Name: לדוגמא הכנה של Mycobacterium tuberculosis תמציות ללימודי metabolomic תהודה מגנטיים גרעיניים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: למדו הכנת תמציות חופשיות-תאים של Mycobacterium tuberculosis לניתוח מטבולומי באמצעות תהודה מגנטית גרעינית. שיטה זו מאפשרת זיהוי מטבוליטים ומיפוי מסלולים מטבוליים לחקר פיזיולוגיית החיידק ופיתוח תרופות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות לכל חברי המעבדות של ד&quot;ר Barletta וד&quot;ר פאוורס על הערות תוך פיתוח הפרוטוקול. אנו מודים לנדים אוסטין לדיונים מועילים והגהה של כתב היד. העבודה המתוארת בכתב היד הזה מומנה על ידי מענקי טייס זרעים לכל אחד מחוקרים המפורטים לעיל מאוניברסיטת ביולוגית מרכז חיזור נברסקה לינקולן (הורה המענק # NCRR 2P20RR 017675, ד &#39;בקר, PI). בנוסף, אנו מבקשים להודות לד&quot;ר אופליה צ&#39;אקון למתן כספים ממענק R21 (1R21AI087561-01A1) לתמיכת המשכורת החלקית של מר Halouska לתקנן שיטות תמ&quot;ג כלול בפרסום זה מחקר ואספקה.

