הכנת פקטור T צמיחת תאים מן Splenocytes עכברוש

שלום, אני כריסטין ביטון. אני עוזר חוקר במעבדה של ג'ורג' צ'ן במחלקה לפיזיולוגיה וביופיזיקה של אוניברסיטת קליפורניה באירווין. וביומיים הקרובים אני הולך להראות לכם איך להכין TCGF, ראשי תיבות של T cell growth factor.

אז עבור תרבית התאים היומיומית שלנו, כאשר איננו זקוקים לידע מדויק על הרכב הציטוקינים במדיום התרבית, מה שאנו משתמשים בו הוא גורם גדילה של תאי T, שהוא סופרנטנט S מתרבית spl CY המכיל את הציטוקינים הנדרשים כדי לעזור לתאי ה-T להתרחב. אז הדרך שבה אנו מכינים את ה-TCGF היא כאשר אנו הורגים חולדות לואי בריאות, אנו לוקחים את הטחול שלהן, מכינים תרחיף של תא בודד, נפטרים מתאי הדם האדומים על ידי כך, ואז את התאים החד-גרעיניים אנו הולכים לעורר עם קרנבל ב-a, מה שיגרום לתאי ה-T לייצר את כל הציטוקינים הדרושים לגדילתם. כדי לייצר את ה-TCGF, אנו צריכים להפעיל את התאים.

אז הדרך שבה אנחנו עושים את זה היא שאנחנו הולכים להוסיף לקטין קונבל בקיצור קורונה A לתרבית התאים שלנו. אז כאשר אנו מוסיפים את ה-conc ב-a לתרבית התאים שלנו, הוא הולך להיקשר לקומפלקס הקולטן של תאי T מסוכררים ולהיקשר למספר קומפלקסים בו זמנית, זה הולך לעשות את מה שאנו מכנים מכסה. אז זה הולך להצטבר, ליצור מקבץ של כל הקולטנים על פני התא וזה הולך לגרום לאות הפעלה בלימפוציטים T.

אז אחרי שהתאים הופעלו, הם הולכים להתפוצץ. אז הם הולכים לגדול ואז הם יתחילו להפריש ציטוקינים. אז במקור חשבנו ש-TCGF הוא בעיקר אינטרלוקין 2, אבל עכשיו אנחנו יודעים שזה לא באמת המקרה.

הוא מכיל גם אינטרפרון גמא TNF אלפא וכנראה גם ציטוקינים בכמויות קטנות מאוד שרק נחוצות כדי לשמור על התאים בחיים לאחר 48 שעות בתרבית, התאים ייצרו את כל הציטוקינים הדרושים לנו. אז אנחנו הולכים להסיר את התאים וכאשר יש לנו את התאים ויש לנו רק את הסופרנטנט, עדיין יש לנו קצת קונאל חופשי ב-a. וזו הולכת להיות בעיה מכיוון שאנחנו באמת רוצים להשתמש בגורם הגדילה של תאי ה-T שלנו כדי לשמור על גדילת קווי תאי T.

ואם נשאיר את ה-conval בחלל חופשי שם, הוא יפעיל את התאים כאשר איננו רוצים שהם יופעלו. אז כדי לעקוף את הבעיה הזו, אנחנו הולכים להוסיף עודף של סוכר שהולך להיקשר לכל הקונק החופשי באוכל. כך שהוא יהיה מנוטרל לחלוטין ולא ייקשר לקולטנים מגליקוזיליים אחרים בתאים כאשר נוסיף את ה-TCGF לתרבית.

אז בואו נתחיל. הצעד הראשון לניסוי זה הוא להוציא טחול מחולדה מיד לאחר המתת חסד. אז זה מה שאני הולך לעשות מיד באמצעות מכשירים סטריליים.

וברגע שאני מוציא את הטחול, אני הולך לשים אותם ב-PBS בתוספת אנטיביוטיקה וכאנטיביוטיקה אני משתמש בפניצילין וסטרפטומיצין. אז בואו נתחיל. אז אני מרסס את החולדה עם 70% אתנול כדי להבטיח שלא יהיה לי זיהום גבוה של התרבות שלי.

