מתודולוגיה multiplexed Fluorometric immunoassay בדיקה ופתרון בעיות

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לזהות נוגדנים כנגד גורמים זיהומיים הרפתקניים בחיות מעבדה. זה מושג על ידי דגירה של סרום בדיקה עם מיקרוספירות מצופות אנטיגן. לאחר מכן, הסרום מודגר עם אנטי אימונוגלובולין ספציפי למין מתויג ביוטיניל, המזהה כל קומפלקס חיסוני של נוגדנים אנטיגן.

לאחר מכן מתווספת תמיסת כוח פלואור של סטרפטווידין המסומנת FICO eryn Fluor על מנת לזהות תוצאות אימונוגלובולין ביוטיניליות המתקבלות המראות מצב נוגדנים חיובי או שלילי עבור חומרים נפוצים במכרסמי מעבדה על סמך פלואורסצנציה מרובה, ציון נטו של בדיקה חיסונית, ערכי דגימה פלואורסצנטיים. היתרון העיקרי בשימוש בטכניקה זו על פני השיטה הקיימת כמו אלייזה, הוא ש-MFIA היא בדיקת מולטיפלקס. זה מאפשר לחוקר לסנן עד מאה בדיקות שונות בבדיקה אחת.

ובכן, טכניקה זו מפחיתה את כמות אזורי הסרום והכלים החד פעמיים לסילוק המשמשים בשיטות הקיימות תוך הגדלת כמות המידע שנוצר מבדיקה בודדת. ובכן, הרעיון להשתמש בשיטה זו עלה לראשונה כאשר בדקנו מספר רב של דגימות Sera עבור מספר חומרים ורצינו להפחית את זמן העבודה כמו גם את זמן הבדיקה. תדגים את ההליך דונה כהן, טכנולוגית בכירה מהמעבדה שלנו כדי להתחיל, הכינו שני חוצצים הנדרשים להליך המולטיפלקס, הקרינה, הבדיקה החיסונית או ה-MFIA.

הראשון הוא מדלל ראשוני, הזמין מנהר צ'ארלס ומכיל חומרי חסימה קנייניים להפחתת אינטראקציות לא ספציפיות עבור מאגר שטיפת הבדיקה. הכן תמיסה של PBS עם pH 1% BSA 7.4 להסרת חלקיקים. סנן את המאגר דרך יחידה עליונה של בקבוק 0.2 מיקרון למיכלים סטריליים עם תווית באמצעות מאגר שטיפת בדיקה.

הכן שני ריכוזים x של מיני אנטיס ביוטיניליים, IGG או BAG וסטרפטוקוקוס AVID ו-FICO erything או SPE, שישמשו לתיוג קומפלקסי נוגדני האנטיגן שנוצרו במהלך שלב הדגירה בסרום הבדיקה להכנת דגימות של החומרים והחד פעמיים הבאים שהורכבו מיקרופיפטים וטיפים רב-ערוציים וחד-ערוציים, ו-96 צלחות מיקרוטיטר קושרות חלבון נמוכות היטב לדילול חלבון. לאחר איסוף דגימות דם ובידוד מערבולת הסרום לזמן קצר לפני דילול הדגימות בדילול ראשוני בצלחת מיקרוטיטר 96 באר כדי להבטיח פינוי באר תקין ואחיד לפני הרטיבות. כל באר של צלחת הבדיקה של 96 בארות עם מאגר שטיפת בדיקה שואב לאט את התמיסה לאורך כל הבדיקה.

השאיפה אמורה להימשך חמש עד 10 שניות כדי למנוע צבירת חרוזים ודחיסת חרוזים לתוך קרום המסנן, שניהם יכולים להאט את זמני הקריאה בסוף הבדיקה. ודא שניקוז הנוזלים נעצר על ידי ספיגת הצד התחתון של לוחית הבדיקה במגבות נייר. חשוב למחוק את צלחת הבדיקה לאחר כל שלב כביסה כדי למנוע נידוף מהבארות במהלך הדגירה.

להכנת החרוזים התחל במערבולת מתלה החרוזים המצומד. ואז סוניקציה קצרה שלהם באמבטיה. חיוני להשעות את החרוזים כראוי כדי למנוע אשכולות חרוזים מצטברים, מה שעלול לגרום לזמני קריאה ארוכים יותר.

לאחר מכן, חלק את מתלה המלאי פי 20 לתמיסת חרוז עבודה של שני x בדילול ראשוני. לאחר מכן הוצא 50 מיקרוליטר משני מתלי החרוזים x לכל באר בדיקה של לוחית הבדיקה הרטובה מראש. פיפטה 50 מיקרוליטר מכל סרום בדיקה ובקרה של שני x ללוחית הבדיקה על סמך מפת צלחת מוגדרת מראש.

