הנדסת Hydrogel Bilayered לשלוט בידול ASC

המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור מטריצה מרוכבת העשויה מחומרים ביולוגיים טבעיים שניתן להשתמש בהם כדי לספק ולהתמיין תאי גזע כדי לסייע בריפוי פצעים. זה מושג על ידי בידוד תאי גזע שמקורם בשומן או SC מחיית ניסוי. לאחר מכן, ה-A SC נטענים על מיקרוספירות צ'יטוזן מוכנות מראש.

לאחר מכן יצוק ג'ל קולגן פרפור, וחרוזי A-S-C-C-S-M מונחים על ג'ל הקולגן. לבסוף, ג'ל פיברין PEG נוצק על ג'ל הקולגן A-S-C-C-S-M, ומוסיפים מדיום. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות את הנדידה הדו-כיוונית בו-זמנית של A SC מחרוז CSM למטריצות פיברין קולגן ו-PEG כאחד.

באמצעות הליך זה, מקור תאי גזע יחיד יכול לקבל רמזים דיפרנציאליים ממיקרו-סביבות פיברין קולגן ו-PEG, ולהיות מגורה באופן דיפרנציאלי לייצר גורמים פליאוטרופיים וליצור רשת של מבנים קדם-וסקולריים. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו חומרים מרוכבים מחומר בודד או תחליפי עור נטולי תאים, הוא שמוצרים אחרים אלה אינם מטפלים באופן פעיל ברה-וסקולריזציה של המוצר על ידי המארח. הרעיון לשיטה זו עלה לנו לראשונה כאשר שמנו לב של-RAD A SE מבודד יש נטייה להתמיין לכיוון פנוטיפ כלי דם כאשר הוא מתורבת במטריצת פיברין חזיר.

תצפית זו הציתה את הרעיון שניתן להשתמש במקור תאי גזע יחיד בו זמנית במערכת המורכבת מחומרים ביולוגיים שונים אחרים. לאחר בידוד וטיפוח תאי גזע שמקורם בשומן או ASCs, הכנת מיקרוספירות צ'יטוזן או CSMs והעמסת ה-ASCs לתוך CSM, הכינו פוליאתילן גליקול, פיברין הידרוג'ל על ידי המסת פוליאתילן גלוט מותאם ל-succinyl glut derate בארבעה מיליליטר של תמיסת מלח טריס. רגע לפני הניסוי, השתמש במסנן של 0.22 מיקרון כדי לעקר את התמיסה.

בבאר תרבית של תערובת צלחות של שש בארות, 500 מיקרוליטר ציר פיברינוגן ו -250 מיקרוליטר ציר PEG דוגרים למשך 20 דקות בחממה לחה של 5% פחמן דו חמצני ב -37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, ערבבו 250 מיקרוליטר של A-S-C-C-S-M שהוכנו בעבר עם תמיסת הפיברינוגן הפגילטית, הוסיפו מיד מיליליטר אחד של תמיסת מלאי תרומבין ובעזרת פיפטה במהירות שלוש פעמים או פעמיים הניחו מיד את תערובת ג'ל התאים לצלחת של 12 בארות ודגרו בתא לח של 5% פחמן דו חמצני בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר מכן, שטפו את פיברין היתד שהתקבל פעמיים עם HBSS ודגרו עם מדיום חיוני אלפא מינימלי בתוספת 10% FBS באינקובטור לח של 5% פחמן דו חמצני ב-37 מעלות צלזיוס תוך שימוש בטכניקות מיקרוסקופ אור סטנדרטיות לאורך תקופה של 11 יום.

שימו לב לנדידת התאים ממעשן הסיגריות לתערובת הג'ל, A-S-C-C-S-M עם קולגן מסוג 1 המופק מגידי זנב חולדה באמצעות שני נתרן הידרוקסיד רגילים. התאם את ה-pH ל-6.8 ופרפר. מוסיפים את תערובת הקולגן המפורר, A-S-C-C-S-M לצלחת 12 באר ודוגרים בחממה לחה של 5% פחמן דו חמצני בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.

לאחר בדיקה שהפרפור הושלם, דגרו את ג'ל הקולגן A-S-C-C-S-M עד 11 יום באינקובטור לח של 5% פחמן דו חמצני בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. התבונן בנדידת תאים ממעשן הסיגריות לג'ל במשך תקופה של 11 יום באמצעות טכניקות מיקרוסקופיה סטנדרטיות כדי לפתח את המבנה הדו-שכבתי כדי לחקור את תכונות הנדידה והאינדוקציה המשותפת של מקור יחיד של תאי גזע. שימוש בשני פיגומי ביו.

הכינו גם את הקולגן וגם את ג'ל הפיברין PEG עם השינויים הקלים הבאים, הכינו מיליליטר אחד של 7.5 מיליגרם למיליליטר קולגן. לאחר מכן מעבירים את התערובת לתוספת תרבית רקמה של שש בארות ודוגרים למשך 30 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס. לאחר פרפור מוחלט, הניחו על פני הקולגן, 200 מיקרוליטר של חמישה מיליגרם A-S-C-C-S-M במדיום תרבית.

לאחר שהמיקרוספירות התיישבו מעל הג'ל, הכינו את ג'ל הפיברין PEG באמצעות 250 מיקרוליטר של מדיום תרבית תאים. לאחר מכן שכבו את תמיסת תרומבין הפיברינוגן הפגילטי על שכבות הקולגן A-S-C-C-S-M. לאחר השלמתו, דגרו את המבנים למשך 30 דקות בחממה לחה של 5% פחמן דו חמצני כדי להשיג השלמה.

לבסוף, הניחו מיליליטר אחד של מדיום בתא העליון מעל המבנה ושלושה מיליליטר של מדיום בתא התחתון. אפיון של SC המוטבע בתוך פיגום זה גילה כי ניתן לדחוס CSM טעון SC בין שכבת קולגן ופיברין peg בו זמנית ולקבל באופן דיפרנציאלי רמזים משתי הסביבות החוץ-תאיות כדי לשגשג בתנאים החדשים שלהם. כפי שמוצג כאן, קולגן תמך ביכולתם של ASCs להישאר תאי גזע כפי שהודגם על ידי ביטוי הסטרו אחד שלהם בירוק, כמו גם המורפולוגיה הפיברובלסטים שלהם.

לעומת זאת, פיברין PEG גרם ל-ASCs להתמיין לכיוון פנוטיפ אווסקולרי כפי שמודגם על ידי המורפולוגיה דמוית הצינור שלהם המוצגת כאן, עם לומן והביטוי הספציפי של תאי האנדותל שלהם של פקטור ברנדנד פון ווילו המוצג כאן באדום. בנוסף, כפי שמודגם כאן, נראה כי פנוטיפים אלה שנצפו מופיעים בשלב מוקדם בתרבית ונשמרו במשך 11 יום. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד תאי גזע שמקורם בשומן של חולדות, להעמיס אותם על צ'יטו ומיקרוספירות ולשלב אותם בהידרוג'ל דו-שכבתי באמצעות חומרים ביולוגיים שאושרו על ידי ה-FDA.

אל תשכח שהביו-חומרים והתאים המשמשים בפרוטוקול זה נגזרים מבעלי חיים ובני אדם ויכולים להיות מסוכנים ביותר אם הם מזוהמים בפתוגנים מהמארח שלהם. ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון ציוד מגן אישי וטכניקות תרבית תאים אספטיות בעת ביצוע הליכים אלה.