לדוגמא הכנה של Mycobacterium tuberculosis תמציות ללימודי metabolomic תהודה מגנטיים גרעיניים

מטרת הליך זה היא לנתח מיקובקטריום טוברקולוזיס, תמציות נטולות תאים על ידי תרבית מטבולומיקה ראשונה של NMR, ולקצור את התאים בשלב גידול מתאים. לאחר מכן תאי ליסה וקבל תמציות נטולות תאים לניתוח. השהה מחדש את התמציות הליופיליות במאגר לניתוח NMR.

לבסוף, אסוף נתוני NMR ונתח ספקטרום עם תוכנה לזיהוי מטבוליטים. בסופו של דבר, ניתוח NMR של מיקובקטריום טוברקולוזיס משמש כדי להראות שימור ברמות המטבוליטים בטיפולים שונים. ניתן ליישם מטבולומיקה של NMR על היבטים מרכזיים של הפיזיולוגיה של מיקובקטריום טוברקולוזיס, כגון מסלולים מטבוליים חשובים.

הבנה זו היא קריטית להבהרת מנגנוני פעולת הפעולה והעמידות לתרופות ולזיהוי מטרות חדשות לתכנון תרופות. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו בגלל חוסר היכולת לטפל בכל הדגימות בדיוק אותו הדבר, מה שיכניס וריאציות ותוצאות מיותרות מהמעבדה שלי. סטיבן לוקה דוקטורנט לתואר שני ידגים את הנהלים לטיפול בדגימות לעיבוד תמ"ג מהמעבדה שלי, מנהל מעבדת המחקר ורוברט פנטון, טכנאי מחקר שלוש, ידגימו כעת את הנהלים לטיפול בתרביות שחפת מיקובקטריום בעת ביצוע שחפת M.

המחקר עקב אחר פרקטיקות בטיחות ביולוגית ברמה שלוש כפי שהוגדרו בהנחיות מוסדיות. למרות שהתוויות בסרטון זה אומרות מיקרובקטריום טוברקולוזיס משיקולי בטיחות ביולוגית, הדגמה זו השתמשה במיקובקטריום מגמטי לא פתוגני. התחל בהפשרת מלאי גליצרול של 50% של שחפת M על קרח.

חיסון 0.15 מיליליטר לתוך 110 מיליליטר של מרק M-A-D-C-T-W במיון של 250 מיליליטר והבקבוק שלי מגדל את התרביות ב-37 מעלות צלזיוס עם טלטול ב-100 סל"ד למשך כשישה ימים. אם אין צורך באנטיביוטיקה, תוספות חלופיות או טיפולים אחרים. קצרו את התרביות לתרבויות הדורשות טיפולים.

שמור Eloqua של 0.5 מיליליטר על קרח לתרבות, טיטרציה ובקרת איכות. לאחר מכן בצע את הטיפול הרצוי והחזר את התרביות לשייקר לאחר תקופת הטיפול. הסר מיליליטר אחד וקבע את ה-OD 600.

כמו כן, שמור דגימה של 0.5 מיליליטר לתרבית, טיטרציה ובקרת איכות. שמור על התאים על הקרח לאורך כל הפרוטוקול שנותר. קצרו את התאים בארבעה צינורות של 50 מיליליטר על ידי צנטריפוגה לאחר שטיפה במים מזוקקים כפולים קרים כקרח של 15 מיליליטר.

ריס השהה את הכדורים ב-10 מיליליטר. משוך שני אליקוטים וגלולה על ידי צנטריפוגה, ולאחר מכן השהה מחדש את כדור התא בנפח סופי של מיליליטר אחד של מים מזוקקים כפולים. אם רוצים תרחיף תא בודד ללא גושים, העבירו את התאים דרך מחט בגודל 27.

