הערכת שינויים מטבוליים כבדית במהלך להתיישבות מתקדמת של עכבר נבט בחינם על ידי ¹ H NMR ספקטרוסקופיה

מטרתו של הליך זה היא להעריך את השפעתה של קולוניזציה פרוגרסיבית על חילוף החומרים הכבדי של המארח. דבר זה מושג תחילה על ידי קולוניזציה פרוגרסיבית של עכברים נטולי חיידקים (germ-free). תהליך הקולוניזציה מנוטר באמצעות הערכת ההפרשה השפחית של קומטבוליטים מיקרוביאליים באמצעות ספקטרוסקופיית NMR.

בעקבות ניטור תהליך הקולוניזציה, נלקחת ביופסיה של הכבד מהעכבר ומוכנה לביצוע פרופיל מטבולי. ניתן להשיג את הפרופיל המטבולי הכבדי מהביופסיה השלמה באמצעות ספקטרוסקופיית NMR בסיבוב בזווית קסם (magic angle spinning) ברזולוציה גבוהה ובאופן לא הרסני. בסופו של דבר, שימוש זה בספקטרוסקופיית proton NMR חושף מטאבוליטים שונים המעורבים במסלולים מטבוליים, כגון מסלולי אנרגיה ועקה חמצונית.

ניסוי זה יכול לספק תובנות לגבי תפקודי הכבד במהלך קולוניזציה. ניתן להחיל אותו גם על מערכות אחרות, כגון הכליות. כדי לבצע קולוניזציה לבעלי החיים, הוצא את העכברים נקיי החיידקים (germ-free) מהבידוד והשכן אותם בחדר גידול קונבנציונלי בכלובים, המצוידים במסנן לפני בעלי החיים הקונבנציונליים המשמשים כביקורות.

לאחר מכן, ערבבו מחצית ממצע (litter) בן שלושה ימים שנלקח מכלוב הביקורת הקונבנציונלי עם המצע של בעלי החיים נקיי-החיידקים (germ-Free). אספו שתן למיקרו-מבחנה של 1.5 milliliter על ידי החזקת העכבר מעל המבחנה וסיוע לפעולת ההטלה באמצעות עיסוי עדין של המעיים. נדרש נפח מינימלי של 20 µL עבור רכישה עם גשושית NMR של 5 mm, אך מומלץ להשתמש ב-30 µL כדי לשפר את איכות הפרופיל המטבולי. הקפיאו את השתן באופן מיידי (Snap freeze) בחנקן נוזלי ואחסנו בטמפרטורה של לפחות 40- °C עד לניתוח ה-NMR.

לפני רכישת נתוני NMR, הכין תמיסת בופר נתרן פוספט בריכוז 0.2 molar במים כבדים, ב-pH 7.4 ומכילה 1 millimolar TSP. ערבב 30 µL של ה-urine עם 30 µL של בופר נתרן פוספט. העבר 50 µL מהתמיסה המעורבבת לתוך צינור נימי NMR בקוטר 1.7 millimeter באמצעות מזרק זכוכית של 50 µL המצויד במחט מתכת.

יש להקפיד על הימנעות מהיווצרות בועות. התקן את מתאם הקפילרה על גבי הקפילרה המכילה את דגימת השתן והכנס אותה לתוך מיקרו-מבחנה NMR בנפח 2.5 millimeter עבור גשש NMR של חמישה millimeter. שילוב זה של מבחנות יכול לשמש כמבחנת NMR סטנדרטית של חמישה millimeter לצורך רכישת ספקטרום.

בהדגמה זו, נעשה שימוש בספקטרומטר NMR מסוג Bruker Advanced Three 700 MHz לאיסוף הנתונים. רכשו ספקטרומי NMR של פרוטון במימד אחד באמצעות הפרמטרים שנדונו בפרוטוקול הכתוב. לאחר רכישת ה-NMR, השתמשו במוט החילוץ כדי להוציא את הקפילרה מתוך מבחנת ה-NMR בקוטר 2.5 מילימטר על ידי סיבוב עדין של מתאם הקפילרה כדי למשוך אותה החוצה, לאחר ביצוע ההמתה של בעלי החיים כפי שנדון בפרוטוקול הכתוב.

הכינו את הציוד לביופסיה של הכבד. אין להשתמש במוצר המכיל אלכוהול כדי למנוע זיהום, ויש לשטוף את הכלים במים או בתמיסת סליין. אספו ביופסיות של הכבד מהאונה השמאלית כדי להבטיח תוצאות הניתנות לשחזור.

