הערכת שינויים מטבוליים כבדית במהלך להתיישבות מתקדמת של עכבר נבט בחינם על ידי ¹ H NMR ספקטרוסקופיה

מטרת הליך זה היא להעריך את ההשפעה של קולוניזציה מתקדמת על חילוף החומרים בכבד המארח. זה מושג על ידי התיישבות הדרגתית של עכברים ללא חיידקים. תהליך הקולוניזציה מנוטר על ידי הערכת הפרשת השתן של מטבוליטים מיקרוביאליים באמצעות ספקטרוסקופיה של NMR.

לאחר ניטור תהליך הקולוניזציה, נאספת ביופסיית כבד מהעכבר ומוכנה לפרופיל מטבולי. לאחר מכן ניתן לרכוש את הפרופיל המטבולי של הכבד מהביופסיה השלמה באמצעות ספקטרוסקופיה לא הרסנית של זווית קסם ברזולוציה גבוהה. בסופו של דבר, שימוש זה בספקטרוסקופיה של תמ"ג פרוטון חושף מטבוליטים שונים המעורבים במסלולים מטבוליים כגון מסלולי אנרגיה ומתח חמצוני.

אז הניסוי הזה יכול לספק תובנה לגבי תפקודי הכבד במהלך הקולוניזציה. ניתן ליישם אותו גם דרך המערכת כמו כליה. כדי ליישב את בעלי החיים, הסר עכברים נטולי חיידקים מהמבודדים ושכן אותם בחדר גידול קונבנציונלי בכלובים, המצויד בפילטר מול בעלי החיים הקונבנציונליים המשמשים כבקרה.

לאחר מכן, ערבבו מחצית מהמלטה בת שלושה ימים שנלקחה מכלוב הביקורת הקונבנציונאלי עם המלטה של בעלי החיים נטולי החיידקים, אספו שתן במיקרו-צינור של 1.5 מיליליטר על ידי טיפול בעכבר מעל הצינורית ועזרו על ידי עיסוי עדין של המעי. נדרשים מינימום של 20 מיקרוליטר לרכישה עם בדיקת NMR של חמישה מילימטרים, אך מומלץ להשתמש ב-30 מיקרוליטר כדי לשפר את איכות הפרופיל המטבולי. הצמד להקפיא את השתן מיד במאגר החנקן הנוזלי לפחות מינוס 40 מעלות צלזיוס עד לניתוח NMR.

לפני רכישת NMR, הכינו תמיסת חיץ נתרן פוספט 0.2 מולרית במים כבדים. pH 7.4 המכיל כפית מילי-מולרית אחת מערבבים 30 מיקרוליטר של השתן עם 30 מיקרוליטר של מאגר נתרן פוספט. העבירו 50 מיקרוליטר מהתמיסה המעורבת לצינור נימי NMR בגודל 1.7 מילימטר באמצעות מזרק זכוכית בנפח 50 מיקרוליטר המצויד במחט מתכת.

הקפד להימנע מבועות. התקן את המתאם הנימי על גבי הנימים המכילים את דגימת השתן והנח אותו בצינור מיקרו NMR של 2.5 מילימטר לבדיקת NMR של חמישה מילימטרים. שילוב זה של צינורות יכול לשמש כצינור NMR סטנדרטי של חמישה מילימטר לרכישה ספקטרלית.

בהדגמה זו, נעשה שימוש בספקטרומטר תמ"ג מתקדם של 700 מגה-הרץ לאיסוף הנתונים. רכוש ספקטרום תמ"ג פרוטון חד מימדי באמצעות הפרמטרים הנדונים בפרוטוקול הכתוב. לאחר רכישת NMR, השתמש במוט החילוץ כדי להסיר את הנימים מצינור ה-NMR בגודל 2.5 מילימטר על ידי הברגת מתאם הנימים בעדינות כדי לשלוף אותו החוצה לאחר המתת חסד של בעלי חיים כפי שנדון בפרוטוקול הכתוב.

התכוננו לביופסיית הכבד. אין להשתמש במוצר המכיל אלכוהול כדי למנוע זיהום ולשטוף כלים באמצעות מים או תמיסת מלח. אסוף ביופסיות כבד מהאונה השמאלית לביופסיות הניתנות לשחזור.

אסוף באופן עקבי במרכז האונה השמאלית, הימנע מהאזורים ההיקפיים שבהם הרקמה דקה יותר. הקפד לא לנקב את כיס המרה במקרה של דליפת מרה. יש לשטוף טישו מיד במים או בתמיסת מלח.

