Name: שיווי משקל ניטור שינויים ב-RNA על ידי מבנה Peroxidative ו חמצוני footprinting רדיקלי הידרוקסיל (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 41 s
Description: למד כיצד לכמת את היווצרות המבנה התלת-ממדי של RNA באמצעות טכניקת hydroxyl radical footprinting. השיטה כוללת סימון קצה, טיהור ג'ל וקיפול מקדים של RNA לפני קיפול מבוסס מגנזיום.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכון הלאומי לבריאות RO1-GM085130 ואת הקרן הלאומית למדע MCB0929394. אנו מודים לד&quot;ר שמידט מריון על האירוח שלה עבור ומאפשר לנו הסרט במעבדה שלה.

1. הכנה של ריאגנטים footprinting <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ התגובה 10x המכיל נתרן 100 mM cacodylate, 1 mM EDTA, ו 1 M KCl. התאם את ה-pH ל -7.4. סנן החיץ באמצעות אצטט 0.2 מיקרומטר מסנן למכשיר (Nalgene). הערה: לא RNA pipet ישירות לתוך חוצץ 10x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכינים את תערובת התגובה טיטרציה עבור כל תגובה כמפורט בטבלה 1. נפח לערבב טיטרציה (1x חיץ Mg (II) בריכוז הרצוי) צריך להיות 90 μl, לפני הוספת 10μl של רנ"א במאגר 1x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ T1 RNAse העיכול המכיל אוריאה 6.63M, ציטרט הנתרן 20mm, 1mm EDTA, 0.25 מיקרוגרם / μl tRNA, cyanol קסילן 0.025%, וכחול bromphenol 0.025%. חיץ זה ניתן לאחסן 4 ° C עד 6 חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תגובת פנטון דורשת תמיסות מימיות המוכן טרי של 250 מ"מ Fe (NH 4) 2 (SO 4) 2, 250 mM EDTA, נתרן 500 mM ו-L-ascorbate. ריכוזים ציינו בפרק 1.5 הם אופטימליים עבור ניסויים שיווי משקל חיץ כגון cacodylate נתרן שאינו לחפש רדיקלים ומגוונים ריכוזי יון divalent. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריאגנטים עבור התגובה (1.5.2) peroxidative (1.5.1) ו footprinting חמצוני. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התגובה peroxidative פנטון דורשת תמיסות מימיות של פתרון מוכן טרי 100 Fe-EDTA מ"מ, ו 50 נתרן mM L-ascorbate ו -1.5% H 2 O 2. הפתרון Fe-EDTA הוא מוכן על ידי ערבוב Fe (NH 4) 2 (SO 4) 2 עם EDTA יש פי 1.1 עודף של EDTA על ברזל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רגע לפני שיזם את התגובה מחשוף חמצוני (3.4.2), ליצור את התמהיל התגובה פנטון על ידי שילוב של 2 μl Fe (NH 4) 2 (SO 4) 2 (250 מ"מ), 2.2 μl של EDTA (250 מ"מ), 62.5 μl נתרן L-ascorbate (500 מ"מ), 22.5 תגובה μl חיץ 10x ו 135.5 μl של H 2 O להגיע אל ריכוזי הסופי בתערובת footprinting תגובה (3.4.2) של 0.10 מ"מ, 0.11 מ"מ, 6.61 מ"מ, בהתאמה. </li></ol></li></ol> 2. RNA הכנה לקראת ניסוי footprinting <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> RNA יכול להיות מיוצר על ידי תקן שעתוק במבחנה של תבניות DNA 6 או, אם פחות מ 50 נוקלאוטידים, ניתן לרכוש (למשל ב-DNA משולב טכנולוגיות, www.idtdna.com). עקבו מומלץ ניקיון נהלים מעבדה כדי לשמור על שלמות מדגם של רנ"א במהלך הניסויים footprinting 7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dephosphorylation 8 של במבחנה RNA עיבד הכרחי לפני תיוג 32 P הסוף "5 של רנ"א. 10 pmol של רנ"א הם סוף שכותרתו ידי kinasing. 9 הפתרון צריך להיות מעונן לאחר איון מוצלח של phosphatase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר RNA מסומן רדיואקטיבית בעזרת ג'ל אלקטרופורזה denaturing. רנ"א הוא התאושש לאחר מכן על ידי שתי עקירות באמצעות ג'ל 0.3 נתרן אצטט M (pH 5.5). RNA הוא זירז ידי ערבוב 0.5 פתרון מ"ל מימית עם אתנול 1 מ"ל ובעקבותהדגירה דקה 1 על קרח יבש. ספין מדגם ב 4 ° C, 12,500 סל"ד עבור 0.5 שעות. בטל supernatant ולשטוף RNA גלולה עם אתנול 70%. הסר supernatant לאחר צנטריפוגה נוספים יבש גלולה בחלל ריק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את P-32 שכותרתו דגימות רנ"א ul 330 μl של 1x Buffer.Pipet 30 הפתרון RNA בצינור תגובה, המשקע עם אתנול ו-RNA יבש בחלל ריק; לשמור על צינור להפקת הסולם הפניה (שלב 3.5). לפגל הפתרון שנאגרו RNA על ידי חימום על 95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות. מגניב דגימות לטמפרטורת החדר במשך 15 דקות ולתת סיבוב מהיר כדי להפיל את ותרכיזים על העפעפיים של צינורות אל הפתרון. </li></ol> 3. ניסוי footprinting <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסרק אלקטרופורזה קובע את המספר המרבי של נקודות נתונים לכל ג'ל אנליטית. אנו משתמשים גם מסרק 30. סולם התייחסות תופסת 2 בארות אחד לשלוט uncleaved. הכן 27 