מכרסם איי הערכת שכפול של התא פונקציה בטא Adenovirally-transduced מבודדים

המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות מסלולי איתות המווסתים שינויים במסת תאי בטא תפקודיים. זה מושג בלולאות חולדה מבודדות על ידי ביטוי יתר או דיכוי ביטוי של גן באמצעות וקטורים אדנו-ויראליים. לאחר מניפולציה זו, תפקוד תאי הבטא מוערך על ידי הפרשת אינסולין ושכפול לולאות הנמדד על ידי שילוב תימידין טריטי.

בסופו של דבר, בדיקות אלה יכולות להראות אם גן מעניין מווסת את התפשטות תאי הבטא או מתפקד במבחנה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של העפעפיים, כגון האם מרכיב מסוים במסלול איתות משפיע על צמיחת ותפקוד תאי בטא? הכן צלחת מצופה שש בארות שאינה מצופה בתרבית רקמות על ידי הוספת שני מיליליטר של מדיה שונה למספר הבארות הנדרש.

לדוגמה, ניסוי טיפוסי עשוי לדרוש שלוש בארות, אחת כל אחת ללא בקרת נגיף, בקרת וירוסים, וקבוצת הניסוי מחממת את הצלחת ל-37 מעלות צלזיוס באינקובטור תרבית רקמה למשך 30 דקות לפחות. מיד לאחר בידוד לולאות חולדה, הניחו אחת עד 200 לולאות בכל באר של הצלחת המוכנה. 60 לולאות ישמשו לבדיקות ביוכימיות והלולאות הנותרות יכולות לשמש למחקרי ביטוי גנים או ספיגה חיסונית לנפח בעדינות את הצלחת כדי להביא את הלולאות למרכז כל אחת מהן.

ובכן, אז מיד פיפטה את האדנווירוס ישירות על הלולאות. במרכז המנה. השתמש באחד עד 500 כפולות של זיהום בהתאם ליעילות של אדנו-וירוס בביטוי יתר או הפלת החלבון המעניין שלך.

חדירה יעילה של אדנו-ויראלים לליבת העפעף מגבירה את עקביות התוצאות. התמרת העפעפיים מיד לאחר העפעף. בידוד הוא חיוני.

אל תפריע לצלחת למשך חמש דקות, ואז העביר אותה לחממה למשך 24 שעות. למחרת, הוציאו את הצלחת מהחממה ונפחו בעדינות את הלולאות למרכזי הבארות. העבירו את הלולאות לבאר חדשה המכילה מדיה טרייה באמצעות מיקרו פיפטה של 200 מיקרוליטר.

אם הלולאות מתחברות לצלחת, ניתן לעקור אותן בעדינות בעזרת קצה הפיפטה. זה מועיל להשתמש בנגיף בקרה המבטא GFP כדי לאמת יעילות התמרה נאותה על ידי שימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית כדי לדמיין את חדירת האדנווירוס לתרבית הליבה של האי. האיים למשך יום עד שלושה ימים נוספים, והחליפו את המדיה מדי יום.

יש לייעל את זמן התרבות על ידי מחקרי פיילוט ומשתנה בהתאם למטרות הניסוי. במשך 24 השעות האחרונות, שלבו תימידין טריטי במדיה בריכוז של מיקרו קירי אחד למילימטר מדיה. ראשית הכינו טרי 50 מיליליטר מה- SAB העובד בצינור חרוטי של 50 מיליליטר וחממו אותו באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.

הכניסו 10 מיליליטר של SAB עובד לתוך צינור חרוטי של 15 מיליליטר והוסיפו 66.8 מיקרוליטר של גלוקוז D 2.5 מולרי. כדי להכין את ה-SAB הגבוה של הגלוקוז, הוסף 44.8 מיקרוליטר של גלוקוז 2.5 מונולו D ל-40 מיליליטר הנותרים של ה-SAB העובד. כדי להכין את ה-SAB הנמוך של הגלוקוז הבא סמן שלוש צינורות מיקרו צנטריפוגה של 1.7 מיליליטר.

לכל באר מצלחת שש הבארות והוסף מיליליטר PBS לכל צינור. אל תשכח לעקוב אחר פרוטוקולים מוסדיים לטיפול וסילוק הלולאות הרדיואקטיביות. בעזרת סטריאוסקופ או מיקרוסקופ סטנדרטי, בחר והעביר 20 לולאות בגודל דומה לכל צינור מיקרו צנטריפוגה.

