Name: במבחנה שיתוף זיהום דגם ללמוד Plasmodium falciparum-HIV-1 אינטראקציות אדם מונוציטים הנגזרות תאים ראשוניים החיסון (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: למדו מודל שיתוף זיהום במבחנה לחקירת השפעת Plasmodium falciparum על שכפול HIV-1 במקרופאגים מונוציטים אנושיים. השיטה מאפשרת ניטור שכפול ויראלי באמצעות מדידת חלבון P24 ופעילות לוציפראז.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הקנדי למחקר בריאות דרך Catalyst שיתופי זיהומים ועמיתים נלוות גרנט. אריתרוציטים האדם סופקו על ידי הבנק המרכז הרפואי de l&#39;דם מאוניברסיטת לאוול.

<ol><li>WHO. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22World+Malaria+Report%22">World Malaria Report</a>. , (2005).</li>
<li>Kublin, J. G., Patnaik, P., Jere, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Plasmodium+falciparum+malaria+on+concentration+of+HIV-1-RNA+in+the+blood+of+adults+in+rural+Malawi%3A+a+prospective+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Effect of Plasmodium falciparum malaria on concentration of HIV-1-RNA in the blood of adults in rural Malawi: a prospective cohort study.</a> Lancet. 365, 233-240 (2005).</li>
<li>Cuadros, D. F., Branscum, A. J., Crowley, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-malaria+co-infection%3A+effects+of+malaria+on+the+prevalence+of+HIV+in+East+sub-Saharan+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">HIV-malaria co-infection: effects of malaria on the prevalence of HIV in East sub-Saharan Africa.</a> Int. J. Epidemiol. 40, 931-939 (2011).</li>
<li>Xiao, L., Owen, S. M., Rudolph, D. L., Lal, R. B., Lal, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+falciparum+antigen-induced+human+immunodeficiency+virus+type+1+replication+is+mediated+through+induction+of+tumor+necrosis+factor-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Plasmodium falciparum antigen-induced human immunodeficiency virus type 1 replication is mediated through induction of tumor necrosis factor-alpha.</a> J. Infect. Dis. 177, 437-445 (1998).</li>
<li>Froebel, K., Howard, W., Schafer, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+by+malaria+antigens+renders+mononuclear+cells+susceptible+to+HIV+infection+and+re-activates+replication+of+endogenous+HIV+in+cells+from+HIV-infected+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Parasite+Immunol%22%5BJournal%5D)">Activation by malaria antigens renders mononuclear cells susceptible to HIV infection and re-activates replication of endogenous HIV in cells from HIV-infected adults.</a> Parasite Immunol. 26, 213-217 (2004).</li>
<li>Diou, J., Tardif, M. R., Barat, C., Tremblay, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+derived+from+hemozoin-loaded+monocytes+display+a+partial+maturation+phenotype+that+promotes+HIV-1+trans-infection+of+CD4%2B+T+cells+and+virus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells derived from hemozoin-loaded monocytes display a partial maturation phenotype that promotes HIV-1 trans-infection of CD4+ T cells and virus replication.</a> J. Immunol. 184, 2899-2907 (2010).</li>
<li>Diou, J., Tardif, M. R., Barat, C., Tremblay, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malaria+hemozoin+modulates+susceptibility+of+immature+monocyte-derived+dendritic+cells+to+HIV-1+infection+by+inducing+a+mature-like+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Malaria hemozoin modulates susceptibility of immature monocyte-derived dendritic cells to HIV-1 infection by inducing a mature-like phenotype.</a> Cell Microbiol. 12, 615-625 (2010).</li>
<li>Diou, J., Gauthier, S., Tardif, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ingestion+of+the+malaria+pigment+hemozoin+renders+human+macrophages+less+permissive+to+HIV-1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Ingestion of the malaria pigment hemozoin renders human macrophages less permissive to HIV-1 infection.</a> Virology. 395, 56-66 (2009).</li>