מבחנות התגובה. Mg הסופי (II) concentratiתוספות צריכה להיות מחולקת באופן שווה על סולם לוגריתמי פורש סדרי גודל סביב אמצע טיטרציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנפרד, דגירה את הרנ"א (II) פתרונות Mg ב 50 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. מערבבים 10 μl של פתרון RNA עם μl 90 סכום המקביל Mg (II) במאגר 1x להגיע נפח סופי של 100 μl. דגירה הפתרונות למשך 30 דקות ב 50 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו הפתרונות לאזן במהירות של 25 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 תוך קיפול מתרחשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Peroxidative (3.4.1) או חמצוני (3.4.2) footprinting הידרוקסיל תגובה קיצונית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל את התגובה peroxidative ידי הצבת טיפות של μl 2 Fe-EDTA (100 מ"מ), 2 נתרן μl L-ascorbate (50 מ"מ) 2 μl H 2 O 2 (1.5%) מופרדים זה מזה על החלק הפנימי העליון של התגובה שפופרת המכילה את הפתרון RNA ולהתחיל את התגובה footprinting ידי ערבוב נמרץ. עצור את התגובה לאחר 15 שניות על ידי הוספת 300 μl אתנול אבסולוטי קר. סובבו את הצינורות 3-5 פעמים. , לזרז לרחוץיבש את הכדור כמו בשלב 2.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את footprintingreaction חמצוני רדיקלי הידרוקסיל ידי הוספת 5 μl של תמהיל פנטון מוכן טרי התגובה (1.6). דגירה למשך 30 דקות במהירות של 25 ° C. הוסף 300 μl של אתנול אבסולוטי קר להרוות את התגובה ומערבבים על ידי סיבוב צינורות 3-5 פעמים. נמהרת, לשטוף ולייבש גלולה כמצוין בשלב 2.4. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור T1 RNase מדגם לעכל התייחסות פי הנהלים תקן 10 באמצעות פתרון מוכן בשלב 1.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים כדורי רנ"א 8 μl ג'ל טעינת צבע II (AMBION) ולאשר RNA הוא resuspended באמצעות מונה גייגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן denaturing, 8% רצף ג'ל polyacrylamide על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. 11 דגימות טען כולל שתי הפניות שליטה. הפרד RNA שברים ב 60 וואט - 75 וואט עבור 2.5 שעות. לחשוף ג'ל יבשים למסך אחסון זרחן לילה. סריקה זרחן מסך עם מערכת הדמיה עבור autoradiography filmless, למשל. סטורם 865 (GE Healthcare), או טייפון (GE Healthcare). העברת קובץ התמונה ג'ל למחשב. </li></ol> 4. ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תגובתיות רדיקלי הידרוקסיל של כל נוקלאוטיד נקבעת על ידי כימות עוצמת הלהקה על כל ג'ל האנליטי. הורד, התקן ולפתוח ספא, קל לשימוש בתוכנות קוד פתוח עבור הולם הלהקה כימות יחיד. 12, 13 בצע את ההוראות במדריך למשתמש. בקצרה, לטעון את רצף הרנ"א כמו. קובץ txt ואחריו התמונה ג'ל כקובץ. ג'ל. התאם בעוצמות הלהקה, להגדיר את הנתיבים, לבחור במסלול עוגן, ולבצע יישור ג'ל. הקצאה של להקות כדי נוקליאוטידים מתרחשת התייחסות סולם העיכול T1 RNase. לכמת את אינטגרלים הלהקה להשתמש בתכונת נורמליזציה / colorplot לנרמל ולהקצות שאריות משתנה פוטנציאלי. שמור את הפלט כקובץ txt.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספא פלטי גיליון אלקטרוני המכיל עמודות המייצגות נתיבים על הג'ל שורות המייצג את בtegrated צפיפות הלהקה של להקות בודדות המקביל לקטע RNA. ראשית, לזהות את האתרים שבהם הגנה להציג שינוי ניכר בנגישות ממס על ידי השוואת פרופיל הגנה נגזר מדגם לא Mg (II) עם פרופיל של ריכוז נקודת הסיום (II) Mg (50 מ"מ בדוגמא שלנו). הנמך את הערך, המוגן יותר נוקלאוטיד הוא נגד ההתקפה מפני רדיקלים הידרוקסיל ולהיפך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור איזותרמות מתקפל מן אינטגרלים הלהקה מנורמל של יחידים או קבוצות של נוקליאוטידים לעומת ריכוז (II) Mg. איזותרמות הם מדורגים בנפרד הרוויה השבר על ידי fi = L + (U - L) • <img src="files/ftp_upload/3244/3244y.jpg" alt="Y"> היכן f מציין את צפיפות משולב של הלהקה (ים) להיות מנותח, L ו-U מייצגים את גבולות העליון והתחתון המעבר ו <img src="/files/ftp_upload/3244/3244y.jpg" alt="Y" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Y"> היא רוויה חלקיים. 