תאי גזע מהונדסים חסינות בהתבסס נגד HIV זיהום במודל העכבר האנושי

המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור עכבר אנושי שעבר שינוי עם קולטן אנטיגן כימרי. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי ה-HIV והאימונולוגיה בכל הנוגע לבדיקת היעילות של חסינות מהונדסת מבוססת תאי גזע נגד זיהום HIV וזיהומים כרוניים וממאירים אחרים. כגון מנגנון של כשל חיסוני ודרכים לחזק את המערכת החיסונית ולפתח טיפול ליצירת חסינות אנטי-ויראלית או אנטי-גידולית טובה יותר.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מסוגלת לכמות גדולה של מניפולציות ניסיוניות. מודל עכברי ה-BLT המואנש מחקה את החסינות האנושית ובמקרה זה מאפשר בדיקות פרה-קליניות לטיפולים גנטיים מבוססי תאים נגד זיהום ב-HIV. מי שידגים את ההליך יהיו ואלרי רזק ובריאנה לאם, הם טכנאים מהמעבדה שלי.

התחל בשימוש באזמל כדי לחתוך את בלוטת התימוס לחתיכות קטנות של כמילימטר אחד חתוכות לקוביות בכלי המכיל תוספת מדיום RPMI. לאחר מכן השתמש במלקחיים קהים מעוקלים כדי להניח כל חתיכת תימוס בודדת לבאר אחת על צלחת של 96 בארות. הוסף 100-200 מיקרוליטר מדיה לכל הבארות כדי שהרקמה לא תתייבש.

דמיין את הרקמה מתחת למיקרוסקופ כדי לחסל כל רקמה שאולי אינה בלוטת התימוס או שיש לה רקמת חיבור מחוברת. לאחר מכן, הסר את חתיכות התימוס המאושרות, שלב אותן לבקבוק תרבית תאים T25. הוסף שבעה מיליליטר של חומר RPMI בתוספת אנטיביוטיקה לבקבוק ונענע בעדינות לערבב.

לאחר מכן הניחו את הבקבוק בחממת תרבית הרקמות. שלב זה מונע זיהום חיידקי של הרקמה. התחל בבידוד של HSCs חיוביים CD34 מכבד העובר על ידי שימוש בשני אזמלים כדי לחתוך את הכבד לחתיכות קטנות של כשלושה מילימטרים בקוביות בצלחת המכילה IMDM.

הסר והשליך כל רקמת חיבור לבנה. לאחר מכן השתמש במזרק של 10 מיליליטר המצויד במחט קהה בגודל 16 כדי להוציא את חתיכות הכבד והמדיה ולהעביר לצינור חרוטי של 50 מיליליטר. קחו בעדינות והוציאו חמש עד שבע פעמים נוספות כדי להפוך את הרקמה להומוגניזציה מלאה.

לאחר הכנת 10 מיליליטר של מדיה IMDM, השלם אותו עם קולגנאז, היאלורונידאז, אנטיביוטיקה, דנאז ואנטי פטרייתי. העבירו את המדיה דרך מסנן 0.22 מיקרון. לאחר מכן הוסף את המדיה המסוננת לתרחיף הכבד.

לאחר סגירת הצינור החרוטי בנפח 50 מיליליטר המכיל את תרחיף הכבד, אטום היטב עם סרט אטום עצמי כגון פרפילם כדי למנוע דליפות. סובב במסובב צינור בחממה של 37 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות. לאחר הדגירה, סנן את תרחיף התאים המעוכל דרך מסננת תאים של 100 מיקרון לתוך צינור טרי של 50 מיליליטר.

הוסף PBS למתלים כדי להביא את הנפח הכולל עד 50 מיליליטר. פצל את זה לשני צינורות של 50 מיליליטר, כל אחד מכיל 25 מיליליטר של תרחיף תאים. האטה וכיסוי עדין של התאים בכל צינור עם 10 מיליליטר של אמצעי צנטריפוגה צפופים, כגון Ficoll.

סובב ב 1200 פעמים גרם למשך 20 דקות ללא הפסקה. לאחר הצנטריפוגה, הסר בזהירות את הממשק מכל צינור והעביר אותו לשני צינורות נפרדים של 50 מיליליטר. הביאו את הנפח של כל צינור ממשק עד 50 מיליליטר עם PBS.

