מתודולוגיה multiplexed Fluorometric immunoassay בדיקה ופתרון בעיות

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לזהות נוגדנים נגד גורמים זיהומיים מקריים בבעלי חיים במעבדה. מטרה זו מושגת על ידי דגירה של סרום לבדיקה עם מיקרו-ספירות מצופות באנטיגן. לאחר מכן, הסרום מודגר עם נוגדן נגד אימונוגלובולין ספציפי למין המסומן בביוטין, אשר מזהה קומפלקסים חיסוניים של אנטיגן ונוגדן.

לאחר מכן, מוסיפים תמיסת FICO eryn Fluor force המסומנת בסטראפטידין כדי לזהות אימונוגלובולינים מביוטינליים; התוצאות המתקבלות מראות סטטוס נוגדנים חיובי או שלילי עבור פתוגנים נפוצים במכרסמים מעבדה, בהתבסס על פלואורסצנציה מרובה (multiplex fluorescence), ציון נטו של בדיקת אימונו-סורבנט (immunoassay net score) וערכים פלואורסצנטיים של הדגימה. היתרון המרכזי בשימוש בטכניקה זו על פני שיטות קיימות כגון ELISA, הוא ש-MFIA היא בדיקה מרובה (multiplex assay). הדבר מאפשר לחוקר לסרוק עד מאה בדיקות שונות בבדיקה אחת.

טכניקה זו מפחיתה את כמות דגימות הסרום ואת השימוש במוצרים חד-פעמיים בהשוואה לשיטות הקיימות, תוך הגדלת כמות המידע המופק מבדיקה בודדת. הרעיון להשתמש בשיטה זו עלה כאשר בדקנו מספר רב של דגימות סרום עבור מספר סוכנים, ורצינו לצמצם את העבודה ואת זמן הבדיקה. את הפרוצדורה תדגים דונה כהן, טכנולוגית בכירה מהמעבדה שלנו. כדי להתחיל, הכינו שני תמיסות בופר הדרושות לביצוע פרוצדורת MFIA (multiplex fluorescence immunoassay).

הראשון הוא מדלול ראשוני, הזמין מחברת Charles River והמכיל חומרי חסימה קנייניים להפסקת אינטראקציות לא ספציפיות עבור בופר השטיפה של הבדיקה. הכינו תמיסת PBS עם 1% BSA ב-pH 7.4 כדי להסיר חלקיקים. סננו את הבופר דרך יחידת סינון למכסה של בקבוק של 0.2 micron אל תוך מכלים סטריליים מסומנים תוך שימוש בבופר השטיפה של הבדיקה.

הכינו ריכוזים כפולים של נוגדני anti-species הביוטיניליים, IgG או BAG, ושל strep AVID ו-FICO erything או SPE, אשר ישמשו לסמימן של קומפלקסי האנטיגן-נוגדן שנוצרו במהלך שלב אינקובציית הסרום הנבדק. להכנת הדגימות, הכינו את החומרים והמתכלים הבאים: מיקרופיפטים רב-ערוציים וחד-ערוציים עם טיפים מתאימים, ולוחיות מיקרוטיטר של 96 בארות עם קישור חלבוני נמוך (low protein binding) לדילול החלבונים. לאחר איסוף דגימות הדם ובידוד הסרום, ערבבו את הסרום קצרה ב-vortex לפני דילול הדגימות בדילול ראשוני בלוחית מיקרוטיטר של 96 בארות, כדי להבטיח ריקון תקין ואחיד של הבארות. הרטיבו מראש כל בארה בלוחית הבדיקה של 96 הבארות עם באפר שטיפה של הבדיקה, ושאבו את התמיסה לאט לאורך כל הבדיקה.

השאיבה צריכה להימשך בין 5 ל-10 שניות כדי למנוע אגרגציה של חרוזיים ודחיסתם אל תוך ממברנת המסנן, שניהם עלולים להאט את זמני הקריאה בסוף הבדיקה. יש לוודא שניקוז הנוזלים הגיע לסיומו על ידי ספיגה של הצד התחתון של לוח הבדיקה בעזרת נייר סופג. חשוב לספוג את לוח הבדיקה לאחר כל שלב שטיפה כדי למנוע ספיגה קפילרית של נוזלים מתוך הבארות במהלך הדגירה.

להכנת החרוזים, התחילו בערבוב ב-vortex של תרחיף החרוזים המצומדים מהמלאי. לאחר מכן, בצעו סוניקציה קצרה במקלחת אולטרסונית. קריטי להשעות את החרוזים כראוי כדי למנוע היווצרות של צבירי חרוזים מאוגדים, שעלולים להוביל לזמני קריאה ארוכים יותר.

בשלב הבא, העבירו את תרחיף המלאי בריכוז 20x לתמיסת חרוצים בעלת ריכוז עבודה של 2x בדילואנט ראשוני. לאחר מכן, העבירו 50 µL של תרחיף החרוצים בריכוז 2x לכל באער של פלטת הבדיקה שהורטבה מראש. פפיטטו 50 µL מכל סרום בדיקה וסרום ביקורת בריכוז 2x לפלטת הבדיקה בהתאם למפת פלטה שהוגדרה מראש.