אבטח את המכסה לצלחת. מכסים אותו בנייר אלומיניום ומדגרים את צלחת הבדיקה למשך 60 דקות על שייקר מסלולי בטמפרטורת החדר כדי למנוע אידוי של תמיסות שעלולות למנוע את הצלחת הבדיקה. שמור את צלחת הבדיקה מכוסה במכסה הצלחת במהלך כל שלבי הדגירה.

בנוסף, טלטול המהירות צריך להיות גדול מ-400, אך פחות מ-700 סל"ד כך שהחרוזים יישארו בהשעיה כדי לאפשר לנוגדנים בסרום גישה לכל משטחי האנטיגנים המחוברים לאחר שטיפת הצלחת בדגירה עוקבת של החרוזים עם BAG ו- SPE, שטפו שוב את הדגימות. לאחר מכן השעו מחדש את החרוזים על ידי הוספת 125 מיקרוליטר של בדיקה, שטיפה, חוצץ ונערו במשך שתי דקות כדי לקרוא את הצלחת.

הנח אותו בקורא הבדיקה תוך 10 דקות מרגע ההחייאה של תליית החרוזים, החרוזים עוברים בזה אחר זה דרך גלאי שבו הם נחשפים לשני לייזרים. לייזר אחד מעורר את הצבעים הפנימיים המזהים את ערכת צבעי החרוזים והשני מרגש את צבע הדיווח של FICO. עוצמת הקרינה של FICO עבור מספר קבוע מראש של חרוזים מדווחת כאשר ה-FM FI קרא את הבאר הראשונה כדי לוודא שלוח החרוזים שנבחר תואם את פרופיל החרוזים בבארות הבדיקה.

אם יש חרוזים הנופלים מחוץ לאזור החרוזים המיועד להם בתצוגת הפרוטוקול, נעשתה בחירה שגויהfile חרוזים שהושעו כראוי ימלאו את האזורים שצוינו כפי שמצוין בתוכנת קורא הבדיקה. אם החרוזים מצטברים, הם ימלאו את האזורים שלהם בקצב איטי.

ניתן להסיר את לוחית הבדיקה מהקורא ולהשעות ידנית את הבארות כדי להפריד בין החרוזים. הסר את לוחית הבדיקה מהקורא והשתמש בקצב משולש של פיפטר רב-ערוצי כל באר שלוש עד ארבע פעמים. לאחר מכן החזר את לוחית הבדיקה לקורא והמשך לבחון את התוצאות.

דווח על שגיאות כגון ספירת חרוזים לא מספקת או ירידה בציוני חרוזי IgG נגד IgG, וחזור על הבדיקה עבור דגימות אלה. לאחר ייצוא הנתונים לאקסל וחישוב ה-MFI נטו, קבע אם אחד מבקרות בדיקת הבדיקה אינו כולל את הסרום החיסוני בטווח הגבוה. כל פקדים שנכשלו אינם מקובלים ויש לחזור על הבדיקה.

טבלה זו מייצגת נתונים עבור סרום בדיקה ובקרות בדיקה מלוחית בדיקה טיפוסית. האם כל בקרות ה-IgG עברו. תוצאות הבדיקה למחזה זה מצביעות על כך שדגימות תגובתיות רבות של רקמות ובקרת IgG נכשלו כפי שניתן לראות בבארות כתומות.

A1C one ו-F1 מצביעים על כשל תגובתי ברקמת TC כאשר ציון ה-TC מיוצג בסוגריים, בארות B אחד ו-E אחד ממחישים את שני הסוגים של כשלים בבקרה פנימית של IgG, נוגדנים לא מספיקים לבדיקה או ריאגנטים לבדיקה, BAG או SPE בהתאמה. תוצאות לוחית הבדיקה מתפרשות רק אם בקרת התאמת המערכת ובקרת הסרום עומדות בקריטריוני הקבלה המוצגים כאן. מיקרוספירות המצופות באימונוגלובולין סרום אנטי בדיקה ספציפי למינים יכולות להראות ציונים נכשלים עקב תוספת של דגימה לא מספקת גבוהה מדי, דילול דגימה, מינים שגויים או סרום בדיקה ממארח חסר חיסון.

אם תוצאות בקרת הבדיקה של משחק המבחן משביעות רצון, ציוני הבדיקה הבודדים מסווגים לפי הדברים הבאים. בעקבות הליך זה, עלינו להשתמש בשיטות נוספות כמו אלייזה, IFA ו/או כתם מערבי כדי לאשר את הממצאים הראשוניים הבלתי צפויים או החיוביים. חיוני לאמת את התוצאות הללו לפני קבלת החלטה כלשהי לגבי ניהול בעלי חיים.

ניתן לעשות זאת על ידי שימוש במתודולוגיות שונות על אותה דגימה או דגימות נוספות מאותה מושבה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע את המולטיפלקס פלואורו, הבדיקה החיסונית המטרית, ולפרש את התוצאות המתקבלות במתקן שלך. זה יאפשר לך להפחית את העבודה תוך איסוף מידע נוסף מכל דגימת בדיקה היטב.