<li>Davies, J. Q., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+human+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of human macrophages.</a> Methods Mol. Biol. 290, 105-116 (2005).</li>
<li>Fortin, J. F., Cantin, R., Lamontagne, G., Tremblay, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-derived+ICAM-1+glycoproteins+incorporated+on+human+immunodeficiency+virus+type+1+are+biologically+active+and+enhance+viral+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Host-derived ICAM-1 glycoproteins incorporated on human immunodeficiency virus type 1 are biologically active and enhance viral infectivity.</a> J. Virol. 71, 3588-3596 (1997).</li>
<li>Bounou, S., Leclerc, J. E., Tremblay, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+host+ICAM-1+in+laboratory+and+clinical+strains+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+increases+virus+infectivity+and+CD4%28%2B%29-T-cell+depletion+in+human+lymphoid+tissue%2C+a+major+site+of+replication+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Presence of host ICAM-1 in laboratory and clinical strains of human immunodeficiency virus type 1 increases virus infectivity and CD4(+)-T-cell depletion in human lymphoid tissue, a major site of replication in vivo.</a> J. Virol. 76, 1004-1014 (2002).</li>
<li>Wei, X., Decker, J. M., Liu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+resistant+human+immunodeficiency+virus+type+1+in+patients+receiving+fusion+inhibitor+%28T-20%29+monotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Emergence of resistant human immunodeficiency virus type 1 in patients receiving fusion inhibitor (T-20) monotherapy.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 46, 1896-1905 (2002).</li>
<li>Trager, W., Jensen, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+malaria+parasites+in+continuous+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human malaria parasites in continuous culture.</a> Science. 193, 673-675 (1976).</li>
<li>Turrini, F., Ginsburg, H., Bussolino, F., Pescarmona, G. P., Serra, M. V., Arese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis+of+Plasmodium+falciparum-infected+human+red+blood+cells+by+human+monocytes%3A+involvement+of+immune+and+nonimmune+determinants+and+dependence+on+parasite+developmental+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis of Plasmodium falciparum-infected human red blood cells by human monocytes: involvement of immune and nonimmune determinants and dependence on parasite developmental stage.</a> Blood. 80, 801-808 (1992).</li>
<li>Akkina, R. K., Walton, R. M., Chen, M. L., Li, Q. X., Planelles, V., Chen, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+gene+transfer+into+CD34%2B+cells+with+a+human+immunodeficiency+virus+type+1-based+retroviral+vector+pseudotyped+with+vesicular+stomatitis+virus+envelope+glycoprotein+G%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">High-efficiency gene transfer into CD34+ cells with a human immunodeficiency virus type 1-based retroviral vector pseudotyped with vesicular stomatitis virus envelope glycoprotein G.</a> J. Virol. 70, 2581-2585 (1996).</li>
<li>Zhao, C., Papadopoulou, B., Tremblay, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leishmania+infantum+enhances+human+immunodeficiency+virus+type-1+replication+in+primary+human+macrophages+through+a+complex+cytokine+network%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Immunol%22%5BJournal%5D)">Leishmania infantum enhances human immunodeficiency virus type-1 replication in primary human macrophages through a complex cytokine network.</a> Clinical Immunol. 113, 81-88 (2004).</li>
</ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