14 הנתונים הם בכושר באמצעות l שאינו ליניאריממזרח לכיכר תוכנית ניתוח (אנו משתמשים גם מקור (OriginLab) או GraphPad (GraphPad תוכנה, Inc).) למשוואה היל (1), <img alt="משוואה 1" src="/files/ftp_upload/3244/3244eq1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="משוואה 1"> היכן K d הוא קבוע הדיסוציאציה בשיווי משקל, [ז] מתאים לריכוז של המשתנה כי מתווכת התגובה מתקפלים, Mg (II) בדוגמה זו, H n הוא מקדם היל. זה קשקשים הליך המעבר הרוויה השבר, קובע נקודת האמצע שלה מספק מבחן הפנומנולוגית של אם המעבר הוא sigmoidal. איזותרמות נגזר רצף ג'לים (איור 3A) אשר נותחו על ידי סאפא (איור 3B) ובכושר כמתואר לעיל מוצגים באיור 3C. איזותרמות הרוויה השבר שמוצג באיור 3 נוצרו על ידי דרוג בגיליון אלקטרוני הערכים שנוצרו על ידי ספאא נגד גבולות הטוב העליון והתחתון מתאים (U ו-L) באמצעות חלק במשוואה = ערך / (U - L) - L / (U - L). </li></ol> 5. נציג תוצאות: איור 3 מציג תוצאות נציג P4-P6 RNA • ניסויים OH footprinting. התמונה ג'ל (משמאל) מציין כי המחשוף) הרקע הוא מזערי (נתיב ימין), ב) הקצאה נוקלאוטיד יחיד אפשרי בגלל להקות הגדיר היטב את השביל T1 (RNase cleaves T1 בכל G), ו - ג) רדיקלי הידרוקסיל הפיצול המושרה של RNA הוא הרבה מעל הרקע. המעבר מ נמוך Mg גבוהה (II) המזוהה עם הפחתת צפיפות הלהקה משולבת של בודדים וקבוצות של להקות המעיד על היווצרות של RNA מבנה שלישוני. יחיד או קבוצות של נוקלאוטיד רציף אשר מחשוף שינויים במקביל מכונים 'הגנה'. • הגנות OH האופייניים של Mg (II) בתיווך קיפול של P4-P6 RNA מקרוב מתאימות האזורים נגיש ממס של המולקולה שנצפתה המבנה הגבישי שלה. 15 מולקולות רנ"א מקופל ג יש ובמידות שונות מאוד (כלומר, כמה קרוב רקע הירידה בצפיפות הלהקה) של הגנה קשר שלישוני שלא היה בקורלציה עם תופעה מבנית או דינמי ברור. לכן, כמה מולקולות רנ"א יראה מעברים מבנית מוגדרת היטב, כפי שמוצג באיור 3, וחלק לא. עוצמות בנד הם לכמת מנורמל על ידי ניתוח 12 צפא (איור 3B). הפלט הוא מזימה "תרמית" לדמיין את מידת היחסי של הגנה מפני • OH. המעבר צבע מתאר את השינוי על נגישות בנוסף (II) Mg. הלבן מראה אדום או כחול נוקלאוטידים נגיש יותר או מוגנת יותר, בהתאמה. מידת כל של הצללה המזוהה עם ערך מספרי אשר ניתן להתוות כמו עקומת הגנה (איור 3 ג) ונותחו על ידי מודל מחייב כגון המשוואה היל (1). שיווי משקל קבוע דיסוציאציה המזוהים עם הגנת 153-155 הוא בערך כפול מזה של הערך המקביל להגנת 163-164. ontent "&gt; <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3244/3244fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. ייצור רדיקלי הידרוקסיל ו P4-P6 קיפול RNA. א) Fe (II) מזרז לייצור של רדיקלים של הידרוקסיל מי חמצן. Ascorbate מפחית Fe (III) חזרה ברזל ברזל. ב) בהעדר Mg (II), מבנה לא P4-P6 שלישוני נוצר, המאפשר רדיקלים הידרוקסיל לחדור לפלח כל הפוזיציות עמוד השדרה נגיש. תוספת של Mg (II) יוזם קיפול של P4-P6, המאפשר רק את עמוד השדרה נגיש ממס להיות ביקע ידי רדיקלים הידרוקסיל. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3244/3244fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> באיור 2. תמציתי לניסוי footprinting הידרוקסיל רדיקל. Dephophorylation) ו - 32 P 5'-end תיוג של רנ"א. ב) טיהור של 32 P-RNA מסומן על ג'ל polyacrylamide denaturing. ג) כריתה של הלהקה RNA, לאחר מיצוי RNA, משקעים אתנול. D) ו Prefoldingקיפול של רנ"א. ה) תוספת של תערובת פנטון טרי שהוכן התגובה ליצירת רדיקלים הידרוקסיל. F) RNA ההפרדה שבר ידי denaturing ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide. G) quantitation של שברי RNA על ידי תוכנה סאפא. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3244/3244fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> באיור 3. ניתוח של שברי RNA לאחר התגובה פנטון peroxidative footprinting. (א) RNA נחשף רדיקלים הידרוקסיל והמוצרים מחשוף נפתרו באמצעות denaturing ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide (עמוד). התמונה מראה המוצרים מחשוף peroxidative עם ריכוז גדל והולך של Mg (II). נתיבי הפניה ושליטה מסומנים. זה קובץ תמונה הוא קלט לתוכנית ספא ​​אשר quantitates נפח הלהקה כל אחד. (ב) מזימה "תרמית" שנוצר על ידי סאפא. (ג) גיליון אלקטרוני של ערכים הנוגעים צפיפות הלהקה משולבת פלט מספר נוקלאוטידים מתוך ספא מנותח על ידי מודל מחייב כגון equati הילעל (1). אזורי הגנה נבחרו על פי להגדיל את צפיפות הלהקה אינטגרלי כפונקציה של ריכוז (II) Mg. ד K הוא הריכוז (II) Mg שבו מחצית RNA הוא מקופל באתר במעקב. מקדם היל, n H, הוא מדד של השיפוע של העקום אשר נותן מידע על cooperativity מחייב מספק הערכה נמוכה יותר עבור מספר יוני מגנזיום מעורב קיפול של האתר המסוים הזה. <img alt="טבלה 1" src="/files/ftp_upload/3244/3244table1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="טבלה 1"> טבלה 1. כרכים נציג ליצירת דגימות RNA המכיל שונים (II) ריכוזים Mg.