<ol><li>Larsen, M. H., Biermann, K., Tandberg, S., Hsu, T., Jacobs, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Manipulation+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genetic Manipulation of Mycobacterium tuberculosis.</a> Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 10, 2(2007).</li>
<li>Larsen, M. H., Biermann, K., Jacobs, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+Maintenance+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Laboratory Maintenance of Mycobacterium tuberculosis.</a> Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 10, 1(2007).</li>
<li>Clarridge, J. E. 3rd, Shawar, R. M., Shinnick, T. M., Plikaytis, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+use+of+polymerase+chain+reaction+for+detection+of+Mycobacterium+tuberculosis+in+a+routine+mycobacteriology+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Large-scale use of polymerase chain reaction for detection of Mycobacterium tuberculosis in a routine mycobacteriology laboratory.</a> J. Clin. Microbiol. 31, 2049-2056 (1993).</li>
<li>Nguyen, B. D., Meng, X., Donovan, K. J., Shaka, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOGGY%3A+solvent-optimized+double+gradient+spectroscopy+for+water+suppression.+A+comparison+with+some+existing+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Magn.+Reson%22%5BJournal%5D)">SOGGY: solvent-optimized double gradient spectroscopy for water suppression. A comparison with some existing techniques.</a> J. Magn. Reson. 184, 263-274 (2007).</li>
<li>Cui, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolite+identification+via+the+Madison+Metabolomics+Consortium+Database%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Metabolite identification via the Madison Metabolomics Consortium Database.</a> Nat. Biotechnol. 26, 162-164 (2008).</li>
<li>Ulrich, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BioMagResBank%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">BioMagResBank.</a> Nucleic Acids Res. 36, 402-408 (2008).</li>
<li>Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HMDB%3A+the+Human+Metabolome+Database%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">HMDB: the Human Metabolome Database.</a> Nucleic Acids Res. 35, 521-526 (2007).</li>
<li>Kanehisa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KEGG+for+linking+genomes+to+life+and+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">KEGG for linking genomes to life and the environment.</a> Nucleic Acids Res. 36, 480-484 (2008).</li>
<li>Karp, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+the+BioCyc+collection+of+pathway%2Fgenome+databases+to+160+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Expansion of the BioCyc collection of pathway/genome databases to 160 genomes.</a> Nucleic Acids Res. 33, 6083-6089 (2005).</li>
<li>Halouska, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+NMR+metabolomics+to+analyze+the+targets+of+D-cycloserine+in+mycobacteria%3A+role+of+D-alanine+racemase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome.+Res%22%5BJournal%5D)">Use of NMR metabolomics to analyze the targets of D-cycloserine in mycobacteria: role of D-alanine racemase.</a> J. Proteome. Res. 6, 4608-4614 (2007).</li>
<li>Boshoff, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+responses+of+Mycobacterium+tuberculosis+to+inhibitors+of+metabolism%3A+novel+insights+into+drug+mechanisms+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The transcriptional responses of Mycobacterium tuberculosis to inhibitors of metabolism: novel insights into drug mechanisms of action.</a> J. Biol. Chem. 279, 40174-40184 (2004).</li>
<li>Mehaffy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Descriptive+proteomic+analysis+shows+protein+variability+between+closely+related+clinical+isolates+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Descriptive proteomic analysis shows protein variability between closely related clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis.</a> Proteomics. 10, 1966-1984 (2010).</li>
<li>Schnappinger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+Adaptation+of+Mycobacterium+tuberculosis+within+Macrophages%3A+Insights+into+the+Phagosomal+Environment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Transcriptional Adaptation of Mycobacterium tuberculosis within Macrophages: Insights into the Phagosomal Environment.</a> J. Exp. Med. 198, 693-704 (2003).</li>
<li>Schnappinger, D., Schoolnik, G. K., Ehrt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+profiling+of+host+pathogen+interactions%3A+how+Mycobacterium+tuberculosis+and+the+macrophage+adapt+to+one+another%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes.+Infect%22%5BJournal%5D)">Expression profiling of host pathogen interactions: how Mycobacterium tuberculosis and the macrophage adapt to one another.</a> Microbes. Infect. 8, 1132-1140 (2006).</li>
<li>Shui, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomic+profiling+of+host-pathogen+interactions%3A+the+macrophage+response+to+Mycobacterium+tuberculosis+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome.+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomic profiling of host-pathogen interactions: the macrophage response to Mycobacterium tuberculosis lipids.</a> J. Proteome. Res. 8, 282-289 (2009).</li>
<li>Talaat, A. M., Lyons, R., Howard, S. T., Johnston, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+temporal+expression+profile+of+Mycobacterium+tuberculosis+infection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The temporal expression profile of Mycobacterium tuberculosis infection in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 4602-4607 (2004).</li>
<li>Forgue, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMR+metabolic+profiling+of+Aspergillus+nidulans+to+monitor+drug+and+protein+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">NMR metabolic profiling of Aspergillus nidulans to monitor drug and protein activity.</a> J. Proteome Res. 5, 1916-1923 (2006).</li>