הדגמנו כאן שתי גישות שונות לנתח את ההשפעה של טפיל המלריה על מחזור 1-HIV ויראלי, כלומר על ידי ניתוח או ביטוי גנים ויראלי או וירוס הצאצאים ייצור שכפול מונוציטים הנגזרות מקרופאגים. גישות דומות שימשו במשך שני HIV-1-טפיל שיתוף זיהומים 16. עם זאת, אלה הנתונים החדשים הם צעד קדימה בחקירה של מלריה-HIV-1 עמיתים זיהומים. . אכן, Diou ואח&#39; 8 בחן את ההשפעה של hemozoin, טפילים לא חיים, על שכפול HIV-1, בהסכם עם התוצאות שלנו, הם הבחינו כי hemozoin עצמו היה מספיק כדי לדכא ייצור ויראלי ידי MDM, ולא MDMs. באמצעות פריסת הניסוי המתואר, הבחנו כי פ falciparum מפעיל השפעה מזיקה ברורה על מחזור HIV-1 replicative ב מקרופאגים: עיכוב משמעותי של ייצור ויראלי הוא ציין מקרופאגים מראש שנחשפו טפילים (Figurה 2 א) וכן השפעה מסוימת של הטפיל על שעתוק ויראלי ממחישה 2B איור. עם זאת, אנחנו לא יכולים להשאיר את כל תופעות נוספות של הטפיל על כניסת היתוך או ויראלי (decapsidation) או לאחר שילוב מנגנונים, כגון סינתזה של חלבון או הרכבה החלקיקים ויראלי ניצני. יתר על כן, ייתכן כי השפעה שונה על שכפול HIV-1 היה לקבל אם הטפיל נוספו גם בעת ובעונה אחת או זיהום MDM הבאה עם הנגיף. שלנו במודל שיתוף זיהום חוץ גופית מספק כלי רב עוצמה כדי לבצע חקירות מפורטות של HIV-1 / פ &#39; אינטראקציות falciparum של התא המארח. לדוגמה, שילוב של פריסת זה ניסיוני עם טכניקות אחרות, כגון PCR כמותי זמן אמיתי, שיכול למקד ולכמת צעדים ספציפיים retrotranscription ויראלי ואינטגרציה הגנום הנגיפי אל התא המארח הגנום, הם ריאלי למדי, צריך להניב insi נוסףghts לתוך המנגנונים המעורבים שיתוף זיהומים. יתר על כן, מבחני ספציפיות על מנת להעריך הצעדים הראשונים של מחזור נגיפית (ויראלית היתוך, decapsidation, quantitation הכניסה) ניתן ליישם פרוטוקול זה בסיסי עוד יותר לנתח את ההשפעה על שכפול נגיפי. שינויים אלו מראים כמה גמיש פרוטוקול זה הוא בנוגע HIV-1 quantitation זיהוי: אכן, גם תקן ה-HIV-1 הפוכה quantitation מבחני transcriptase באמצעות טריטיום שכותרתו נוקלאוטידים מתקבל על הדעת להחליף את ELISA ל-HIV-1 p24. בנוסף MDM, אנו מצפים המערכת שלנו להיות להתאמה סוגי תאים אחרים הנוגעים ל-HIV-1-מלריה אינטראקציות, כגון מונוציטים ותאים דנדריטיים. העובדה MDM הם תאים חסיד מאפשר מניפולציה שלהם, ומאפשר טיפול קל הכביסה מתוך iRBC שלא היה נלקח, או נמצאים בקשר עם MDM, ללא ביטול כל מקרופאגים. יתרון כזה לא יחול על תאים דנדריטים ומונוציטים, אשר בתרבית ההשעיה, שמסבך את SEparation של iRBC uRBC וחופשי עם תאים כאלה ואנחנו כרגע מענה לבעיה זו. המערכת שלנו יכולה להיות שימושית גם כדי לחקור אינטראקציות מורכבות יותר, כגון ההשפעה של Plasmodium-שנחשפו מונוציטים הנגזרות תאים על מחזור נגיפי HIV-1 בתאים חיסוניים אחרים כגון מסוג CD4 חיובי בתאי T של שיתוף תרבות ניסויים. לבסוף, פרוטוקול שלנו יכול להיות מתאים לניסוי מחפש את ההשפעה של פ &#39; falciparum iRBCs על הפעלה מחדש ב-HIV-1 PBMC ל-HIV-1 אנשים נגועים. משפט ואתיקה האדם PBMC התקבלו בדם של תורמים בריאים, בהתאם להנחיות ועדת אתיקה של המרכז הרפואי המרכז דה l&#39;אוניברסיטת מחקר לאוול. הסכמה בכתב התקבל כל תורמי הדם.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Multicell </td><td> 350-000-CL </td><td></td></tr><tr><td> PBS-רעלן פנימי חינם </td><td> סיגמא </td><td> D8662 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Wisent </td><td> 080-150 </td><td> חום מובטל על 56 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות </td></tr><tr><td> Accutase </td><td> eBiosciences </td><td> 00-4555-56 </td><td></td></tr><tr><td> Albumax II </td><td> Gibco </td><td> 11021-037 </td><td> מומס RPMI 1640, פילטר חיטוי </td></tr><tr><td> ההפרדה לימפוציטים בינוני </td><td> Multicell </td><td> 305-010-CL </td><td></td></tr><tr><td> Luminometer צלחות לבנות </td><td> Promega </td><td> Z3291 </td><td></td></tr><tr><td> CS מקינטוש ההפרדה columms </td><td> Miltenyi ביוטק </td><td> 130-041-305 </td><td></td></tr><tr><td> VarioMacs מפריד </td><td> Miltenyi ביוטק </td><td> 130-090-282 </td><td></td></tr><tr><td> פניצילין / סטרפטומיצין פתרון </td><td> Wisent </td><td> 450-201-EL </td><td></td></tr><tr><td> D-סורביטול </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S1876 </td><td></td></tr><tr><td> תא מגרד (25 ס&quot;מ) </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1830 </td><td></td></tr><tr><td> 24 ובכן צלחות תרבית תאים </td><td> BD פלקון </td><td> 353047 </td><td></td></tr><tr><td> 150 x 20 מ&quot;מ תרבות צלחת </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1803.003 </td><td></td></tr><tr><td> M-CSF </td><td> Genscript </td><td> Z02001 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H4034 </td><td></td></tr><tr><td> האדם סרום AB + </td><td> עמק ביו רפואית </td><td> HP1022 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Wisent </td><td> 311-505-CL </td><td></td></tr><tr><td> גנטמיצין </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G1397 </td><td></td></tr><tr><td> Hypoxanthine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H9636 </td><td></td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5761 </td><td></td></tr><tr><td> Assay בלוציפראז מערכת </td><td> Promega </td><td> E1500 </td><td></td></tr><tr><td> אדם דם תאים אדומים </td><td></td><td></td><td> להשיג מטוהרים מהבנק דם צ&#39;ול. </td></tr></tbody></table>