<ol><li>Tullius, T. D., Dombroski, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxyl+radical+%22footprinting%22%3A+high-resolution+information+about+DNA-protein+contacts+and+application+to+lambda+repressor+and+Cro+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Hydroxyl radical "footprinting": high-resolution information about DNA-protein contacts and application to lambda repressor and Cro protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 5469-5473 (1986).</li>
<li>Celander, D. W., Cech, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron%28II%29-ethylenediaminetetraacetic+acid+catalyzed+cleavage+of+RNA+and+DNA+oligonucleotides%3A+similar+reactivity+toward+single-+and+double-stranded+forms%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Iron(II)-ethylenediaminetetraacetic acid catalyzed cleavage of RNA and DNA oligonucleotides: similar reactivity toward single- and double-stranded forms.</a> Biochemistry. 29, 1355-1361 (1990).</li>
<li>Celander, D. W., Cech, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+higher+order+folding+of+a+catalytic+RNA+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualizing the higher order folding of a catalytic RNA molecule.</a> Science. 251, 401-407 (1991).</li>
<li>Sclavi, B., Sullivan, M., Chance, M. R., Brenowitz, M., Woodson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+folding+at+millisecond+intervals+by+synchrotron+hydroxyl+radical+footprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA folding at millisecond intervals by synchrotron hydroxyl radical footprinting.</a> Science. 279, 1940-1943 (1998).</li>
<li>Tullius, T. D., Dombroski, B. A., Churchill, M., Kam, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxyl+radical+footprinting%3A+a+high-resolution+method+for+mapping+protein-DNA+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Enzym%22%5BJournal%5D)">Hydroxyl radical footprinting: a high-resolution method for mapping protein-DNA contacts.</a> Methods. Enzym. 155, 537-558 (1987).</li>
<li>Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligoribonucleotide+synthesis+using+T7+RNA+polymerase+and+synthetic+DNA+templates%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic.+Acids.+Res%22%5BJournal%5D)">Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates.</a> Nucleic. Acids. Res. 15, 8783-8798 (1987).</li>
<li>Schlatterer, J. C., Brenowitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementing+global+measures+of+RNA+folding+with+local+reports+of+backbone+solvent+accessibility+by+time+resolved+hydroxyl+radical+footprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Complementing global measures of RNA folding with local reports of backbone solvent accessibility by time resolved hydroxyl radical footprinting.</a> Methods. 49, 142-147 (2009).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual</a>. , 3 ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor. New York. (2001).</li>
<li>Zaug, A. J., Grosshans, C. A., Cech, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-specific+endoribonuclease+activity+of+the+Tetrahymena+ribozyme%3A+enhanced+cleavage+of+certain+oligonucleotide+substrates+that+form+mismatched+ribozyme-substrate+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Sequence-specific endoribonuclease activity of the Tetrahymena ribozyme: enhanced cleavage of certain oligonucleotide substrates that form mismatched ribozyme-substrate complexes.</a> Biochemistry. 27, 8924-8931 (1988).</li>
<li>Knapp, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+approaches+to+probing+of+RNA+secondary+and+tertiary+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Enzym%22%5BJournal%5D)">Enzymatic approaches to probing of RNA secondary and tertiary structure.</a> Methods. Enzym. 180, 192-212 (1989).</li>
<li>Slatko, B. E., Albright, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Denaturing+gel+electrophoresis+for+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Denaturing gel electrophoresis for sequencing.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 7, Unit 7.6-Unit 7.6 (2001).</li>
<li>Das, R., Laederach, A., Pearlman, S. M., Herschlag, D., Altman, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SAFA%3A+semi-automated+footprinting+analysis+software+for+high-throughput+quantification+of+nucleic+acid+footprinting+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">SAFA: semi-automated footprinting analysis software for high-throughput quantification of nucleic acid footprinting experiments.</a> RNA. 11, 344-354 (2005).</li>