<li>Goodacre, R., Vaidyanathan, S., Dunn, W. B., Harrigan, G. G., Kell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics+by+numbers%3A+acquiring+and+understanding+global+metabolite+data%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Metabolomics by numbers: acquiring and understanding global metabolite data.</a> Trends Biotechnol. 22, 245-252 (2004).</li>
<li>Shin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMR-based+Metabolomic+Profiling+in+Mice+Infected+with+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">NMR-based Metabolomic Profiling in Mice Infected with Mycobacterium tuberculosis.</a> J. Proteome Res. 10, 2238-2247 (2011).</li>
<li>Jaki, B. U., Franzblau, S. G., Cho, S. H., Pauli, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+extraction+method+for+mycobacterial+metabolome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Biomed.+Anal%22%5BJournal%5D)">Development of an extraction method for mycobacterial metabolome analysis.</a> J. Pharm. Biomed. Anal. 41, 196-200 (2006).</li>
<li>de Carvalho, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics+of+Mycobacterium+tuberculosis+reveals+compartmentalized+co-catabolism+of+carbon+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Metabolomics of Mycobacterium tuberculosis reveals compartmentalized co-catabolism of carbon substrates.</a> Chem. Biol. 17, 1122-1131 (2010).</li>
<li>de Carvalho, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-based+metabolomic+profiling+of+enzymatic+function%3A+identification+of+Rv1248c+as+a+mycobacterial+2-hydroxy-3-oxoadipate+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Activity-based metabolomic profiling of enzymatic function: identification of Rv1248c as a mycobacterial 2-hydroxy-3-oxoadipate synthase.</a> Chem. Biol. 17, 323-332 (2010).</li>
<li>Marrero, J., Rhee, K. Y., Schnappinger, D., Pethe, K., Ehrt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gluconeogenic+carbon+flow+of+tricarboxylic+acid+cycle+intermediates+is+critical+for+Mycobacterium+tuberculosis+to+establish+and+maintain+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Gluconeogenic carbon flow of tricarboxylic acid cycle intermediates is critical for Mycobacterium tuberculosis to establish and maintain infection.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 9819-9824 (2010).</li>
<li>Tang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+metabolism+in+Mycobacterium+smegmatis+during+the+transition+from+O2-rich+to+O2-poor+conditions+as+studied+by+isotopomer-assisted+metabolite+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Central metabolism in Mycobacterium smegmatis during the transition from O2-rich to O2-poor conditions as studied by isotopomer-assisted metabolite analysis.</a> Biotechnol. Lett. 31, 1233-1240 (2009).</li>
<li>Kweon, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polyomic+approach+to+elucidate+the+fluoranthene-degradative+pathway+in+Mycobacterium+vanbaalenii+PYR-1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">A polyomic approach to elucidate the fluoranthene-degradative pathway in Mycobacterium vanbaalenii PYR-1.</a> J. Bacteriol. 189, 4635-4647 (2007).</li>
<li>Hasan, M. R., Rahman, M., Jaques, S., Purwantini, E., Daniels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+6-phosphate+accumulation+in+mycobacteria%3A+implications+for+a+novel+F420-dependent+anti-oxidant+defense+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Glucose 6-phosphate accumulation in mycobacteria: implications for a novel F420-dependent anti-oxidant defense system.</a> J. Biol. Chem. 285, 19135-19144 (2010).</li>
<li>Soga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+metabolome+analysis+using+capillary+electrophoresis+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative metabolome analysis using capillary electrophoresis mass spectrometry.</a> J. Proteome Res. 2, 488-494 (2003).</li>
<li>Metz, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+liquid+chromatography-mass+spectrometry+%28LC-MS%29+in+metabolic+profiling+and+metabolomic+studies+for+biomarker+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biomark+Med%22%5BJournal%5D)">The future of liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) in metabolic profiling and metabolomic studies for biomarker discovery.</a> Biomark Med. 1, 159-185 (2007).</li>
<li>Ludwig, C., Viant, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+J-resolved+NMR+spectroscopy%3A+review+of+a+key+methodology+in+the+metabolomics+toolbox%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochem.+Anal%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional J-resolved NMR spectroscopy: review of a key methodology in the metabolomics toolbox.</a> Phytochem. Anal. 21, 22-32 (2010).</li>
<li>Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSimpson%2C+RJ+%22Proteins+and+Proteomics%3A+A+Laboratory+Manual%22">Proteins and Proteomics: A Laboratory Manual</a>. Inglis, J. , Cold Spring Laboratory Press. 425-595 (2003).</li>
<li>Beste, D. J., McFadden, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((System-level+strategies+for+studying+the+metabolism+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biosyst%22%5BJournal%5D)">System-level strategies for studying the metabolism of Mycobacterium tuberculosis.</a> Mol. Biosyst. 6, 2363-2372 (2010).</li>
<li>Rhee, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+carbon+metabolism+in+Mycobacterium+tuberculosis%3A+an+unexpected+frontier%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Central carbon metabolism in Mycobacterium tuberculosis: an unexpected frontier.</a> Trends Microbiol. , (2011).</li>
<li>Who. Health Organization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Anti-tuberculosis+Drug+Resistance+in+the+World%3A+Report+No.+4%22">Anti-tuberculosis Drug Resistance in the World: Report No. 4</a>. , (2008).</li>
<li>Jassal, M., Bishai, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensively+drug-resistant+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Extensively drug-resistant tuberculosis.</a> Lancet Infect Dis. 9, 19-30 (2009).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

