למשך שעתיים וחצי. חשוף את הג'ל המיובש למסך פוספו אחסון למשך הלילה. סרוק את מסך הפוספו עם מערכת הדמיה לרדיוגרפיה אוטומטית ללא סרט.

לאחר מכן העבר את קובץ תמונת הג'ל למחשב לניתוח. כדי להתחיל בניתוח נתונים, פתח את Safa ותוכנת קוד פתוח להתאמה וכימות של פס יחיד. טען את רצף ה-RNA כקובץ TXT נקודה ואחריו תמונת הג'ל כקובץ ג'ל נקודה.

הגדר את הנתיבים והתאם את עוצמות הרצועה. לאחר מכן בחר נתיב עוגן ובצע הקצאת יישור ג'ל של רצועות לנוקלאוטידים מתרחשת בהתייחס לסולם העיכול של RNAs T. כמת את עוצמות הלהקה והשתמש בתכונת עלילת הצבעים של קו נטוי כדי לנרמל ולהקצות שאריות שעלולות להיות קבועות.

שמור את הפלט כקובץ txt. SFA מוציא גיליון אלקטרוני המכיל עמודות, המייצגות נתיבים על הג'ל ושורות המייצגות את אינטגרלי הפס הבודדים המתאימים למקטע ה-RNA. ראשית, יש לזהות את אתרי ההגנה המציגים שינוי ניכר בנגישות הממס על ידי השוואת פרופיל ההגנה הנגזר מדגימת יונים ללא מגנזיום לפרופיל ריכוז יוני המגנזיום בנקודת הקצה.

ככל שהערך נמוך יותר, כך הנוקלאוטיד מוגן יותר מפני התקפה של רדיקלי ההידרוקסיל ולהיפך. לאחר מכן, צור עקומות מעבר של פס, עוצמות של בודדים או קבוצות של נוקלאוטידים לעומת ריכוז ברזל מגנזיום באמצעות פורמט גיליון אלקטרוני בקנה מידה נפרד של מעברים אלה לפונקציית הרוויה החלקית כמתואר בחלק הטקסט של פרוטוקול זה. כשלב אחרון, התאם את הנתונים למשוואת הגבעה.

ניתוח זה מגדיל את המעבר לרוויה חלקית, קובע את נקודת האמצע של המעבר ומספק בדיקה פנומנולוגית האם מוצג מעבר סיגמואידי. להלן תוצאות מייצגות מניסויי טביעת רגל רדיקלית של P ארבע P שש RRNA הידרוקסיל. איזותרמים נגזרו מג'ל ריצוף שנותח על ידי Safa ולאחר מכן התאימו כמתואר בסעיף הניתוח.

תמונת הג'ל מצביעה על כך שמחשוף הרקע הוא מינימלי וכי הקצאת נוקלאוטיד בודד אפשרית עקב רצועות מוגדרות היטב בנתיב T אחד. הפיצול המושרה על ידי רדיקלים הידרוקסיליים של RNA נמצא הרבה מעל הרקע. המעבר מיוני מגנזיום נמוכים לגבוהים קשור באופן סלקטיבי לירידה בעוצמה של יחידים וקבוצות של רצועות המצביעות על היווצרות RNA.

הגנה על מבנה שלישוני מתייחסת לנוקלאוטידים בודדים או לקבוצות של נוקלאוטידים רציפים שהמחשוף שלהם משתנה במקביל עוצמות הלהקה מכומתות ומנורמלות על ידי ניתוח סאפר. הפלט הוא תרשים תרמי המדמה את מידת ההגנה מפני רדיקלים הידרוקסיליים. מעבר הצבע מתאר את שינוי הנגישות עם תוספת ברזל מגנזיום לבן לאדום מראה נוקלאוטידים נגישים יותר, בעוד שלבן לכחול מראה נוקלאוטידים מוגנים יותר.

כל דרגת הצללה משויכת לערך מספרי, אותו ניתן לשרטט כעקומת הגנה ולנתח על ידי מודל מחייב כגון משוואת הגבעה. בדוגמה זו, קבוע דיסוציאציה של שיווי משקל של מזוהה עם הגנה 1 5 3 עד 1 5 5 הוא בערך כפול מהערך המקביל של הגנה 1 6 3 עד 1 6 4. ניסוי טביעת רגל רדיקלי הידרוקסי זה יכול להיעשות תוך יום וחצי אם הוא מבוצע כראוי.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור ללבוש כפפות וחלוק מעבדה כדי למנוע זיהום RNA. כמו כן, ריכוז הברזל הסופי תלוי במערכת הניסוי. לכן, אנו ממליצים לבצע ניסוי תגובת מינון לפני ביצוע הליך זה.

ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון טביעת רגל רדיקלית הידרוקסית שנפתרה בזמן על מנת לענות על שאלות נוספות. לדוגמה, באיזו נקודת זמן קריטית מולקולות RNA מגיעות לאישור לא מקופל או פעיל לאחר התפתחותו? טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה המבנית לחקור אינטראקציות שלישוניות בין-מולקולריות כמו גם ביניים של חומצות גרעין.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לקבוע היווצרות מבנה שלישוני של מולקולות RNA. אל תשכח שקאט וזרחן שלב שני הם אמצעי זהירות מסוכנים, כגון לבישת כפפות ומשקפי מגן, כמו גם שימוש במיגון פרספקס מומלצים בעת ביצוע הליך זה.