שלוש פעמים המשך להעביר את מתלה התא של מיליליטר אחד למכסה בורג של שני מיליליטר המכיל מטריצת ליזינג B.מקם את ההומוגנייזר המהיר של 24 ליזה בתוך ארון הבטיחות הביולוגית. הנח את הדגימות לתוך מחזיק הדגימה המאבטח את לוחית חישור השמירה. לאחר מכן עבד במשך 60 שניות במהירות של שישה מטרים לשנייה.

לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימות לפסולת תאי גלולה ותאים שלמים. לאחר מכן העבירו את הסופינאט דרך מסנן מזרק של 0.2 מיקרון לתוך צינור סטרילי כדי לשלוט בהיעדר תאים ברי קיימא. צלחת 0.1 מיליליטר של דגימה ב-MADC. אגר.

הקפיאו את הדגימות באמבט קרח יבש עם אתנול ואחסנו בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס עד שהן מוכנות לליופיליזציה ולעיבוד במתקן NMR. לאחר חודשיים, בדוק את הלוחות כדי לוודא היעדר יחידות יוצרות מושבה. אם לא נמצא משתמש CF, ניתן להסיר את הדגימות ממעבדת BSL 3 להמשך ניתוח במתקן NMR סטנדרטי.

לאחר העברת הדגימות ליובש יש להשעות 0.7 מיליליטר של מאגר NMR ולהעביר לצנטריפוגה של צינור מיקרו צנטריפוגה למשך שלוש דקות ב-13,000 פעמים. G, הסר 0.6 מיליליטר והעביר לצינור NMR של חמישה מילימטרים. מניתוח מדיה, מתלה מותאם אישית מקל על העמסת צינורות NMR מרובים לתוך ספינרים בעומק הנכון.

לאחר מכן העבירו את הדגימות לספקטרומטר ה-NMR כדי להכניס ל-A-B-A-C-S מחליף דגימות אחד של 20. לסירוגין בין תרביות לא מטופלות לתרופות שטופלו בתרופות. יש לטעון מראש את הדגימה הראשונה למגנט בתחילת ריצה אוטומטית.

כדי לכייל את המכשיר, בצע אופטימיזציה של אורך הדופק של 90 מעלות עם דגימה בודדת וכוון את המכשיר עבור הדגימות הנותרות. השתמש בסמל NMR ו-grad shim. אוטומציה של נעילת החלקה ואיסוף נתוני NMR עבור כל דגימה.

עבור ספקטרום תמ"ג אחד מימן 1D, בחר את רצף הפולסים עם דיכוי מים ופיסול עירור. הגדר בסך הכל 32,000 נקודות נתונים, 128 סריקות ו-16 סריקות דמה עבור ספקטרום QC של שני DH אחד C 13 hs. בחר את רצף הדופק.

בחר בסך הכל 2048 נקודות נתונים עם רוחב סריקה לאורך הממד הישיר H אחד ו-64 נקודות נתונים עם רוחב סריקה לאורך הממד העקיף C 13. ציין גם איסוף ספקטרום עם 128 סריקות ו-16 סריקות דמה כדי לקבל אות טוב לרעש. ספקטרום של שחפת m יצר כ-400 פסגות, כולל 50 מטבוליטים ידועים.

לדוגמה, עיבוד נתונים כמפורט בכתב היד הנלווה ייצר ספקטרום זה של מטבוליטים הקשורים במישרין או בעקיפין למסלול D אלנין. גודל עוצמות השיא פרופורציונלי לריכוזי המטבוליטים הקיימים בתמצית התא, כך שניתן לכמת הפרעות יחסיות במטבוליטים ובמסלולים מטבוליים בין דגימות לטיפולים. מטבולומיקה של LMR סוללת את הדרך לחוקרים בתחום הבקטריולוגיה לחקור פיזיולוגיה ופתוגנזה במיקרואורגניזמים חזותיים ומיקרובקטריים, אחרים פתוגניים או לא פתוגניים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין תמציות תאי שחפת מרובות למטבולומיקה של NMR, וחשוב לשמור על עקביות לאורך כל הפרוטוקול כדי להשיג תוצאות אמינות.