מספר לא מבוטל של מחקרים נתח את פרופילי transcriptomic וproteomic של מ &#39; שחפת תחת מגוון במבחנה בתנאי vivo. 11-16 סופו של דבר, שינויים בביטוי גנים ופעילות אנזים יובילו לשינויים בריכוזים של מולקולות קטנות משקל מולקולריות. התיאור המלא של תרכובות אלו מהווה metabolome. לכן, יכולות להיות מלווה את ההשפעות של תרופות ותנאי גידול שונה על מסלולים מטבוליים ידי ניתוח metabolomic. 17,18 מחקרים מעטים נצלו מתודולוגיה זו כדי ללמוד במסלולים מטבוליים מ ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב / הציוד </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> העשרת ADC </td><td> BD BBL מידלברוק </td><td> 212352 </td><td></td></tr><tr><td> BACS-120 מחליף לדוגמה </td><td> ברוקר </td><td></td><td></td></tr><tr><td> הברוקר Avance NMR </td><td> ברוקר </td><td></td><td> 500 MHz </td></tr><tr><td> שור הסרום אלבומין </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> BP1600-100 </td><td> החלק V </td></tr><tr><td> סרכזת </td><td> Beckman Coulter </td><td> אלגרה X-15R </td><td> Benchtop </td></tr><tr><td> צינורות צנטריפוגות </td><td> קורנינג </td><td> 430291 </td><td> פוליפרופילן 50 המ&quot;ל סטרילי </td></tr><tr><td> בקבוקוני קריוגני </td><td> קורנינג </td><td> 430488 </td><td> פוליפרופילן סטרילי 2.0 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> Cycloheximide </td><td> AG מדעית </td><td> C-1189 </td><td> רעיל </td></tr><tr><td> D (+) - גלוקוז </td><td> Acros </td><td> 41095-0010 </td><td></td></tr><tr><td> אוקסיד דאוטריום </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> 617385 </td><td></td></tr><tr><td> Flask Erlenmeyer </td><td> VWR </td><td> 89095-266 </td><td> , בסיס שטוח סטרילי, פוליקרבונט, כובע 0.22 מיקרומטר PTFE קרום פרק </td></tr><tr><td> Flask ההקפאה פלאש </td><td> VWR </td><td> 82018-226 </td><td> 750 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> הקפא מייבש </td><td> VWR </td><td> 82019-038 </td><td> 4.5 הליטר Benchtop </td></tr><tr><td> גליצרול </td><td> GibcoBRL </td><td> 15514-029 </td><td></td></tr><tr><td> מדגרה </td><td> ניו ברונסוויק </td><td> Innova 40 </td><td> Benchtop ייקר </td></tr><tr><td> Lysing מטריקס B </td><td> Biomedicals MP </td><td> 6911-100 </td><td></td></tr><tr><td> מכונת תמוגה </td><td> Biomedicals MP </td><td> FastPrep-24 </td><td></td></tr><tr><td> Microcentrifuge </td><td> אפנדורף </td><td> 5415D </td><td> Benchtop </td></tr><tr><td> Microcentrifuge </td><td> Beckman Coulter </td><td> Microfuge 22R </td><td> Benchtop </td></tr><tr><td> מידלברוק 7H9 מרק </td><td> Difco </td><td> 271310 </td><td></td></tr><tr><td> NMR צינורות </td><td> Norell </td><td> ST500-7 </td><td> 5mm </td></tr><tr><td> העשרת OADC </td><td> BD BBL מידלברוק </td><td> 212351 </td><td></td></tr><tr><td> חומצה אולאית </td><td> סיגמא </td><td> O1008 </td><td></td></tr><tr><td> אשלגן זרח Dibasic </td><td> VWR </td><td> BDH0266 </td><td></td></tr><tr><td> אשלגן זרח Monobasic </td><td> VWR </td><td> BDH0268 </td><td></td></tr><tr><td> רוטור - Microfuge 22R </td><td> Beckman Coulter </td><td> F241.5P </td><td> אטום ופוליפרופילן </td></tr><tr><td> רוטור - אלגרה X-15R</td><td> Beckman Coulter </td><td> SX4750 </td><td> עם כיסויים יו מוסמכים </td></tr><tr><td> כלוריד הנתרן </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> S271-3 </td><td></td></tr><tr><td> נתרן-3-trimethylsilylpropionate-2 ,2,3,3-D4 </td><td> קיימברידג&#39; איזוטופ </td><td> DLM-48 </td><td></td></tr><tr><td> ספקטרופוטומטר </td><td> Beckman Coulter </td><td> DU-530 </td><td></td></tr><tr><td> Cuvettes ספקטרופוטומטר </td><td> עורק חיים </td><td> LS-2410 </td><td> פוליסטירן מ&quot;ל 1.5, 2 צדדים ברורים </td></tr><tr><td> מזרק </td><td> הקיטון דיקינסון </td><td> 309585 </td><td> סטרילי, 3 מ&quot;ל luer-Lok </td></tr><tr><td> מזרק סינון </td><td> Nalgene </td><td> 190-2520 </td><td> יצטט תאית סטרילי 0.2 מיקרומטר </td></tr><tr><td> Tween 80 </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> BP338-500 </td><td></td></tr></tbody></table>

