במבחנה שיתוף זיהום דגם ללמוד Plasmodium falciparum-HIV-1 אינטראקציות אדם מונוציטים הנגזרות תאים ראשוניים החיסון

המטרה הכוללת של הליך זה היא לפתח מודל מבחנה לחקר ההשפעות של אריתרוציטים נגועים בפלסמודיום fpar על שכפול HIV אחד במקרופאגים ראשוניים שמקורם במונוציטים אנושיים. זה מושג תחילה על ידי בידוד פלסמודיום, תאי דם אדומים נגועים כוזבים באמצעות מערכת veac, ולאחר מכן חשיפת מקרופאגים אנושיים שמקורם במונוציטים לתאים הנגועים. לאחר מכן, המקרופאגים שמקורם במונוציטים שנחשפו לתאי הדם האדומים נגועים ב-HIV משוכפל לחלוטין או בקידוד לוציפראז יחיד, HIV.

לבסוף, הסופרנטנטים התרבית נקצרים בימים 3, 6, 9 ו-12 לאחר ההדבקה עבור הנגיף המשכפל לחלוטין עבור הנגיף המקודד לוציפראז. התאים הנגועים משקרים לאחר 72 שעות של הדבקה. בסופו של דבר, ניתן לנטר את שכפול הנגיף על ידי כימות כמות חלבון הקפסיד של HIV P 24 בסופרנטנטים על ידי אלייזה וניתן לנטר את השעתוק הנגיפי על ידי כימות לוציפראז של הליזטים של התאים.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום המלריה, זיהומים נלווים של HIV. לדוגמה, כיצד זיהום בטפיל פלסמודיום משפיע על שכפול ה-HIV? למרות ששיטה זו פותחה כדי לחקור אינטראקציות בין פלסמודיום ל-HIV במקרופאגים, ניתן ליישם אותה גם על סוגי תאים אחרים.

לדוגמה, תאים דנדריטיים, מונוציטים או תאי CD 4 T המדגימים את ההליך יהיו Guadalupe Andreani. עמית פוסט-דוקטורט במעבדה התחל בקצירת תאי דם אדומים מצלחת התרבית, שטוף את התאים המשוחזרים ב-10 מיליליטר של מדיום מקרופאגים שמקורו במונוציטים, ולאחר מכן השהה מחדש את הגלולה ב-12 מיליליטר של מדיום תרבית מקרופאגים שמקורו במונוציטים. כעת הוסף לאט את תרחיף התא לעמוד Milton ECS ותן למתלה לזרום לאחר שטיפת העמוד פעם אחת עם מדיום טרי, הסר אותו מהמגנט ושטוף 12 מיליליטר של תרבית מקרופאגים שמקורה במונוציטים.

מדיום דרך העמודה, חומק מתאי הדם האדומים הנגועים לתוך צינור סטרילי כדי לחשוף מקרופאגים שמקורם במונוציטים לתאי דם אדומים נגועים או לא נגועים. הוסף את נפח התרחיף המתאים של כדוריות דם אדומות לכל באר של צלחת 24 בארות שהוכנה בעבר המכילה מקרופאגים שמקורם במונוציטים. דגרו על תרביות הקו ב-37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו חמצני לאחר ארבע שעות, הסירו את המדיום המכיל את כדוריות הדם האדומות ולאחר מכן הוסיפו בעדינות 600 מיקרוליטר של PBS נטול אנדוטוקסין לכל אחת, ובכן שלוש פעמים שאפו את ה-PBS מיד לאחר כל שטיפה.

עכשיו עם 200 מיקרוליטר קרח, מים קרים וסטריליים לכל באר כדי להניח את כדוריות הדם האדומות שואבות את המים לאחר 20 שניות. לאחר מכן ב -600 מיקרוליטר של מונוציטים נגזר מדיום תרבית מקרופאגים לכל באר ודגירה על התרביות למשך 24 שעות ב -37 מעלות צלזיוס ו -5% פחמן דו חמצני. כדי להעריך את ההשפעה של פרם כוזב של פלסמודיום על HIV, שכפול אחד במקרופאגים שמקורם במונוציטים ב-300 מיקרוליטר של מדיום מקרופאגים שמקורו במונוציטים המכיל P 24 של NL, ארבעה שלושה נגיפי BO IV אחד לבארות המתאימות בדומה לפרוטוקול המתואר באיור זה.