ואז באמצעות הכלים שלי, אני הולך לעשות חתך קטן בעור כאן. ואז אני מסיר את שכבת השריר והטחול מופיע ממש כאן. אז אני לוקח פינצטה אחרת, אני שולף בעדינות את הטחול מבלי לפגוע בו.

אני מסיר את רקמת החיבור ככה. אז עכשיו יש לי טחול. כמובן שאני נזהר מאוד לא לפגוע בשום דבר אחר בתוך חלל הבטן כי כל נזק למעי יוביל לזיהום מיידי של הטחול שלי.

ואז אני הולך להעביר את הטחול שלי לתוך צינור המכיל PBS בתוספת אנטיביוטיקה. ואת הצינור הזה אני שומר על קרח. אז עכשיו קצרתי את הטחול משלוש חולדות.

אז אנחנו מוכנים ללכת ולהכין תרחיף תא בודד מהטחול הזה. אז עכשיו כשיש לי את הטחול שלי, הבאתי אותם לתרבית רקמה כדי להכין מהם תרחיף תא בודד באמצעות מאמני תאים של 70 מיקרון. אז אני אצטרך כמה דברים כדי להפוך את התרחיף של התא הבודד מהטחול.

אני צריך מכשירים סטריליים, זוג מלקחיים ומספריים אחד. ואז יש לי את הבוכנה של מזרק סטרילי של מיל בצלחת הפטרי. אני הולך לשים את הטחול שלי ב-PBS בתוספת אנטיביוטיקה.

ובצלחת פטרי אחרת שמתי מסננת תאים של 70 מיקרון ב -10 מיליליטר PBS בתוספת אנטיביוטיקה. אז הצעד הראשון הוא לוודא שהטחול נקי כי כפי שאתם יכולים לראות כאן, עדיין יש חתיכות קטנות של רקמת הלחמית ואני הולך להסיר אותן כי הן הולכות לסתום את מסננת התאים ממש מהר. אז בשביל זה, אני פשוט חותך את מה שאני לא רוצה וזורק אותו למכסה של צלחת הפטרי.

אז עכשיו הטחול שלי נקי ברובו, אז אני הולך לקחת את הטחול אחד אחד, לשים אותם במאמן התאים ולחתוך אותם לחתיכות קטנות ואני מערבב את כל שלושת הפל. השלב הבא הוא ביצוע תרחיף תא בודד. אז כמובן שמכיוון שאני רוצה הכל סטר, אני לא נוגע במאמן הסלולר בכלל ואני משתמש בבוכנה של מזרק סטרילי של מיל אחד כדי ללחוץ את חתיכות הטחול שלי דרך מאמן התאים.

וכפי שאתה יכול לראות בחלק החיצוני של מאמן התאים, יש לי תרחיף תא בודד שנוצר. אז בפעם הראשונה עדיין יש לי כמה חתיכות קטנות של טחול, אבל אני כבר הולך להוציא את התרחיף החד-תאי. כבר העברתי אותו לצינור של 50 מיל שאחסנתי על קרח.

ואני הולך למלא מחדש את מסננת התאים שלי בעוד 10 מיל של PBS ואנטיביוטיקה. אז אני לוקח עוד 10 מיל מה-PBS שלי עם אנטיביוטיקה בערך, לא חייב להיות מדויק מאוד 10 דקות, אנחנו רק שוטפים. אני מכניס אותו למסננת התאים ואז אני משתמש באותו הליך.

אני חוזר לבוכנת המזרק שלי ולוחץ עוד קצת על האוזיד. אז כמובן שלעולם לא תצליח לעבור הכל כי יש רקמת לחמית וחתיכות שומן קטנות שלא הצלחתי להסיר שיישארו במסננת התאים. אבל אתה צריך לקבל את רוב הטחול שלך למסננת התאים.