לדוגמא הכנה של<em&gt; mycobacterium tuberculosis</em&gt; תמציות ללימודי metabolomic תהודה מגנטיים גרעיניים

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Mycobacterium tuberculosis הוא אחד גורמים עיקריים לתמותה בבני אדם בקנה מידה גלובלי. ההופעה של שניהם רבים-(MDR) ונרחבים-(XDR) זנים עמידים לתרופות מאיימת להרוס את תהליך בקרת מחלות נוכחיות. לפיכך, יש צורך דחוף לפתח תרופות וחיסונים שיעילים יותר מאלה הזמינים כיום. הגנום של מ &#39; שחפת ידועה כבר יותר מ 10 שנים, עדיין קיימים פערים בידע חשוב של תפקוד גן והחיוניות שלנו. מחקרים רבים בשימוש מאז ניתוח ביטוי גנים בשתי רמות transcriptomic וproteomic כדי לקבוע את ההשפעות של תרופות, חמצון, ותנאי גידול על הדפוסים הגלובליים של ביטוי גנים. סופו של דבר, התשובה הסופית של שינויים אלה בא לידי ביטוי בהרכב המטבולי של החיידק כולל כמה אלף כימיקלי משקל מולקולריים קטנים. השוואה בין פרופילים מטבוליים מהסוג פרוע וזנים מוטנטים, גם ללא טיפול או treated עם תרופה מסוימת, יכול למעשה מאפשר זיהוי המטרה, ועלול להוביל להתפתחות של מעכבים חדשים עם פעילות אנטי שחפת. כמו כן, את ההשפעות של שני תנאים או יותר על metabolome יכולות גם להיות מוערכות. תהודה מגנטית גרעינית (NMR) היא טכנולוגיה רבה עצמה המשמשת לזיהוי ולכמת ביניים מטבוליים. בפרוטוקול זה, נהלים להכנתו של מ &#39; תמציות סלולריות חפת לניתוח metabolomic NMR מתוארות. תרביות תאים גדלות בתנאים מתאימים ו3 בלימה ברמת בטיחות הביולוגית הנדרשת, 1 נקטפו, ונתונים לתמוגה מכאנית תוך שמירה על טמפרטורות נמוכות על מנת למקסם את השימור של מטבוליטים. lysates הסלולרי הם התאוששו, מסוננים מעוקרים, ומאוחסנים בטמפרטורות נמוכות במיוחד. Aliquots מתמציות תאים אלה מצופים באגר 7H9 מידלברוק ליחידות מושבה להרכיב כדי לוודא היעדר תאי קיימא. לאחר חודשים של דגירה ב 37 ° C, אם לא viמושבות מסוגלות הם נצפו, דגימות יוסרו ממתקן הבלימה לעיבוד במורד זרם. תמציות הנן lyophilized, resuspended במאגר deuterated ומוזרק במכשיר NMR, לכידת נתונים ספקטרוסקופיות אז זה נתון לניתוח סטטיסטי. ההליכים המתוארים יכולים להיות מיושמים גם לממד יחיד-(1D) H NMR 1 ודו ממדי 1 (2D) H-13 C ניתוחי NMR. מתודולוגיה זו מספקת זיהוי אמין יותר קטן משקל מולקולרי מטבוליט וניתוחים כמותיים אמינים ורגישים יותר של יצירות מטבוליות תמצית סלולרית מאשר שיטות chromatographic. וריאציות של ההליך מתוארת בעקבות צעד תמוגה התא יכול גם להיות מותאם לניתוח proteomic מקביל.

הפרופיל של metabolomic<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; נקבע לאחר צמיחה בתרבויות ציר מרק. תנאים יכולים להיות מגוונים כדי לבדוק את ההשפעות של תוספי תזונה, חמצון, וסוכנים נגד שחפת על הפרופיל המטבולי של מיקרואורגניזם זה. נוהל להכנת תמצית היא ישים עבור שניהם 1D<sup&gt; 1</sup&gt; H ו2D<sup&gt; 1</sup&gt; H-<sup&gt; 13</sup&gt; C ניתוחי NMR.