לאחר דגירה של תרביות הקו במשך שעתיים, שטפו את התאים שלוש פעמים עם 600 מיקרוליטר PBS נטול אנדוטוקסין. לאחר מכן, ב-600 מיקרוליטר מדיום מקרופאגים טרי שמקורו במונוציטים לכל באר והמשיכו לדגור על תרביות הקו בימים 3, 6, 9 ו-12 לאחר ההדבקה הנגיפית הראשונית, קצרו 200 מיקרוליטר מכל סנאט והחליפו את תרחיף התא המשוחזר ב-200 מיקרוליטר של מקרופאג טרי שמקורו במונוציטים. בינוני. לאחר מכן אחסנו את הסופרנטנטים שנקטפו במינוס 20 מעלות צלזיוס לניתוח מאוחר יותר על ידי אלייזה.

על מנת לקבוע את השפעת הטפילים על HIV, ביטוי גן אחד במקרופאגים שמקורם במונוציטים ב-300 מיקרוליטר של מדיום מקרופאגים שמקורו במונוציטים המכיל P 24 של הנגיף המצופה לוציפראז ENC המעניין את הבארות המתאימות בדומה לפרוטוקולים המוצגים כאן. לאחר הדגירה ושטיפת תרביות הקוד כפי שהוצג זה עתה עבור נגיף מצופה ENC שאינו לוציפראז, הסר את המדיום 72 שעות לאחר ההדבקה והוסף 200 מיקרוליטר של בדיקת הלוציפראז. מאגר ליזה פגע כעת בתאים בטמפרטורת החדר בניעור עדין ולאחר מכן מאחסן את התרביות המשולבות במינוס 20 מעלות צלזיוס.

לאחר הפשרת הצלחת העבירו 40 מיקרוליטר ליזט מכל באר לבאר המתאימה בצלחת לומינומטר של 96 בארות. לאחר מכן הוסף 100 מיקרוליטר של ערכת בדיקת לוציפראז מצע לוציפראז לכל אחד. ובכן, סוף סוף מדוד את פעילות לוציפראז הגחלילית בלומינומטר.

על פי הוראות היצרן בניסוי זה, מקרופאגים שמקורם במונוציטים נחשפו לתאי דם אדומים נגועים או לא נגועים ולאחר מכן נדבקו ב-NL ארבע שלוש בלן. כפי שהוכח זה עתה, ייצור החלבון הנגיפי P 24 נוטר על ידי ELIZA ל-HIV P 24 בסופרנטנטים נטולי תאים בנקודות זמן שונות לאחר ההדבקה הנגיפית הראשונית. שימו לב לירידה המשמעותית בשחרור חלקיקים נגיפיים ביום ה-12 כפי שנמדד על ידי HIV חלבון קפסיד P 24 אחד בסופרנט של מקרופאגים שמקורם במונוציטים שטופלו מראש בטפילים.

בניסוי זה, מקרופאגים שמקורם במונוציטים נחשפו לתאי דם אדומים נגועים ולא נגועים ולאחר מכן נדבקו בנגיף מקודד לוציפראז כפי שהודגם זה עתה ביטוי לוציפראז הוערך בליזאט התא 72 שעות לאחר הנגיף הראשוני בזיהום. זיהום מקרופאגים שמקורו במונוציטים בנגיפים כאלה המכילים VS אקסוגני. גליקופרוטאינים VG או HIV 1 הובילו לייצור לוציפראז נמוך משמעותית בתאים שנחשפו ל-p spar כוזב. ראוי לציין כי וירוסים מסוג פסאודו VSVG הניבו פעילות לוציפראז גדולה בהרבה מאשר JRFL שלהם על עמיתיהם בשל יעילות ההדבקה הגדולה יותר של חלקיקים מסוג פסאודו.

טכניקה זו תאפשר לחוקרים בתחום המלריה, זיהומים נלווים של HIV לחקור את האינטראקציות בין שני הפתוגנים הללו במודל מבחנה המותאם למחקר של מספר סוגי תאים חיסוניים.