Name: הכנת פקטור T צמיחת תאים מן Splenocytes עכברוש (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-31T22:24:33.000+00:00
Duration: 18 min 27 s
Description: למדו הכנת פקטור צמיחת תאי T מספלנוציטים של עכברושים בריאים באמצעות גירוי בקונקנבלין A. שיטה זו מאפשרת הרחבת תאי T אנטיגן-ספציפיים במעבדה לחקר אימונולוגיה ותאי גזע.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח spleens לואיס חולדה (חולדות בין 160-200 הם הטובים ביותר). Dilacerate על קרח בצלחת פטרי המכילות PBS + אנטיביוטיקה (PBS-PS) בעזרת מסננת התא. שים בתוך שפופרת 50 מ&quot;ל. מלא עם PBS-PS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין של 10 דקות ב 4 ° C עד גלולה התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה ב NH 4 Cl 0.15 מ &#39;(5 מ&quot;ל לכל טחול). מערבבים בעדינות עם pipet ברציפות למשך 3 דק &#39;על קרח lyse אריתרוציטים. מלאו את הצינור עם המדיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין של 10 דקות ב 4 ° C עד גלולה התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים. הטחול עכברוש נותן 200-250000000 תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעים התאים ב -2 מיליון דולר מ&quot;ל במדיום שלם: 50 מ&quot;ל לכל בקבוק 75 ס&quot;מ 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תנו לגדול במשך 48 שעות בחממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין 15 דקות ב 4 ° C עד גלולה התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את supernatant; להשליך את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 15 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​mannoside מתיל אל supernatant. מערבבים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסנן (0.2 מ&quot;מ) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot ולאחסן ב -20 ° C. יכול להיות כל הזמן על 4 מעלות צלזיוס למשך 10 ימים במקרה הצורך. </li></ol>

<ol><li>Beeton, C., Barbaria, J., Devaux, J., Benoliel, A. -M., Gola, M., Sabatier, J. -M., Bernard, D., Crest, M., Beraud, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+blocking+of+voltage-gated+K%2B+channels+treats+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+and+inhibits+T-cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Selective blocking of voltage-gated K+ channels treats experimental autoimmune encephalomyelitis and inhibits T-cell activation.</a> J. Immunol. 166, 936-944 (2001).</li>
<li>Beeton, C., Wulff, H., Barbaria, J., Clot-Faybesse, O., Pennington, M., Bernard, D., Cahalan, M. D., Chandy, K. G., Beraud, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+blockade+of+T+lymphocyte+K%2B+channels+ameliorates+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%2C+a+model+for+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad%22%5BJournal%5D)">Selective blockade of T lymphocyte K+ channels ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis, a model for multiple sclerosis.</a> Proc. Natl. Acad. 98, 13942-13947 (2001).</li>
<li>Mor, F., Cohen, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+of+Lewis+rat+encephalitogenic+T+cell+lines%3A+T-cell-growth-factor+is+superior+to+recombinant+IL-2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Propagation of Lewis rat encephalitogenic T cell lines: T-cell-growth-factor is superior to recombinant IL-2.</a> J. Neuroimmunol. 123, 76-82 (2002).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

אנחנו מכינים TCGF מ splenocytes לואיס עכברוש מאז שאנחנו בקביעות להרדים חולדות נאיבי מהמאמץ הזה לקצור בסרום thymi לעורר לואיס עכברוש T שורות תאים במבחנה. TCGF זה יכול לשמש כדי לקדם את הצמיחה ואת ההישרדות של שורות תאים T מ זני עכברים אחרים. TCGF יכול גם להיות מוכנים מן זנים אחרים של חולדות.

כדי להכין מדיום תרבות להשלים את הפעולות הבאות כדי להוסיף בקבוק 500 מ&quot;ל של RPMI 1640 וסטרילי, מסנן: FCS 10%; 1 בקבוק סן ז&#39;רמן: 5 מ&quot;ל ויטמינים RPMI; 5 נתרן pyruvate מ&quot;ל, 5 מ&quot;ל שאינם חיוניים חומצות אמינו, 50 אממ בטא mercaptoethanol; 2 UG / ml Concanavalin א