לדוגמא הכנה של<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; תמציות ללימודי metabolomic תהודה מגנטיים גרעיניים

*Mycobacterium tuberculosis* הוא גורם מרכזי לתמותה בבני אדם בקנה מידה עולמי. הופעתם של זנים בעמידות רב-תרופתית (MDR) ובעמידות נרחבת-תרופתית (XDR)...

מטרתו של הליך זה היא לנתח תמציות נטולות תאים של mycobacterium tuberculosis באמצעות מטבוליזים ב-NMR; ראשית יש לתרבת ולקצור את התאים בשלב גדילה מתאים. לאחר מכן, יש לבצע ליזיס לתאים ולהפיק תמציות נטולות תאים לצורך ניתוח. יש להמיס מחדש את התמציות הליופיליזיות בבופר לצורך ניתוח NMR.לבסוף, אספו נתוני NMR ונתחו את הספקטרום באמצעות תוכנה כדי לזהות מטבוליטים. בסופו של דבר, ניתוח NMR של mycobacterium tuberculosis משמש להדגמת שימור ברמות המטבוליטים תחת טיפולים שונים. ניתן להחיל מטבולומיקה מבוססת NMR על היבטים מרכזיים בפיזיולוגיה של mycobacterium tuberculosis, כגון מסלולים מטבוליים חשובים.הבנה זו היא קריטית כדי להבהיר את מנגנוני הפעולה של התרופות ואת מנגנוני העמידות, וכדי לזהות מטרות חדשות לתכנון תרופות. באופן כללי, אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו עלולים להתקשות עקב חוסר יכולת לטפל בכל הדגימות באופן זהה לחלוטין, דבר שיביא לשונות מיותרת בתוצאות מהמעבדה שלי. סטיבן לוקה, דוקטורנט, ידגים את נהלי הטיפול בדגימות לעיבוד NMR מהמעבדה שלי; כעת ידגימו מנהל מעבדת המחקר ורוברט פנטון, טכנאי מחקר 3, את נהלי הטיפול בתרביות mycobacterium tuberculosis בעת ביצוע עבודות עם M tuberculosis.המחקר בוצע בהתאם לנהלי בטיחות ביולוגית רמה 3 (BSL-3) כפי שהוגדרו בהנחיות המוסדיות. למרות שהתוויות בסרטון זה מציינות microbacterium

sample-preparation-mycobacterium-tuberculosis-extracts-for-nuclear

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

שיטה להפקת המטבוליט מקהילות planktonic חיידקים מוצגת. דגימה כל הקהילה מושג באמצעות סינון על מסנני שהוכנו במיוחד. לאחר lyophilization, מימית מסיסים מטבוליטים חילוץ. גישה זו מאפשרת יישום של metabolomics סביבתיים חוצה omics חקירות של קהילות חיידקים טבעיים או ניסיוני.

ריכוז מטבוליטים של צפיפות נמוכה עבור קהילות Planktonic metabolomics הסביבה באמצעות תהודה מגנטית גרעינית ספקטרוסקופיה

סרטון זה מתאר טכניקה להכנת דגימות תאי סרטן השד לפרופיל מטבוליטים. תאי סרטן השד מטופלים באסטרדיול, הנקשר לקולטן האסטרוגן אלפא וגורם לשינוי בהרכב המטבוליטים.

הכנת דגימות למטבולומיקה: שיטה להכנת דגימות תאים לפרופיל מטבוליטים

הנוירוכימיה של מוח היונקים משתנה במחלות נוירולוגיות ומערכתיות רבות. ניתן להשיג ביעילות פרופילים אופייניים של מטבוליטים מוחיים על סמך תמציות גולמיות של רקמת המוח. לשם כך נעשה שימוש בספקטרוסקופיה של תמ"ג ברזולוציה גבוהה, המאפשרת ניתוח כמותי מפורט של ריכוזי מטבוליט (מטבולומיקה).

