זיהוי כמותי של חיידקים באמצעות מיקרוספרות מגנטיות עם תווית צבע

קח לוחית בדיקה המכילה תערובת של מיקרוספירות פוליסטירן מגנטיות צבועות פנימית בפלואורופורים שונים מבחינה ספקטרלית.

כל קבוצת מיקרוספרה מחוברת קוולנטית לנוגדני לכידה ספציפיים לחיידקים פתוגניים.

הוסף תערובת חיידקים פתוגנית שנהרגה בחום. דגירה.

נוגדנים ללכידה קושרים את האנטיגנים החיידקיים של המטרה, ויוצרים קומפלקסים של חיידקי מיקרוספרה.

השתמש במפריד מגנטי כדי ליישב מתחמים. השליכו חיידקים לא קשורים ושטפו עם חוצץ.

הוסף נוגדנים לזיהוי חוצץ וביוטיניל, הנקשרים במיוחד לחיידקים הקשורים למיקרוספרה.

הפרד מגנטית את המתחמים ושטוף עם חיץ.

השעו מחדש את המתחמים במאגר. מולקולות מדווחות פיפטה המכילות סטרפטווידין מצומד פלואורופור, הנקשרות לנוגדנים לזיהוי ביוטיניל.

הפרד מגנטית ושטוף את המתחמים. השעו מחדש במאגר.

במהלך ניתוח מבוסס זרימה, הלייזר הראשון מעורר את הפלואורופורים הפנימיים של המיקרוספרה, יוצר חתימות ספקטרליות ייחודיות ומזהה קבוצות מיקרוספרה ייחודיות.

הלייזר השני מעורר את מדווחי הפלואורופור הקשורים לחיידקים במיקרוספרות, מכמת חיידקים על קבוצות מיקרוספרות שונות, ומאפשר זיהוי חיידקים כמותי מרובה.

ללכידת דגימה, התחל בהוספת חמישים מיקרוליטר של מיקרוספרות, או חרוזים מצומדים כדי ללכוד נוגדנים לתוך צלחת של 96 בארות. לאחר מכן, הוסיפו חמישים מיקרוליטר של החיידקים הפתוגניים ואחריהם חמישים מיקרוליטר של PBS-TBN לבארות רקע.

מכסים את הצלחת בחותם צלחת נייר כסף ודוגרים על שייקר צלחת בשמונה מאות סל"ד למשך שעה.

לאחר מכן, הנח את הצלחת על המפריד המגנטי למשך דקה אחת כדי להפריד בין החרוזים. פנה את התמיסה שנותרה, תוך שמירה על הצלחת על מפריד הצלחת המגנטית. לאחר מכן, הקש לייבוש על מגבות נייר מעבדה שלוש עד ארבע פעמים. שוטפים היטב את הבארות עם PBS-TBN פעמיים.

לזיהוי דגימה, הוסף חמישים מיקרוליטר של מאגר בדיקה ואחריו חמישים מיקרוליטר של נוגדן זיהוי ביוטיניל בריכוז של ארבעה מיקרוגרם למיליליטר לבארות.

דגרו את הצלחת בחושך למשך שעה כדי לאפשר אינטראקציה יעילה בין חיידקים וזיהוי נוגדנים. לאחר מכן, הפרד את החרוזים באמצעות המפריד המגנטי ושטוף את החרוזים עם PBS-TBN, כפי שהודגם קודם לכן.

השעו מחדש את החרוזים בחמישים מיקרוליטר של מאגר בדיקה והוסיפו חמישים מיקרוליטר של סטרפטווידין-R-פיקואריתרין או SAPE, מולקולת מדווח פלואורסצנטית. מכסים את הצלחת בחותם צלחת נייר כסף, ודוגרים על שייקר הצלחת למשך 30 דקות.

לאחר שטיפת הבארות, השעו מחדש את החרוזים ב-100 מיקרוליטר PBS-TBN וטענו את הצלחת על המנתח מבוסס הזרימה.

הקלט את הקריאות באמצעות תוכנה מתאימה. ניתן להעריך את ערכי עוצמת הקרינה החציונית נטו עבור כל אורגניזם באמצעות עקומה סטנדרטית כדי לקבוע את העומס החיידקי הקיים בדגימה.