הכנת פקטור t צמיחת תאים מן splenocytes עכברוש

Preparing T Cell Growth Factor from Rat Splenocytes

תחזוקה של אנטיגן ספציפי לערמונית T שורות תאים או שיבוטים בתרבות דורש הפעלת סיבובים של אנטיגן-Induced מופרדות שלבי 1,2 הרחבת התא. תוספת של אינטרלוקין 2 לתקשורת התרבות בשלב ההתרחבות נחוצה כדי למנוע מוות של תאים ו מספיק כדי לשמור לטווח קצר שורות תאים T אבל הוכח להגדיל Th1 קיטוב 3. החלפה של אינטרלוקין 2 בפקטור תא T צמיחה (TCGF) אשר מכיל תערובת של ציטוקינים הוא יעיל יותר מאשר אינטרלוקין 2 בשמירה לטווח ארוך שורות תאים T במבחנה 3. יתר על כן, TCGF יכול בקלות להיות מוכנים בכמויות גדולות במעבדה, והוא הרבה יותר זול מאשר רקומביננטי אינטרלוקין 2. כאן, אנו מראים כיצד להכין TCGF מ supernatants עכברוש splenocyte תרבות. במשך התהליך הזה, שאנחנו קוצרים spleens מ נאיבי חולדות לואיס מורדמים עבור התימוס ואיסוף הדם. אנחנו מכינים תא בודד השעיות מן spleens, lyze את כדוריות הדם האדומות של הלם אוסמוטי, ואת הזרע splenocytes במדיום תרבות. התאים מגורה עם concanavalin, mitogen כי הלא סלקטיבי מפעיל כל T לימפוציטים עכברוש, וישכנע את הייצור של ציטוקינים. Supernantant תרבות נאסף 48 שעות לאחר מכן concanavalin andexcess חייב mannoside מתיל אלפא כדי למנוע את הפעלת הקווים תא T אשר TCGF יתווספו. TCGF אז הוא סטרילי, מסונן, aliquoted, ומאוחסנים ב -20 ° C.

אנו מתארים את הכנת גורם תא T צמיחה המשמש הרחבה של מבחנה של אנטיגן ספציפי לערמונית קווי עכברוש T לימפוציטים.

הכנת פקטור T צמיחת תאים מן Splenocytes עכברוש

תחזוקה של שורות תאי T או של קלונים ספציפיים לאנטיגן בתרבית דורשת סבבים של הפעלה מושרית על ידי אנטיגן, המופרדים על ידי פאזות של הרחבת תאים 1,2. ...

שלום, אני כריסטין ביטון. אני עזרת מחקר במעבדה של ג'ורג' צ'ן במחלקה לפיזיולוגיה וביופיזיקה של אוניברסיטת קליפורניה באירוואין. ובשני הימים הבאים אראה לכם כיצד להכין TCGF, שהוא קיצור של T cell growth factor.לכן, עבור תרביות תאים שגרתיות, כאשר איננו זקוקים לידע מדויק על הרכב הציטוקינים במצע התרבית, אנו משתמשים ב-T-cell growth factor, שהוא על-נוזל (supernatant) מתרבית של תאי טחול, המכיל את הציטוקינים הדרושים לסיוע בהתרחבות תאי ה-T. דרך ההכנה של ה-TCGF היא על ידי הוצאת הטחול מחולדות Lewis בריאות, הכנת תרחיף של תאים בודדים, הסרת תאי הדם האדומים באמצעות ליזיס, ולאחר מכן גירוי של התאים המונונוקליאריים באמצעות Con A (Concanavalin A), אשר יעניק גירוי לתאי ה-T להפיק את כל הציטוקינים הדרושים לצמיחתם. כדי להפיק את ה-TCGF, עלינו להפעיל את התאים.הדרך שבה אנו מבצעים זאת היא על ידי הוספת לקטין Concanavalin A, המקוצר כ-Con A, לתרבית התאים שלנו. כאשר אנו מוסיפים Con A לתרבית התאים, הוא נקשר לקומפלקס הקולטן של תאי T הגליקוזילציה, ובשל הקישור למספר קומפלקסים בו-זמנית, הוא יבצע תהליך הנקרא capping. כך הוא יגרום לאגרגציה, ויצור צבר של כל הקולטנים על פני השטח של התא, דבר שישרה אות פעולה בלימפוציטים מסוג T.לאחר שהתאים הופכים לפעילים, הם יעברו תהליך של blast. כלומר, הם יגדלו ואז יתחילו להפריש ציטוקינים. בתחי

preparing-t-cell-growth-factor-from-rat-splenocytes

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אקס הרחבה vivo של גידול תאים T-reactive באמצעות 1/Ionomycin Bryostatin ואת גמא נפוצים שרשרת גיבוש ציטוקינים

סרטון זה מדגים את ההקרנה של תרכובות אימונומודולטוריות באמצעות בדיקה מבוססת פלורסנט. לימפוציטים T שמקורם בעכבר מהונדס עם קלטות ביטוי חלבון פלואורסצנטי ירוק מטופלים בתרכובות אלה. אותות ה-GFP המשופרים והמופחתים מאפשרים לזהות את ההשפעות הממריצות והמעכבות של התרכובות, בהתאמה.