ואז אני חוזר בדיוק על מה שעשיתי קודם. אני הולך לקצור את התרחיף החד-תאי שלי ולהוסיף אותו לאותה שן. עד עכשיו כמעט ולא נשאר שום דבר מהמסך במסנן התאים וה-PBS שיוצא הרבה יותר ברור ואני הולך פשוט לשטוף פעם נוספת ואנחנו אמורים להוציא את רוב התאים עד עכשיו.

אז עכשיו יש לי את התרחיף התא היחיד שלי של ציטי PLE ואני הולך לסובב אותם פשוט כדי לפלוט אותם. אז סיבוב של שמונה עד 10 דקות יספיק. אז עכשיו סובבנו את ציטי ה-PLE שלנו ויש לנו פלטה נחמדה.

אז מה שאני הולך לעשות זה להיפטר מהסופרנטנט ואז אני הולך לשים את כדוריות הדם האדומות. אז אני הולך להשהות מיוציטים ואני הולך לאמוניום כלוריד. אז זה SU תמיסה של oh point 15 אמוניום כלוריד מולארי ואני הולך להשתמש בחמישה מיליליטר לטחול.

אז מכיוון שהיו לי שלושה טחולים, אני הולך להשתמש ב-15 מיליליטר אמוניום כלוריד ואני הולך לעשות את זה על קרח. אז כדי להניח את האריתרוציטים, אני הולך לזלף אותו בעדינות למעלה ולמטה במשך שלוש דקות. אוקיי, נשתמש בטייק הזה עם החשיפה הגבוהה יותר כאן.

אז עכשיו ניתחתי את האלקטרוציטים במשך שלוש דקות. אני הולך למלא את השפופרת שלי ב-PBS או שאתה יכול להשתמש גם במדיום. זה כדי להחזיר את האוסמולריות של התמיסה לטווח הנורמלי של התאים.

ואני הולך לסובב את התאים כמו שעשיתי בעבר במשך שמונה עד עשר דקות כדי לגלול אותם. ואז אני שוטף אותם פעמיים באמצעות אותו PBS עם אנטיביוטיקה. אז עכשיו אנחנו משתרעים במורד התאים לאחר איזמון האלקטרוציטים ואל תדאגו שלעולם לא נקבל שחרור של מאה אחוז מהאלקטרוציטים.

אז המזרן עדיין יהיה אדום, אבל הסופרנטנט יהיה ברור יותר. ועכשיו אני הולך לרוקן את הסופרנטנט, לשבור את המשטח, להוסיף קצת PBS עד 50 מיל, לסובב ולחזור על השלב הזה פעם נוספת כדי שיהיו לי שתי שטיפות ואז אוכל לספור את עצמי. שטפתי מיוציטים פעמיים ואז תליתי אותם במדיום תרבית וספרתי אותם באמצעות הציטומטר שלך.

כצפוי. משלושה טחולים קיבלתי כ-600 מיליון תאים, וזה צפוי מכיוון שטחול אחד נותן לנו בדרך כלל 200 עד 250 מיליון תאים. אז מה שאני הולך לעשות עכשיו זה שאני הולך לזרוע את התאים שלי ב-2 מיליון לטחנה במדיום שלי שקיבל תוספת של 10% סרום קלוריות עובריות.

ולמדיום הזה אני הולך להוסיף שני מיקרוגרם לכל מיל של conc A כדי לעורר את התאים. ואחרי זה אני פשוט הולך לשים את התאים באינקובטור למשך 48 שעות. התאים נמצאים כעת באינקובטור במשך 48 שעות וכפי שאראה לכם, הם גדלו די טוב.

המדיום הפך לכתום. אז עכשיו אנחנו מוכנים לסיים את ההכנות שלנו ל-TCGF. כפי שאתה זוכר, הוספתי קון קרנבל במתלה בתא שלי כדי להפעיל את התאים.