<em&gt; במבחנה</em&gt; שיתוף זיהום דגם ללמוד<em&gt; plasmodium falciparum</em&gt;-hiv-1 אינטראקציות אדם מונוציטים הנגזרות תאים ראשוניים החיסון

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Plasmodium falciparum, הסוכן סיבתי של הטופס הקטלני ביותר של מלריה, נגיף האיידס סוג-1 (HIV-1) הם בין הבעיות הבריאותיות החשובות ביותר ברחבי העולם, להיות אחראי על סך של 4 מיליון מקרי מוות בשנה 1. בשל החפיפה נרחבים שלהם באזורים המתפתחים, בעיקר באפריקה שמדרום לסהרה, עמיתים זיהומים עם מלריה ו-HIV-1 נפוצים, אבל את משחק הגומלין בין שתי המחלות הוא הבין היטב. דיווחים אפידמיולוגיים הראו כי זיהום מלריה זמני משפר HIV-1 שכפול ומגדיל עומס נגיפי HIV-1 ב שיתוף נגועים אנשים 2,3. בגלל viremia זה נשאר גבוה במשך כמה שבועות לאחר טיפול antimalarials, תופעה זו עשויה להיות השפעה על התקדמות המחלה ואת השידור. מנגנוני החיסונית סלולריים מאחורי תצפיות אלו נחקרו רק בקושי. כמה מחקרים במבחנה investigating את ההשפעה של מלריה ב-HIV-1 הראו כי חשיפה אנטיגנים מלריה מסיסים יכולים להגדיל את ה-HIV-1 זיהום מחדש של תאים חיסוניים. עם זאת, מחקרים אלה השתמשו תמציות תאים שלמים של פ &#39; falciparum schizont טפילים בשלב ותאי דם היקפיים (mononuclear PBMC), מה שהופך את זה קשה לפענח איזה מרכיב מלריה (ים) היה אחראי על תופעות שנצפו ומה מארחים את התאים היעד היו 4,5. מחקר שנערך לאחרונה הראה כי חשיפה של מונוציטים הנגזרות תאים דנדריטים בשלים על פיגמנט hemozoin מלריה עלה יכולתם להעביר HIV-1 אל התאים CD4 + טי 6,7, אבל זה ירד זיהום HIV-1 של מקרופאגים 8. כדי לשפוך אור על תהליך מורכב זה, ניתוח שיטתי של אינטראקציות בין טפיל המלריה ו-HIV-1 של אוכלוסיות אנושיות שונות הרלוונטיות תאים ראשוניים יש צורך קריטי. כמה טכניקות לחקור את ההשפעה של HIV-1 על phagocytosis של מיקרואורגניזמים ועל ההשפעה של פתוגנים כאלה על שכפול ה-HIV-1 תוארו. אנחנו כאן להציג שיטה לחקור את ההשפעות של פ &#39; falciparum נגועים אריתרוציטים על שכפול של HIV-1 של האדם הנגזרות מונוציטים מקרופאגים ראשוניים. ההשפעה של החשיפה טפיל על HIV-1 תעתיק / translational אירועים מנוטר באמצעות וירוסים מחזור יחיד pseudotyped שבו הגן כתב בלוציפראז החליף את הגן Env תוך השפעה על כמות של נגיף שפורסמו על ידי מקרופאגים נגועים נקבע על ידי מדידת HIV-1 החלבון p24 capsid ידי ELISA ב supernatants סלולריים.