<li>Simmons, K., Martin, J. S., Shcherbakova, I., Laederach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+quantification+and+analysis+of+kinetic+%2AOH+radical+footprinting+data+using+SAFA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Enzym%22%5BJournal%5D)">Rapid quantification and analysis of kinetic *OH radical footprinting data using SAFA.</a> Methods. Enzym. 468, 47-66 (2009).</li>
<li>Uchida, T., He, Q., Ralston, C. Y., Brenowitz, M., Chance, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linkage+of+monovalent+and+divalent+ion+binding+in+the+folding+of+the+P4-P6+domain+of+the+Tetrahymena+ribozyme%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Linkage of monovalent and divalent ion binding in the folding of the P4-P6 domain of the Tetrahymena ribozyme.</a> Biochemistry. 41, 5799-5806 (2002).</li>
<li>Cate, J. H., Gooding, A. R., Podell, E., Zhou, K., Golden, B. L., Kundrot, C. E., Cech, T. R., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+group+I+ribozyme+domain%3A+principles+of+RNA+packing%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a group I ribozyme domain: principles of RNA packing.</a> Science. 273, 1678-1685 (1996).</li>
<li>Petri, V., Brenowitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+nucleic+acids+footprinting%3A+thermodynamic+and+kinetic+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Quantitative nucleic acids footprinting: thermodynamic and kinetic approaches.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 8, 36-44 (1997).</li>
<li>Takamoto, K., Das, R., He, Q., Doniach, S., Brenowitz, M., Herschlag, D., Chance, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+RNA+compaction%3A+insights+from+the+equilibrium+folding+pathway+of+the+P4-P6+RNA+domain+in+monovalent+cations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Principles of RNA compaction: insights from the equilibrium folding pathway of the P4-P6 RNA domain in monovalent cations.</a> J. Mol. Biol. 343, 1195-1206 (2004).</li>
<li>Brenowitz, M., Senear, D. F., Shea, M. A., Ackers, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+DNase+footprint+titration%3A+a+method+for+studying+protein-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Enzym%22%5BJournal%5D)">Quantitative DNase footprint titration: a method for studying protein-DNA interactions.</a> Methods. Enzym. 130, 132-181 (1986).</li>
<li>Shcherbakova, I., Mitra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxyl-radical+footprinting+to+probe+equilibrium+changes+in+RNA+tertiary+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Enzym%22%5BJournal%5D)">Hydroxyl-radical footprinting to probe equilibrium changes in RNA tertiary structure.</a> Methods. Enzym. 468, 31-46 (2009).</li>
<li>Howlett, G. J., Minton, A. P., Rivas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+ultracentrifugation+for+the+study+of+protein+association+and+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opinion.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analytical ultracentrifugation for the study of protein association and assembly.</a> Curr. Opinion. Chem. Biol. 10, 430-436 (2006).</li>
<li>McGinnis, J. L., Duncan, C. D., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+SHAPE+and+hydroxyl+radical+analysis+of+RNA+structure+and+ribonucleoprotein+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Enzym%22%5BJournal%5D)">High-throughput SHAPE and hydroxyl radical analysis of RNA structure and ribonucleoprotein assembly.</a> Methods. Enzym. 468, 67-89 (2009).</li>
<li>Jonikas, M. A., Radmer, R. J., Laederach, A., Das, R., Pearlman, S., Herschlag, D., Altman, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coarse-grained+modeling+of+large+RNA+molecules+with+knowledge-based+potentials+and+structural+filters%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Coarse-grained modeling of large RNA molecules with knowledge-based potentials and structural filters.</a> RNA. 15, 189-199 (2009).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Footprinting רדיקלי הידרוקסיל היא כלי רב ערך כדי להעריך את אזור ממס משטח נגיש של חומצות גרעין. היווצרות איכותי וכמותי של מבנה שלישוני 14 ניתן בעקבות כפונקציה של פרמטרים כגון סוג הריכוז יונים, pH, טמפרטורה, או קיפול חלבונים מחייב שיתוף גורמים. שילוב מרתק של פרוטוקול קדימה זול ישר הנגישות ממס וכתוצאה מכך ומידע קיפול ברמה נוקלאוטיד יחיד עושה שיטה זו מאוד אטרקטיבי. באופן מסורתי תגובת • OH footprinting מבוצע באמצעות הוסיף H 2 O 2, פרוטוקול אנו מתייחסים ...