הקפיאו ביופסיות בחנקן נוזלי מיד ואחסנו אותן במינוס 80 מעלות צלזיוס עד לניתוח NMR כדי להגדיר H-R-M-A-S-N-M-R, הכנס את הביופסיה השלישית לרוטור זירקוניום ומלא את שאר הנפח במים כבדים טהורים לנעילת NMR. היזהר לא ליצור בועות מכיוון שהן עלולות לשנות את איכות השימינג ורכישת הנתונים שלאחר מכן. הכנס מרווח טפלון בנפח 50 מיקרוליטר באמצעות הבורג הגלילי.

נתק אותו וכייל אותו באמצעות מד העומק בצד הקצר. הנח את סיכת ההברגה על המרווח והברג אותה בעדינות עם המברג. בית יבש, כל שאריות מים עם חתיכת רקמה.

לאחר מכן, הנח את המכסה בחלק העליון של הרוטור והכנס אותו לארוז הרוטור. לחץ בחוזקה עד שהמכסה נמצא במקומו. לא אמור להישאר רווח בין הרוטור למכסה שלו לסמן מחצית מהחלק התחתון של הרוטור באמצעות עט סימון שחור כדי לאפשר זיהוי קצב סיבוב אופטי.

לאחר שהרוטור ארוז מספיק, הנח אותו בתוך ספקטרומטר ה-NMR והתחל להסתובב למעלה חמישה קילו-הרץ. הנה. נעשה שימוש בספקטרומטר מתקדם של שלושה 500 מגה-הרץ. רכוש ספקטרום NMR של פרוטון באמצעות רצף פולסים CP MG.

על פי הנחיות היצרן, ניתן להשתמש בשיא כפול הגלוקוז האלפא והמספרי השופע ב-5.22 חלקים למיליון כדי לכייל את ספקטרום ה-NMR המתקבל. כדי לפרוק את הרוטור, המשך על ידי הסרת המכסה, באמצעות מסיר המכסה, הברג את סיכת החוט והסר את מרווח הטפלון. בעזרת הבורג הגלילי ניתן לשטוף את המכשיר ביסודיות באמצעות מים וחומר ניקוי.

הופעתם של מטבוליטים של חיידקי המעי במהלך תהליך הקולוניזציה מודגמת בבירור בספקטרום הפרוטונים הזה של פרופיל מטבולי בשתן עבור בעל חיים שהתיישב 20 יום. בעל חיים זה לא הפריש שום סולפט צייתן וכמויות קטנות מאוד של פניל אצטיל גליצין, בקיצור PAG ו-que cell sulfate במצב נטול חיידקים. ככל שהקולוניזציה מתקדמת, שלושת הסמנים הללו של חילוף החומרים של חלבון על ידי מיקרוביוטת המעיים גדלים במידה ניכרת ומגיעים לשיווי משקל ביום ה-20.

על ידי שילוב שיא שלישיית ה-PAG הספציפי, ניתן היה לכמת את העלייה בסמן הספציפי הזה לאורך זמן. תרשים זה מייצג את ריכוז ה-PAG הממוצע במהלך קולוניזציה עבור קבוצה של שבעה בעלי חיים באמצעות ספקטרוסקופיה של פרוטון H-R-M-A-S-N-M-R, הפרופיל המטבולי של הכבד של שני עכברים לפני ואחרי הקולוניזציה. איור זה ממחיש היטב את המידע שניתן להפיק מפרופיל מטבולי מבוסס A-M-A-S-N-M-R.

ניתן לדמיין חומצות אמינו רבות כמו גם מטבוליטים שמקורם בחילוף חומרים אנרגטי. פרופילים אלה מכילים גם מידע רלוונטי לעקה חמצונית, מטבוליזם נוקלאוטידים ומטבוליזם של מתיל אמין. בדוגמה זו, ברור מאוד שהעכבר נטול החיידקים כמעט ולא מציג גליקוגן וכמויות נמוכות מאוד של גלוקוז וטריגליצרידים.

אז בעקבות הליך זה, כך שניתן ליישם כלים סטטיסטיים מרובים כגון כימותרפיה על מנת לקבץ דגימות לוגיות על פי פרופיל מטבולי, ולהדגיש סמנים ביולוגיים הקשורים למצב המטבולי.