לדוגמה, כל צינור עשוי להכיל חמש לולאות קטנות, 10 בינוניות וחמש גדולות. למרות שהתוצאות מנורמלות לתכולת החלבון הכוללת בסוף הניסוי, זה קריטי להתאים את הגודל בין הקבוצות. לאחר שאפשרו ללולאות להתיישב בתחתית הצינור על ידי כוח הכבידה או על ידי צנטריפוגה, שאפו, שקלו את ה-PBS עם מיקרו פיפטה ולאחר מכן המשיכו בהכנת הלולאות לבדיקות הביוכימיות.

כדי להכין את הלולאות לבדיקת הפרשת האינסולין, תחילה יש לדגור אותן מראש עם SAB נמוך של גלוקוז. לשם כך, הוסף 400 מיקרוליטר של ה-SAB הנמוך של הגלוקוז לצינורות והנח אותם עם כובעים לתוך חממת תרבית הרקמה למשך 60 דקות לאחר שעה, שאפו את ה-SAB הנמוך של הגלוקוז לפני הדגירה כדי למדוד את הפרשת האינסולין הבסיסי. חזור על הליך הדגירה המוקדמת.

עם זאת, כדי למדוד הפרשת אינסולין מגורה, השתמש ב-400 מיקרוליטר של SAB עם גלוקוז גבוה במקום SAB עם גלוקוז נמוך וכמו קודם, דגר את הלולאות למשך 60 דקות לאחר הדגירה בשאיבת SAB עם גלוקוז גבוה או נמוך וב-SAB לבדיקת אינסולין רדיו אימונולוגית, שתבוצע על פי פרוטוקול היצרן. לאחר מכן המשך בבדיקת שילוב התימידין באמצעות אותו אוסף של לולאות. התחל עם הלולאות המשמשות זה עתה לבדיקת הפרשת האינסולין.

הוסף מיליליטר אחד של PBS ואפשר ללולאות להתיישב על ידי כוח הכבידה. לאחר מכן שאפו את ה- PBS בעזרת מיקרו פיפטה. בטל וחזור על שלב זה פעם נוספת.

לאחר מכן, הוסיפו 500 מיקרוליטר של חומצה טריכלורואצטית קרה כקרח ללולאות ודגרו אותן על קרח למשך 30 דקות. צנטריפוגה את הצינורות בארבע מעלות צלזיוס. ואז שאיפה, השליכו את ה-TCA.

לאחר מכן, הוסף 80 מיקרוליטר של 0.3 נתרן הידרוקסיד רגיל ודגר את הלולאות למשך 30 דקות של טמפרטורת החדר. במהלך הדגירה הזו מערבל במרץ את הדגימות במשך חמש עד 10 שניות כל 10 דקות. במקביל, הוסף ארבעה מיליליטר של קוקטייל ספירה בטוח של קונו לצינורות ספירת נצנוץ נוזלי של שבעה מיליליטר.

בסיום הדגירה של הלולאות, הוסיפו 50 מיקרוליטר מהלולאות לצינור נצנוץ. נער את הצינור המכוסה לזמן קצר ומדוד את הדגימות הרדיואקטיביות במונה נצנוץ נוזלי. כמו כן, כדי למדוד את ריכוז החלבון, העבירו 10 מיקרוליטר של וילות לבדיקת חומצה ביונית מסחרית ופעלו לפי פרוטוקול היצרן.

מאוחר יותר במהלך ניתוח הנתונים, נרמל את התוצאות לריכוז החלבון באמצעות הפרוטוקולים המתוארים. שכפול לולאות ותפקוד תאי בטא. בלולאות חולדה הוערך ביטוי יתר אדנו-ויראלי של גן היפותטי שש מגורה חזק שכפול עיניים מבלי לשנות את תפקוד תאי הבטא.

ביטוי מוגבר של גן שש, סינתזת DNA מוגברת כפי שנמדד על ידי שילוב תימידין מכיוון שרוב התאים בעינית החולדה הם תאי בטא. ניסויים נוספים יכולים להראות כי עלייה זו בשילוב תימידין נובעת מעלייה בשכפול תאי בטא. בדיקת הפרשת האינסולין הראתה שביטוי יתר של גן שש לא שינה את אחד התפקודים העיקריים של תאי בטא הפרשת אינסולין בגלוקוז נמוך וגבוה.

העלייה בהפרשת האינסולין בריכוזי גלוקוז נמוכים וגבוהים משקפת את בריאות הלולאות לאחר טיפול באדנו-וירוס. אם הגדלת הביטוי של גן 6 פגעה בתפקוד תאי הבטא, סביר להניח שהדבר יבוא לידי ביטוי בירידה באינסולין המופרש בריכוזי גלוקוז גבוהים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד למדוד שכפול תאי בטא והפרשת אינסולין כדי לקבוע אם גן מסוים משפיע על צמיחה או תפקוד של תאי בטא.