<table><tbody><tr><td>שם</td><td>חברה</td><td>מספר קטלוגי#</td><td></td></tr><tr><td>סודיום קקודילאט (זהירות! רעיל) </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4945-25g</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0.5 M)</td><td>Ambion</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>מים שעובדו ב-DEPC</td><td>Ambion</td><td>AM9915G</td><td></td></tr><tr><td>סודיום אצטט (3 M)</td><td>Ambion</td><td>AM9740</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (1 M)</td><td>Ambion</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>urea</td><td>Ambion</td><td>AM9902</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ציטראט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W302600</td><td></td></tr><tr><td>tRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R-7876</td><td></td></tr><tr><td>נתרן-L-אסקורבט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7631-25g</td><td></td></tr><tr><td>Fe(NH₄)₂(SO₄)₂&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;(SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 6 שעות&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1543-500g</td><td></td></tr><tr><td>RNase T1</td><td>Fermentas</td><td>EN0541</td><td></td></tr><tr><td>מימן פריקסיד (30%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>349887</td><td></td></tr></tbody></table>

שיווי משקל ניטור שינויים ב-rna על ידי מבנה &#39;peroxidative&#39; ו &#39;חמצוני &quot;footprinting רדיקלי הידרוקסיל

Monitoring Equilibrium Changes in RNA Structure by 'Peroxidative' and 'Oxidative' Hydroxyl Radical Footprinting

מולקולות רנ&quot;א תפקיד חיוני בביולוגיה. בנוסף להעברת המידע הגנטי, RNA יכול להתקפל למבנה שלישוני ייחודי למלא תפקיד ביולוגיים ספציפיים כמו קלסר הרגולטור, או זרז. מידע על היווצרות קשר שלישוני הכרחי להבין את הפונקציה של מולקולות RNA. רדיקלים הידרוקסיל (OH •) הן בדיקות ייחודי של המבנה של חומצות גרעין בשל תגובתיות גבוהה שלהם בגודל קטן. 1 כאשר שימש בדיקה footprinting, רדיקלים הידרוקסיל למפות את פני השטח נגיש ממס של עמוד השדרה phosphodiester של ה-DNA ו-RNA 1 עם 2 קנס כמו רזולוציה נוקלאוטיד בודד. Footprinting רדיקלי הידרוקסיל יכול לשמש כדי לזהות את נוקלאוטידים בתוך משטח מגע מולקולאריים, למשל חלבון-DNA ו-RNA-1 חלבון קומפלקסים. שיווי משקל 3 ו 4 מעברים הקינטית ניתן לקבוע על ידי ביצוע footprinting רדיקלי הידרוקסיל כפונקציה של solutiעל משתנים או זמן, בהתאמה. תכונה מרכזית של footprinting היא כי חשיפה מוגבלת בדיקה (למשל, &quot;יחיד פגע קינטיקה &#39;) תוצאות דגימה אחידה של כל נוקלאוטיד של הפולימר. 5 במאמר זה וידאו, אנו משתמשים תחום P4-P6 של ribozyme Tetrahymena כדי להמחיש הכנה RNA מדגם וקביעת (II) בתיווך איזותרמות Mg מתקפלים. אנו מתארים את השימוש בפרוטוקול footprinting הידרוקסיל ידוע קיצוני הדורש H 2 O 2 (שאנו מכנים זה את פרוטוקול &quot;peroxidative&quot;) לבין בעל ערך, אך לא ידוע, חלופה המשתמשת O טבעי מומס 2 (אנחנו קוראים לזה &#39; חמצוני &quot;פרוטוקול). סקירה כללית של צמצום הנתונים, שינוי נהלים ניתוח מוצג.