פיתחנו<em&gt; במבחנה</em&gt; מלריה-HIV-1 שיתוף זיהום מודל ללמוד את ההשפעה של<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; על מחזור HIV-1 replicative של האדם הנגזרות מונוציטים מקרופאגים ראשוניים. מערכת זו צדדי יכול בקלות להיות מותאם אחרים סוגי התאים העיקריים לסכנת הדבקה ב-HIV-1.

<em&gt; במבחנה</em&gt; שיתוף זיהום דגם ללמוד<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-HIV-1 אינטראקציות אדם מונוציטים הנגזרות תאים ראשוניים החיסון

*Plasmodium falciparum*, הגורם למסוג הקטלני ביותר של מלריה, ונגיף הכשל החיסוני האנושי מסוג 1 (HIV-1), הם מהחשובים ביותר...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לפתח מודל in vitro לבחינת ההשפעות של אריתרוציטים נגועים ב-plasmodium fpar על השכפול של HIV-1 במקרופאגים ראשוניים של בני אדם המופקים ממונוציטים. דבר זה מושג תחילה על ידי בידוד תאי דם אדומים נגועים ב-plasmodium false para באמצעות מערכת ה-veac, ולאחר מכן חשיפת מקרופאגים של בני אדם המופקים ממונוציטים לתאים הנגועים. לאחר מכן, המקרופאגים המופקים ממונוציטים שנחשפו לתאי הדם האדומים מודבקים ב-HIV בעל יכולת שכפול מלאה או ב-HIV המקודד ללוסיפראז בעל שכפול בודד.לבסוף, ניתן לאסוף את עלי-התרבית בימים 3, 6, 9 ו-12 לאחר ההדבקה עבור הנגיף בעל יכולת השכפול המלאה ועבור הנגיף המקודד ללוסיפראז. התאים המודבקים נליסים לאחר 72 שעות של הדבקה. בסופו של דבר, ניתן לנטר את השכפול הנגיפי על ידי כימות כמות חלבון הקפסיד HIV-1 p24 בעלי-התרבית באמצעות ELISA, וניתן לנטר את התעתוק הנגיפי על ידי כימות לוסיפראז של ליזאטי התאים.שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום של זיהומים משולבים של מלריה ו-HIV. לדוגמה, כיצד משפיעה הדבקה בטפיל plasmodium על השכפול של HIV? למרות ששיטה זו פותחה כדי לחקור אינטראקציות בין plasmodium ל-HIV במקרופאגים, ניתן ליישמה גם בסוגים אחרים של תאים.לדוגמה, תאים דנדריטיים, מונוציטים, או תאי CD4 T; את הפרוצדורה תדגים Guadalupe Andreani, פוסט-דוקטורנטית במעבדה. התחילו באיסוף תאי דם אדומים ממעטחת התרבית, שטפו את התאים שהופקו ב-10 milliliters של מצע גידול למקרופגים מוצא מונוציטי (monocyte derived macrophage medium), ולאחר מכן השביו את המשקע ב-12 milliliters של מצע גידול למקרופגים מוצא מונוציטי. כעת הוסיפו באיטיות את תרחיף התאים לעמודת Milton ECS והניחו לתרחיף לזרום דרכה. לאחר שטיפת העמודה פעם אחת במצע טרי, הסירו אותה מהמגנט ושטפו עם 12 milliliters של מצע גידול למקרופגים מוצא מונוציטי.העבירו את המצע דרך העמודה, תוך שטיפה של תאי הדם האדומים המזוהמים אל מבחנה סטרילית, כדי לחשוף מקרופאגים המופקים ממונוציטים לתאי דם אדומים מזוהמים או לא מזוהמים. הוסיפו את הנפח המתאים של תרחיף תאי הדם האדומים לכל באער בלוח 24 באערים שהוכן מראש ומכיל מקרופאגים המופקים ממונוציטים. דגרו את תרביות השיתוף (co-cultures) בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide. לאחר ארבע שעות, הסירו את המצע המכיל את תאי הדם האדומים ולאחר מכן הוסיפו בעדינות 600 µL של PBS נטול אנדוטוקסינים לכל באער, וחזרו על הפעולה של שטיפה ושאיבה מיידית של ה-PBS שלוש פעמים.