אז הקרנבל ב-a הוא לקטין. זה הולך לקשור את הסוכרים על כל הקולטנים של תא ה-T וזה הולך להפעיל באופן מלאכותי את כל התאים האלה. הבעיה שיש לנו עכשיו היא שעדיין יש לנו חלק מהקרנבל בתא S.

ומכיוון שאנחנו הולכים להשתמש ב-snat בתרביות תאי T אחרות כדי להרחיב את התאים, אנחנו לא רוצים שה-con carnaval יהיה נוכח בתרביות התאים האלה. אז כדי להיפטר מזה, מה שאני הולך לעשות זה להוסיף עודף של סוכר שאליו קון נבל בקושר, וזה מתיל אלפא D ציט המוצג כאן. ואני הולך להוסיף עודף של הסוכר הזה ולהמיס אותו לחלוטין.

זה הולך לקשור את כל ה-conc naval שנותר ב-a וברגע שזה יסתיים, אני הולך לסנן את הסופרנטנטים הסלולריים שלי ואני הולך להקפיא נוזלי עלי לשימוש בשבועות או בחודשים הקרובים. אז בואו נתחיל בשלב האחרון הזה. אז אני מוסיף את תרבית התאים שלי לצינורות של 50 מיל כדי להיות מסוגל לסובב אותם כדי להיפטר מהתאים.

אז אני פשוט ממלא כמה שפופרות שצריך ואני לא עושה את זה במכסה המנוע, אני יכול, אבל מכיוון שאני צריך כל דרך לסנן את התמיסה שלי בסופו של דבר כי אני מוסיף את הסוכר, שהוא לא סטרילי, אני פשוט עושה את זה על הספסל. זה קל יותר. עכשיו שפכתי את כל התאים שלי וסופרנטנט לתוך שפופרות הבז שלי בנפח 50 מיל

אז אני הולך להביא אותם לצנטריפוגה ולסובב אותם במשך כ-10 דקות. והסיבה היחידה לסובב אותם היא כדי לגלול את התאים כך שיהיו לי סופרנטנטים שקופים. התאים נמתחו עכשיו כלפי מטה, כך שהסופרנטנט צלול וזה מה שרציתי לאסוף.

אז אני הולך לאסוף את כל הסופרנטנט לבקבוק נקי של 150 סנטימטרים רבועים. ולבקבוק הזה אני הולך להוסיף את הסוכר. אז בזמן שהתאים הסתובבו למטה, שקלתי מספיק סוכר כדי להוסיף 15 מיליגרם למ"ל של סופרנטנט.

אני הולך לשחרר לגמרי, לתת לזה להתמוסס, ואחרי זה אני הולך לסנן את הסופרנטנט שלי. אז עכשיו אני הולך להוסיף את הסוכר 15 מיליגרם למ"ל סופרנטנט. אני מחזיר את הפקק ומכיוון שאני לא עובד בתנאים סטריליים, זה לא משנה אם אכילה נכנסת למכסה, אז אני מערבב עד שכל הסוכר נמס.

זה אמור להיות די מהר. כן, כל הסוכר מומס עכשיו. אז כל מה שאני צריך לעשות זה שהמסנן הסטרילי הוא סופרנטנט ואז אני הולך לצטט אותו.

אז בדרך כלל אני עושה 10 עד 15 מיל אליקוט שאני מאחסן במינוס 20 מעלות. ניתן לאחסן אליקוטים כאלה למשך מספר חודשים. אתה יכול גם לאחסן את ה-TCGF שלך במקרר, אבל אז הייתי משתמש בו תוך 10 עד 15 הימים הבאים.

במהלך היומיים האחרונים, הראיתי לכם כיצד להכין גורם גדילה של תאי T, והסופרנטנט הזה פשוט מאוד להכנה וזול מאוד להכנה. לכן אנו משתמשים בו לעתים קרובות מאוד במעבדה כדי לתחזק את קווי תאי ה-T שלנו בתרבית מבלי שנצטרך לקנות קוקטיילים יקרים של ציטוקינים. אז בהצלחה עם הניסויים שלך.