פרוטוקול זה מתאר כיצד לכמת את Mg (II) תלויי היווצרות של RNA מבנה שלישוני על ידי שתי שיטות footprinting רדיקלי הידרוקסיל.

שיווי משקל ניטור שינויים ב-RNA על ידי מבנה &#39;Peroxidative&#39; ו &#39;חמצוני &quot;footprinting רדיקלי הידרוקסיל

מולקולות RNA ממלאות תפקיד חיוני בביולוגיה. בנוסף להעברת מידע גנטי, RNA יכול להתקפל למבנים שלישוניים ייחודיים הממלאים...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לקבוע כיצד מולקולות RNA מתקפלות באמצעות שיטת טביעת מאפה (footprinting) של רדיקלי הידרוקסיל. זאת מושג על ידי סימון קצוות, טיהור בג'ל וקיפול מקדים של ה-RNA, המבטיחים את שלמות המבנה של ה-RNA לפני הקיפול המתווך על ידי מגנזיום; בשלב הבא, מערבבים את ריאגנטי פנטון (Fenton reagents) כדי ליצור רדיקלי הידרוקסיל, אשר יכולים לאחר מכן ל 끊ו את שלד ה-RNA בהתאם לנגישותו לממס. לאחר מכן, תוצרי הפירוק של ה-RNA מופרדים באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילמיד דנטורטי, ומדגמיים באמצעות רדיוגרפיה עצמית.האינטגרלים של הפסים מכומתים באמצעות תוכנה לניתוח footprinting חצי-אוטומטי. המטרה הסופית היא להפיק איזותרמות קיפול המשקפות התגשמות של מבנה שלישוני של RNA. הדבר מושג על ידי נרמול האינטגרלים של הפסים לרוויה חלקית.ניתן להתאים לאחר מכן את האיזותרמות למשוואת היל (hill equation). היתרון המרכזי של טביעת רגל הידרוקסית (hydroxy footprinting) הוא קבלת מידע על המבנה השלישוני של RNA באמצעות כימיקלים זולים; בשל הפעילות הגבוהה ובשל גודלן הקטן, רדיקלי הידרוקסיל הם גששים (probes) מושלמים להבחנה בין נוקלאוטידים נגישים לממס לבין נוקלאוטידים קבורים. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הביולוגיה המבנית של RNA.לדוגמה, כיצד ריבוזומים משתמשים ביוני מתכת כדי להגיע לקונפורמציה הפעילה שלה

monitoring-equilibrium-changes-rna-structure-peroxidative-oxidative

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

acylation הידרוקסיל '2 סלקטיבית תפוקה גבוהה נותח על ידי הארכה תחל (SHAPE) מנצל כימי רומן חיטוט טכנולוגיה, שעתוק לאחור, אלקטרופורזה נימים ותוכנות לחיזוי מבנה משנית כדי לקבוע את המבנים של RNAs מכמה מאה עד כמה אלף נוקלאוטידים ברזולוציה נוקלאוטיד יחידה.

חיזוי מבנה המשני RNA באמצעות SHAPE תפוקה גבוהה

כימית biomimetic הרדיקלי מבוססת הוחלה ספריות בניין עד נחוצות לפיתוח סמן ביולוגי.

רדיקלים חופשיים בביולוגיה כימית: מהתנהגות כימית לפיתוח סמנים ביולוגיים

כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור הפצילות תלויי-RNA של רנ א. זה מאפשר ניתוח מהיר ותלוי האתר של RNA 2 '-או-מתילציה. גישה זו יכולה לשמש להערכה ראשונית או מרכזית של פעילות הסנחנה.