כעת, הוסיפו 200 µL של מים סטריליים קרים מהקרח לכל באר כדי לลิז את תאי הדם האדומים, ושאבו את המים לאחר 20 שניות. לאחר מכן, הוסיפו 600 µL של מצע גידול למקרופגים המופקים ממונוציטים לכל באר והדגירו את התרביות למשך 24 שעות ב-37 °C וב-5% carbon dioxide. כדי להעריך את השפעת Plasmodium falciparum על שכפול של HIV-1 במקרופגים המופקים ממונוציטים, הוסיפו 300 µL של מצע גידול למקרופגים המופקים ממונוציטים המכיל נגיפי NL4-3 BO HIV-1 עם p24 לבארי המתאימים, באופן דומה לפרוטוקול המוצג באיור זה.לאחר דגירה של התרביות המשולבות למשך שעתיים, שטפו את התאים שלוש פעמים עם 600 µL של PBS נקי מאנדוטוקסינים. לאחר מכן, הוסיפו 600 µL של מצע טרי להבטחת מקרופאגים מושגים ממונוציטים לכל באר והמשיכו לדגור את התרביות המשולבות בימים 3, 6, 9 ו-12. לאחר ההדבקה הוויראלית הראשונית, אספו 200 µL מכל עלי-נוזל (supernatant), והחליפו את תרחיף התאים שהוסר ב-200 µL של מצע טרי להבטחת מקרופאגים מושגים ממונוציטים. לאחר מכן, אחסנו את העלי-נוזל שנאספו בטמפרטורה של 20°C- לצורך אנליזה מאוחרת ב-ELISA.על מנת לקבוע את השפעת הטפילים על ביטוי גן אחד של HIV במקרופאגים המופקים ממונוציטים, יש להוסיף לבארים המתאימות 300 µL של מצע גידול למקרופאגים המופקים ממונוציטים המכיל P 24 של נגיף המעניין מצופה ב-luciferase ENC, בדומה לפרוטוקולים המוצגים כאן. לאחר דגירה ושטיפה של תרביות השיתוף (co-cultures) כפי שהודגם עבור נגיף שאינו מצופה ב-luciferase ENC, יש להסיר את המצע 72 שעות לאחר ההדבקה ולהוסיף 200 µL של luciferase assay lysis buffer. השלב זה ממיס את התאים בטמפרטורת החדר עם ניעור עדין, ולאחר מכן יש לאחסן את תרביות השיתוף בטמפרטורה של -20 °C.לאחר הפשרת הפלטה, העבירו 40 µL של ליזאט מכל באר לבאר המתאימה בפלטה של לומינומטר בעלת 96 בארות. לאחר מכן, הוסיפו 100 µL של סובסטרט לוסיפראז מתוך ערכת הבדיקה של לוסיפראז לכל באר. לבסוף, מדדו את פעילות ה-firefly luciferase בלומינומטר.בהתאם להוראות היצרן בניסוי זה, מקרופאגים המופקים ממונוציטים נחשפו לתאי דם אדומים מזוהמים או שאינם מזוהמים, ולאחר מכן הוזיהמו עם NL4-3. כפי שהודגם זה עתה, הייצור של החלבון הווירוסלי P24 נוטר לאחר מכן באמצעות ELISA עבור HIV-1 P24 בתשלוליות נטולות תאים בנקודות זמן שונות לאחר הזיהום הווירוסלי הראשוני. שימו לב לירידה המשמעותית בשחרור חלקיקים וירוסליים ביום ה-12, כפי שנמדד על ידי חלבון הקפסיד HIV-1 P24 בתשלולית של מקרופאגים המופקים ממונוציטים שטופלו מראש בטפילים.בניסוי זה, מקרופאגים שהופקו ממונוציטים נחשפו לתאי דם אדומים נגועים ולא-נגועים, ולאחר מכן הודבקו בנגיף המקודד ללוציפראז כפי שהודגם זה עתה. ביטוי הלוציפראז הוערך לאחר מכן בליזאט תאי 72 שעות לאחר ההדבקה הראשונית בנגיף. הדבקה של מקרופאגים שהופקו ממונוציטים בנגיפים כאלו, הנושאים גליקופרוטאינים מסוג VSVG או HIV-1, הובילה לייצור לוציפראז נמוך משמעותית בתאים שנחשפו ל-p false spar. ראוי לציין כי נגיפים פסאודו-טיפיים של VSVG הניבו פעילות לוציפראז גבוהה בהרבה מאשר מקביליהם מסוג JRFL, וזאת בשל יעילות ההדבקה הגבוהה יותר של חלקיקים פסאודו-טיפיים של VSVG.טכניקה זו תאפשר לחוקרים בתחום של זיהומים משולבים של מלריה ו-HIV לבחון את האינטראקציות בין שני פתוגנים אלו במודל in vitro שניתן להתאימו ללימוד של סוגי תאי חיסון שונים.