יש לאסוף את הדגימות באופן עקבי ממרכז האונה השמאלית, תוך הימנעות מהאזורים ההיקפיים שבהם הרקמה דקה יותר. יש להיזהר לא לנקב את כיס המרה כדי למנוע דליפה של מיץ מרה. יש לשטוף את הרקמה מיד במים או בתמיסת סליין.

בצעו הקפאה מהירה (Snap freeze) של הביופסיות בחנקן נוזלי באופן מיידי ואחסנו אותן בטמפרטורה של minus 80 degrees Celsius עד לניתוח ה-NMR. כדי להכין את הדגימה עבור H-R-M-A-S-N-M-R, הכניסו את הביופסיה השלישית לתוך רוטור זירקוניום ומלאו את שאר הנפח במים כבדים טהורים לצורך נעילת ה-NMR. היזהרו לא ליצור בועות, שכן הן עלולות לפגוע באיכות ה-shimming ובאיסוף הנתונים העוקבים. הכניסו ספייסר טפלון של 50 microliter באמצעות הבורג הגלילי.

שחררו אותו והכילו אותו באמצעות מד העומק בצד הקצר. הניחו את פין ההברגה על המרווח והבריגו אותו בעדינות באמצעות מברג. ייבשו כל שארית מים בעזרת נייר סופג.

בשלב הבא, הניחו את המכסה בחלקו העליון של הרוטור והכניסו אותו למארז הרוטור (rotor packer). לחצו בחוזקה עד שהמכסה יתבסס במקומו. לא אמור להישאר מרווח בין הרוטור למכסו. סמנו חצי מחלקו התחתון של הרוטור באמצעות טוש שחור כדי לאפשר זיהוי אופטי של קצב הסיבוב.

לאחר שהרוטור נארז באופן מספיק, מקמו אותו בתוך הספקטרומטר של ה-NMR והתחילו את הסיבוב במהירות של 5 kHz. כאן נעשה שימוש בספקטרומטר Bruker Avance III 500 MHz. רכשו ספקטרום proton NMR באמצעות רצף פולסים מסוג CPMG.

בהתאם להנחיות היצרן, ניתן להשתמש בפיסגות הכפולות השופעות של גלוקוז אלפא ובטא ב-5.22 parts per million לצורך כיול ספקטרומי ה-NMR המתקבלים. כדי לפתוח את הרוטור, יש להסיר את המכסה באמצעות מסיר המכסים, להבריג החוצה את פין ההברגה ולהסיר את spacer הטפלון. ניתן לשטוף את המכשיר ביסודיות באמצעות מים וחומר ניקוי בעזרת הבורג הגלילי.

הופעתם של קו-מטבוליטים מיקרוביאליים של המעי במהלך תהליך הקולוניזציה מודגמת בבירור בספקטרום הפרוטונים של פרופיל מטבולי בשתן של בעל חיים שעבר קולוניזציה במשך 20 ימים. בעל חיים זה לא הפריש indole sulfate וכמויות קטנות מאוד של phenyl acetyl glycine, המקוצר כ-PAG ושל quinolinic acid sulfate במצב נטול חיידקים (germ-free). ככל שהקולוניזציה מתקדמת, שלושת הסממנים הללו של מטבוליזם של חלבונים על ידי מיקרוביוטת המעי עולים באופן ניכר ומגיעים לשיווי משקל ביום ה-20.

על ידי אינטגרציה של שיא השלישייה הספציפי של PAG, ניתן היה לכמת את העלייה בסמן מסוים זה לאורך זמן. תרשים זה מייצג את ריכוז ה-PAG הממוצע במהלך קולוניזציה עבור קבוצה של שבעה בעלי חיים באמצעות ספקטרוסקופיית proton H-R-M-A-S-N-M-R, כאשר הפרופיל המטבולי הכבדי של שני עכברים לפני ואחרי קולוניזציה התקבל. איור זה ממחיש היטב את המידע שניתן להפיק מפרופיל מטבולי המבוסס על A-M-A-S-N-M-R.

ניתן להדגים חומצות אמינו רבות וכן מטבוליטים הגזורים מטבוליזם אנרגטי. פרופילים אלה מכילים גם מידע הרלוונטי לעקה חמצונית, מטבוליזם של נוקלאוטידים ומטבוליזם של מתיל-אמין. בדוגמה זו, ניכר בבירור כי העכבר נטול החיידקים (germ-free) מציג כמעט ללא גליקוגן וכמויות נמוכות מאוד של גלוקוז וטריגליצרידים.

בהתאם לנהלי עבודה אלו, ניתן להשתמש בכלי סטטיסטיקה מרובים, כגון כימومتריקה, כדי לבצע אשכולה של דגימות לוגיות על פי פרופיל מטבולי, ולהבליט ביומרקרים הקשורים למצב המטבולי.