ניתוח metabolomic של מוח חולדה על ידי ספקטרוסקופיה בתהודה מגנטית הגרעינית ברזולוציה גבוהה של תמציות רקמות

מאמר זה מציג את השימוש ב-PSYCHE וב-SAPPHIRE-PSYCHE באפיון מטבולי של צמחים וכולל נהלים מפורטים להכנת דגימות והקלטה אופטימלית של ספקטרום NMR Pure Shift. דוגמאות שבאמצעותן נדון הרווח ברזולוציה שהושג על ידי ניתוק הומו-גרעיני המאפשר הבנה מקיפה יותר של המערכת.

תהודה מגנטית גרעינית Pure Shift: כלי חדש למטבולומיקה של צמחים

בפרוטוקול זה אנו מציגים זרימת עבודה ממוטבת, המשלבת הכנת דגימות יעילה ומהירה של דגימות רבות. בנוסף, אנו מספקים מדריך שלב אחר שלב להפחתת וריאציות אנליטיות להערכת תפוקה גבוהה של מחקרי GWAS מטבוליים.

מחקרי אסוציאציה רב-גנומית בקנה מידה גדול (Mo-GWAS): קווים מנחים להכנת דגימות ונורמליזציה

פרוטוקול זה מתאר כרומטוגרפיית אי-הכללת גודל, טכניקה ניתנת לשחזור להעשרת בועיות חוץ-תאיות של Mycobacterium tuberculosis מסופרנטים של תרביות.

מיקובקטריום שחפת העשרת שלפוחית חוץ-תאית באמצעות כרומטוגרפיית אי-הכללת גודל

ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית (NMR) משמשת לזיהוי חוסר ויסות במטבוליטים בחולים עם מחלות שונות. טכניקה זו מאפשרת לכמת את המטבוליטים המופרעים, ולחשוף את התובנות הפתופיזיולוגיות. כאן, אנו מתארים את ההליך שלב אחר שלב של הגישה מבוססת NMR לאפיון מטבולי של החולים.

זיהוי וכימות של מטבוליטים מטורפים בחולים קריטיים באמצעות מטבולומיקה מבוססת NMR

פרוטוקול זה מפריד בין חלבוני דופן התא והממברנה הבלתי מסיסים לשברים פשוטים (1-5 חלבונים) באמצעות מיקוד איזואלקטרי מכין (IEF) המבוסס על נקודה איזואלקטרית, ואחריו הפרדה לפי משקל מולקולרי. ניתן להשתמש בשברים המתקבלים ישירות לניתוח אימונולוגי ופרוטאומי ללא טיהור נוסף.

הפרדה ופיצול של חלבוני דופן התא וקרום התא מ-Mycobacterium tuberculosis לניתוח חלבונים במורד הזרם

פרוטוקול זה מראה שהכאת חרוזים בשילוב עם טיהור חרוזי לכידת DNA מספקת שיטה מהירה ועקבית לחילוץ DNA מדגימות Mycobacterium tuberculosis , מה שהופך אותה לבחירה יעילה עבור יישומי ריצוף של הדור הבא.

מיצוי DNA מיקובקטריאלי באמצעות מכות חרוזים במאגר מותאם אישית ואחריו זרימת עבודה של NGS

פרוטוקול זה מתאר את שיטת ה-CTAB לחילוץ DNA איכותי ממיקובקטריה, תוך התמודדות עם האתגרים שמציבים דפנות התאים הקשות והעשירות בחומצה המיקולית. התהליך כולל עיכול אנזימטי, פירוק תאים באמצעות CTAB, וטיהור DNA באמצעות הפקה אורגנית והשקעת אתנול. שיטה זו מייצרת DNA המתאים למחקרים מולקולריים ואמינה למחקר מיקובקטריאלי.

הפקת חומצה דאוקסיריבונוקלית בגנום מלא ממיני מיקובקטריום באמצעות טכניקת Cetyltrimethylammonium Bromide

למדו הכנת תמציות חופשיות-תאים של Mycobacterium tuberculosis לניתוח מטבולומי באמצעות תהודה מגנטית גרעינית. שיטה זו מאפשרת זיהוי מטבוליטים ומיפוי מסלולים מטבוליים לחקר פיזיולוגיית החיידק ופיתוח תרופות.

לדוגמא הכנה של

גלה סרטונים נוספים