an-vitro-co-infection-model-to-study-plasmodium-falciparum-hiv-1

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מבחר Plasmodium falciparum טפילים עבור Cytoadhesion לתאי המוח האנושי האנדותל

סרטון זה מדגים זיהום ex vivo של רקמת רירית הרחם האנושית עם וירוס הכשל החיסוני האנושי מסוג 1, HIV-1, ותחזוקתם על גבי ספוגי ג'לטין בממשק אוויר-נוזל. שיטה זו מאפשרת ניטור של שכפול HIV-1 ופתוגנזה בתוך רקמות אנושיות.

מודל זיהום ברירית צוואר הרחם האנושי לחקר פתוגנזה של HIV בתנאי Ex Vivo

סרטון זה מדגים את הדור של מודל תרבית תאים בהדבקה משותפת של מלריה-HIV במבחנה. תאי דם חד-גרעיניים היקפיים נגועים ב- HIV בתרבית משותפת עם אריתרוציטים טפיליים של פלסמודיום פלציפרום עשויים לתמוך זה בצמיחתו של זה ולספק תובנות לגבי התגובות החיסוניות והתקדמות המחלה בזיהומים משותפים של HIV ומלריה.

יצירת מודל תרבית תאים חוץ גופית של זיהום משותף במלריה-HIV

הנגיף הסינציאלי הנשימתי האנושי (HRSV) יכול לגרום לברונכיוליטיס חמורה בתינוקות צעירים. חלק מהפתוגנזה של מחלת HRSV חמורה נגרמת על ידי התגובה החיסונית של המארח. גירוי של תאי חיסון אנושיים ראשוניים עם HRSV מספק מערכת מודל מהירה וניתנת לשחזור לחקר הפעלה של מסלולים דלקתיים וזיהום.