הדק את המכסה אל הפלטה. כסה אותה בנייר אלומיניום והדגר את פלטת הבדיקה למשך 60 דקות על שייקר אורביטלי בטמפרטורת החדר, כדי למנוע התאיידות של התמיסות שעלולה לסכל את הצלחת הבדיקה. שמור על פלטת הבדיקה מכוסה במכסה הפלטה במהלך כל שלבי ההדגרה.

בנוסף, מהירות הנעורה צריכה להיות גבוהה מ-400, אך נמוכה מ-700 RPMs, כדי שהחרו지를 יישארו בתהליכי סספנזיה המאפשרים לנוגדני הסרום גישה לכל פני השטח של האנטיגנים המצומדים. לאחר שטיפת הפלטה באינקובציות רצופות של החרוזים עם BAG ו-SPE, שטפו את הדגימות שוב. לאחר מכן, השביו את החרוזים על ידי הוספת 125 microliters של assay, wash, buffer, ונערו למשך שתי דקות לפני קריאת הפלטה.

הכנס את הדגימה לקורא המבחנים (assay reader) בתוך 10 דקות מהשעיית החרוזיים; החרוזים עוברים אחד אחד דרך גלאי שבו הם נחשפים לשני לייזרים. לייזר אחד מעורר את הצבעים הפנימיים המזהים את סט הצבעים של החרוזים, והשני מעורר את צבע הדגימה FICO erything. עוצמת הפלואורסצנציה של FICO erything עבור מספר קבוע מראש של חרוזים מדווחת כ-FM FI. קרא את הבאר הראשונה כדי לוודא שפאנל החרוזים שנבחר תואם לפרופיל החרוזים בבארות הבדיקה.

אם ישנם חרוצים שנופלים מחוץ לאזור החרוצים המיועד בתצוגת הפרוטוקול, פירוש הדבר שנבחר פרופיל שגוי. חרוצים שעברו רספנזיה תקינה ימלאו את האזורים המוגדרים להם כפי שמוצג בתוכנת קורא הבדיקה. אם החרוצים מצומקים (aggregated), הם ימלאו את האזורים שלהם בקצב איטי.

ניתן להוציא את לוח הבדיקה מהקורא ולהשעות ידנית את הבארות כדי להפריד את החרו지를. הוציאו את לוח הבדיקה מהקורא ובעזרת פיפט רב-ערוצי, בצעו שאיבה והחזרת נוזל (triturate) בכל בארה שלוש עד ארבע פעמים. לאחר מכן, החזירו את לוח הבדיקה לקורא והמשיכו בבחינת התוצאות.

יש לדווח על שגיאות כגון ספירת חרוצים בלתי מספקת או ירידה במדדי ה-IgG anti IgG bead, ולחזור על הבדיקה עבור דגימות אלו. לאחר ייצוא הנתונים ל-Excel וחישוב ה-net MFI, קבע אם מי מבקרי הבדיקה נכשל, למעט ה-high range immune serum. בקרים שנכשלו אינם קבילים ויש לחזור על הבדיקה.

טבלה זו מציגה נתונים עבור סרום לבדיקה ובקרות בדיקה מלוח בדיקה טיפוסי. כל בקרות ה-IgG עמדו בדרישות. תוצאות הבדיקה עבור לוח זה מצביעות על כך שדגימות רבות של תגובתיות רקמה ובקרות IgG נכשלו, כפי שניתן לראות בבארים הכתומות.

A1C one ו-F1 מעידים על כשל בתגובתיות רקמת TC, כאשר ציון ה-TC מופיע בסוגריים; Wells B one ו-E one ממחישים את שני סוגי הכשלים בבקרת IgG פנימית, מחסור באנטיגודים של הבדיקה או בריאגנטים של הבדיקה, BAG או SPE בהתאמה. תוצאות לוח הבדיקה מפורשות רק אם בקרת התאמת המערכת ובקרת הסרום עומדות בקריטריוני הקבלה המוצגים כאן. מיקרוספירות מצופות באימונוגלובולין של סרום בדיקה ספציפי למין עשויות להראות ציונים נכשלים עקב הוספה של דגימה לא מספקת, דילול דגימה גבוה מדי, מין שגוי, או בדיקת סרום ממארח עם חסר חיסוני.

אם תוצאות הבקרות במבחן הבדיקה מספקות, ציוני הבדיקה האישיים מסווגים לפי ההנחיות הבאות. לאחר ביצוע הליך זה, עלינו להשתמש בשיטות נוספות כגון ELISA, IFA, ו/או Western blot כדי לאשר ממצאים חיוביים או בלתי צפויים ראשוניים. קריטי לאמת תוצאות אלה לפני קבלת כל החלטה בנוגע לניהול בעלי החיים.

ניתן לבצע זאת באמצעות שימוש במתודולוגיות שונות על אותה דגימה או על דגימות נוספות מאותה מושבה. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה כיצד לבצע את הבדיקה האימונולוגית הפלואורומטרית מרובת המדדים (multiplex fluoro, metric immunoassay), וכיצד לפרש את התוצאות שיתקבלו במעבדתכם. דבר זה יאפשר לכם להפחית את כמות העבודה תוך איסוף מידע רב יותר מכל באר של דגימה לבדיקה.