ניתוח מותנה של rRNA 2 '-או-מתילציה

אנו מתארים כאן שיטות לקוונפיקציה רגיש ומדויק של נגעים 8-אוקסו-7, 8-dihydro ידרו-2'-deoxyguanosine (8-oxodGuo), 1,n6-etheno-2'-deoxyadenosine (1,n6-דאדו) ו-1,N2- etheno-2'-deoxyguanosine (1,N2-dguo) ב-DNA. השיטות הוחלו על הערכת ההשפעות של חומר מקיף חלקיקי הסביבה (PM2.5) ברקמות (ריאות, כבד וכליות) של עכברים חשופים A/J.

קוונפיקציה של שלוש נגעים DNA ידי ספקטרומטר המוני והערכה של רמות שלהם ברקמות של עכברים חשופים החומר מקיף חלקיקים עדינים

בשנת vivo מהיר חמצון פוטוכימי של חלבונים (IV-FPOP) הוא חלבון הידרוקסיל הקיצונית הטכניקה הדפסה המאפשרת מיפוי של מבנה החלבון בסביבתם הטבעית. פרוטוקול זה מתאר את ההרכבה וההגדרה של מערכת הזרימה של מיקרופלואידיג IV-FPOP.

ב Vivo הידרוקסיל חלבון רדיקלי מדפיס הדפסה לחקר אינטראקציות חלבונים באלבוראבאבדיטיס האלאים

כאן, אנו מאפיינים מבנה חלבונים ואינטראקציה אתרים בתאים חיים באמצעות חלבון הדפסה הטכניקה הנקראת-cell חמצון מהיר אטמוספרי של חלבונים (IC-fpop).

אפיון חלבונים סלולריים עם החמצון בתוך תא מהיר לפוטוכימיקלים של חלבונים

הצלבה קינטית וניתוח של cDNA היא שיטה המאפשרת לחקור את הדינמיקה של אינטראקציות חלבון-RNA בתאים חיים ברזולוציה טמפורלית גבוהה. כאן מתואר בפירוט הפרוטוקול, כולל גידול תאי שמרים, הצלבת UV, קציר, טיהור חלבונים ושלבי הכנת ספריית הריצוף של הדור הבא.

ניטור דינמיקת אינטראקציה חלבון-רנ"א ב-Vivo ברזולוציה טמפורלית גבוהה באמצעות χCRAC

חמצון פוטוכימי מהיר של חלבונים היא טכניקה מתפתחת לאפיון מבני של חלבונים. תוספי ממס שונים ליגנדים יש תכונות שונות הידרוקסיל רדיקלי ים. כדי להשוות את מבנה החלבון בתנאים שונים, פיצוי בזמן אמת של רדיקלים הידרוקסיל שנוצר בתגובה נדרש כדי לנרמל את תנאי התגובה.

מתן אפשרות לפיצוי בזמן אמת בחומציות פוטוכימיות מהירות של חלבונים לקביעת שינויים בטופוגרפיה של חלבונים

פרוטוקול זה מציג שיטה לשימוש בדוסימטריה רדיקלית מוטבעת ומקור אור פלזמה לביצוע טביעת רגל של חלבון חמצון פלאש. שיטה זו מחליפה את לייזר UV מסוכן כדי לפשט ולשפר את הרבייה של חמצון פוטוכימי מהיר של מחקרי חלבון.

טביעת רגל של חלבון הידרוקסיל רדיקלי ללא לייזר לביצוע ניתוח מבני מסדר גבוה יותר של חלבונים

MALDI-TOF שימש לאפיון שברים שהתקבלו מהתגובתיות בין RNA מחומצן לבין exoribonuclease Xrn-1. הפרוטוקול הנוכחי מתאר מתודולוגיה שניתן ליישם על תהליכים אחרים המערבים רנ"א ו/או דנ"א.

זיהוי שברי RNA כתוצאה מהשפלה אנזימטית באמצעות ספקטרומטריית מסה MALDI-TOF

הפרוטוקול מספק הוראות לשינוי RNA עם דימתיל סולפט לניסויים בפרופיל מוטציות. הוא כולל בדיקה במבחנה ו - in vivo עם שתי שיטות הכנה חלופיות לספרייה.

בדיקת מבנה RNA עם פרופיל מוטציה של דימתיל סולפט עם ריצוף במבחנה ובתאים

למד כיצד לכמת את היווצרות המבנה התלת-ממדי של RNA באמצעות טכניקת hydroxyl radical footprinting. השיטה כוללת סימון קצה, טיהור ג'ל וקיפול מקדים של RNA לפני קיפול מבוסס מגנזיום.

שיווי משקל ניטור שינויים ב-RNA על ידי מבנה 'Peroxidative' ו 'חמצוני "footprinting רדיקלי הידרוקסיל

גלה סרטונים נוספים