מודל במבחנה לחקר התגובות החיסוניות של תאים חד-גרעיניים בדם היקפי אנושי לזיהום בנגיף סינציאלי נשימתי אנושי

בניגוד לחלקיקים HIV-1 ללא סלולריים, תאי CD4 + T נגוע הם חשו ביעילות על ידי תאים דנדריטים plasmacytoid (PDC). כתב יד זה מתאר שיטה שבה תאים היקפיים mononuclear הדם (PBMCs) או pDCs המבודד הם שיתוף תרבותיים עם HIV-1 תאי T נגועים כדי להעריך חישה מולדת על ידי pDCs כפי שהוערכו על ידי שחרורו של הסוג-אני IFN.

הערכת חישה המולדת של CD4 הנגוע ב- HIV-1<sup&gt; +</sup&gt; T תאים על ידי תאים דנדריטים Plasmacytoid שימוש<em&gt; Ex vivo</em&gt; עמית תרבות מערכת.

קשה לשכפל הדבקה משותפת בבני אדם במבחנה. עם זאת, טפילי מלריה אנושיים ניתנים לתרבית בקלות במבחנה, כמו גם תאים חד-גרעיניים מבודדים מדם היקפי אנושי שנדבקו באופן טבעי ב-HIV. זה מספק מודל מצוין לחקר תגובות חיסוניות מוקדמות לטפילי מלריה בהקשר של הדבקה משותפת ב-HIV.

<em&gt; במבחנה</em&gt; מודל למדידה של מערכת חיסונית למלריה בהקשר של HIV Co-זיהום

פרוטוקול זה מתאר את השיטות לבניית מודל עכבר מח עצם/כבד/תימוס אנושי עם חסינות מהונדסת מבוססת תאי גזע נגד זיהום HIV.

תאי גזע מהונדסים חסינות בהתבסס נגד HIV זיהום במודל העכבר האנושי

דלקת של רקמות עם וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV) ex-vivo מספק דגם תלת-ממד חשוב של וירוס פתוגנזה. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול לעבד, להדביק דגימות רקמות מן האדם את השקדים mucosae באברי המין הנשי עם HIV-1 ולשמור אותם בתרבות-הממשק נוזלי-אייר.

לשעבר Vivo דלקת של רירית איברי המין האנושי רקמת הלימפה ונקבה עם וירוס הכשל החיסוני האנושי 1, Histoculture

מוצג כאן הוא פרוטוקול אופטימיזציה עבור בידוד, culturing, העברה, וההבחנה העיקרי האנושי מונוציטים מאנשים נגועים בריאים ושליטה בריאה.

בידוד, העברה ותרבות של האדם הראשי המונולוציטים

כאן אנו מתארים שיטה חדשה כדי לעזור להבהיר את מנגנוני החסינות התאית פלסמודיום בשלב הדם של זיהום. זוהי בדיקת מבחנה המודדת הרג תאי דם אדומים נגועים על ידי לימפוציטים ציטוטוקסיים.

במבחנה בדיקה של הרג תאי דם אדומים נגועים בפלסמודיום על ידי לימפוציטים ציטוטוקסיים

פרוטוקול זה מתאר כיצד השילוב של זיהום EcoHIV עם עכברי Tmem119-EGFP מציע מערכת ביולוגית רבת ערך לחקירת שינויים במיקרוגליה ומאגרים נגיפיים במודלים של מכרסמים של הפרעות נוירו-קוגניטיביות הקשורות ל-HIV.

זיהוי תאים נגועים ב-EcoHIV בעכברים טרנסגניים שעברו מניפולציה במיקרוגליה

למדו מודל שיתוף זיהום במבחנה לחקירת השפעת Plasmodium falciparum על שכפול HIV-1 במקרופאגים מונוציטים אנושיים. השיטה מאפשרת ניטור שכפול ויראלי באמצעות מדידת חלבון P24 ופעילות לוציפראז.

גלה סרטונים נוספים