בדיקה מבוססת פלואורסצנטיות המשתמשת בלימפוציטים מהונדסים לבדיקת תרכובות אימונומודולטוריות

הסרטון מציג בדיקה מבוססת ציטומטריה של זרימה להערכת דומיננטיות חיסונית בלימפוציטים ציטוטוקסיים מסוג T או בתגובות CTL. תאי מטרה פלואורסצנטיים מוזרקים מציגים פלואורסצנטיות משתנה המתאימה לאפיטופים אימונוגניים. איסוף ומיון לאחר הטחול חושפים ירידה בתאים פלואורסצנטיים בעוצמה גבוהה, מה שמאשר דומיננטיות חיסונית בתגובות CTL.

בדיקה להערכת דומיננטיות חיסונית בתגובות לימפוציטים ציטוטוקסיים מסוג T

ניתן למנף את ההשפעות הלימפודו-דפלטיביות והאימונומודולטוריות של טיפול סטנדרטי בכימותרפיה והקרנות כדי לשפר את היעילות האנטי-גידולית של אימונותרפיה של תאי T. אנו מתארים שיטה ליצירת תאי T קולטני אנטיגן כימריים ספציפיים ל-EGFRvIII (CAR) ומתן אותם בהקשר של סטנדרט הטיפול בגליובלסטומה.

דור של תאי T CAR למאמצת תרפיה בהקשר של גליובלסטומה טיפול סטנדרטי

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לגרום סובלנות ב השתלת ולאחר להעריך חוץ גופית בתוך ויוו הקיבולת המדכא של תאים נפרדים קבוצות משנה של המטופל, את מצב המערכת החיסונית של המטופל כלפי התורם או אנטיגנים אקסוגני.

במבחנה In Vivo למזהמים סביבתיים T, B והתאים מיאלואידית פעילות מדכא ומענים ההורמונאלית מן המקבלים

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול לייצר במהירות, reproducibly articifical בהשראה ביולוגית, מתכלה אנטיגן הצגת תאים (aAPC) עם tunable גודל, צורה של הדם המצגת ל- T cell הרחבה שמחוץ או ויוו .

ייצור של אניסוטרופי אנטיגן מלאכותי פולימריים הצגת תאי CD8 + T Cell ההפעלה

אנו מתארים כאן הזרימה cyvivo try מבוסס בתוך שיטת ההרג המאפשרת לבדוק את החיסונית של האימונוטוקסיט T לימפוציטים (CTL) התגובות של הגידול מודל אנטיגן. אנו מספקים דוגמאות לאופן השימוש בבחינה אלגנטית זו למחקרים מכניסטיים ולבדיקת יעילות בסמים.

תפירה Vivo ציטורעילות Assays ללמוד אימונומימינינס ב-CD8 התגובות הספציפיות לגידול של תאים

המטרה של פרוטוקול זה היא להראות כיצד להשתמש במיקרוסקופיה של יריעות האור כדי להמחיש באופן זמני את הדינמיקה של קולטן פני השטח בתאים חיים. כאן קולטני תא T על CD4+ תאי t הראשי מוצגים.

דמיין את הדינמיקה של משטח הפני-תא באמצעות מיקרוסקופ גיליון אור של סריג

פרוטוקול זה מספק אסטרטגיית קו-קולטורציה במבחנה לחקר השפעות תאי T רגולטוריים על התרבות והבדייל של תאי T אפקטוריים.

In-Vitro ניתוח פונקציונלי של תאי T רגולטוריים: התמקדות בהתרבות ובהתמיינות

וידאו זה מדגים שתי שיטות להכנת והצבת חרוזים, אשר היה מצופה גורם הגדילה, על explants של קליפת המוח המתפתח. חרוזים אלה יכולים לשמש כדי לעורר ביטוי גנים מוגבל מרחבית על פיתוח רקמות עצביות כגון explants forebrain. שיטות ניתנים לשימוש הן Affi-Gel חרוזים חרוזים acryllic הפרין.

פקטור מצופה צמיחה השמה ביד על Explants forebrain הגבי

למדו הכנת פקטור צמיחת תאי T מספלנוציטים של עכברושים בריאים באמצעות גירוי בקונקנבלין A. שיטה זו מאפשרת הרחבת תאי T אנטיגן-ספציפיים במעבדה לחקר אימונולוגיה ותאי גזע.

הכנת פקטור T צמיחת תאים מן Splenocytes עכברוש

גלה סרטונים נוספים