ואז צנטריפוגה ב -300 פעמים גרם למשך שבע עד 10 דקות. שלב ושטוף את כדורי התא שלוש פעמים עם 50 מיליליטר PBS המכילים שני אחוז FBS, מסתובב ב -300 פעמים גרם במשך שבע עד 10 דקות בכל פעם. לאחר הסיבוב האחרון, השעו מחדש את הגלולה ב-50 מיליליטר של מדיה RPMI בתוספת 10 אחוז FBS.

ספרו את התאים באמצעות המוציטומטר. לאחר מכן, מיין תאים חיוביים CD34 באופן מיידי באמצעות ערכת מיון CD34 בהתאם לפרוטוקול היצרן, ושמור גם את השבר החיובי CD34 וגם את השבר השלילי CD34. יוצקים את נתחי התימוס והמדיום מהבקבוק לכלי של 60 מילימטר.

צננו כמה קצות פיפטה עם תזוזה חיובית על ידי הנחתם בצינורות פתוחים של 1.5 מיליליטר על קרח. כמו כן, הניחו את כדורי התא ונפח של תערובת חלבון ג'לטינית כגון מטריג'ל על קרח. להרדים את העכברים המקבלים עם חומר הרדמה בהזרקה על פי פרוטוקול מאושר לבעלי חיים.

בדוק את רמת ההרדמה של העכבר על ידי סחיטת כף. היעדר תגובה לצביטה מעיד על מישור הרדמה כירורגי. גלח את הצד השמאלי של כל עכבר מהמותן ועד הכתף בין מרכז הגב לבטן.

יש להזריק שישה מיליגרם לק"ג קרפרופן מדולל לכתף או למשולש המפשעתי של בעל החיים. שטפו את צינורית הטרוקר עם PBS בצלחת של 60 מילימטר. בעזרת זוג מלקחיים מעוקלים קהים, הניחו חתיכת תימוס מהצלחת בקוטר 60 מילימטר ממש בתוך פתח הצינורית, ואז משכו לאחור את הטרוקאר כדי לשאוב את הרקמה לתוך הצינורית.

לאחר מכן, השתמשו בפיפטה עם תזוזה חיובית ובקצה צונן כדי להוסיף חמישה מיקרוליטרים של תערובת חלבון ג'לטינית קרה לתוך הצינור עם כדור התא. ומערבבים בעדינות כדי ליצור את תרחיף התאים. הכניסו את מתלה התא לתוך פתח הצינורית ומשכו לאט לאט לאחור את הטרוקאר כדי להעמיס את המחט.

ספוג את האזור המגולח של העכבר עם יוד פובידון ואחריו איזופרופניל שלוש פעמים. קבע את הנקודה הכהה ביותר מתחת לעור המציינת את מיקום הטחול. הכליה נמצאת כחמישה מילימטרים גב לטחול.

לאחר הבטחת רמת הרדמה מתאימה על ידי היעדר תגובה של צביטת הכפה, השתמש במלקחיים מעוקלים כדי להרים את העור והשתמש במספריים כירורגיים כדי לבצע חתך של 15 מילימטר בעור במקביל לטחול. ואז בצע חתך דומה בשכבת הצפק שמתחת. אצל גברים, הכליה נראית בקלות, ולכן מוחצנת פשוט על ידי לחיצה על הבטן.

תמכו בכליה עם המוסטט או זוג מלקחיים קהים מעוקלים. אצל נקבות, השחלות נוטות לחסום את הכליה מחילוץ קל. בעזרת המוסטט, הרם את השחלה וחשוף בזהירות את הכליה.

השתמש במלקחיים עם קצה מחט כדי למרוט חור זעיר בקצה האחורי של קפסולת הכליה. החלק את הטרוקר לתוך חור זה ולאורך הכליה עד שפתח הצינורית מכוסה לחלוטין על ידי קפסולת הכליה. הוצא בעדינות את הרקמה מתחת לקפסולת הכליה ומשוך את הטרוקר בחזרה החוצה.

השתמש במלקחיים המעוקלים כדי לוודא שחתיכת התימוס לא תחזור החוצה עם המחט. לאחר מכן, הרם את הצפק בעזרת המלקחיים והשתמש בעדינות בהמוסטט כדי לדחוף את הכליה בחזרה למקומה. קושרים תפר אחד מסוקס כפול עם תפר כירורגי בצפק.

כמו כן, הניחו שני קליפסים לפצעים של Autoclips כדי לסגור את העור. כעת מערבבים את התאים החיוביים CD34 המומרים ושואבים 0.5 פעמים 10 לששת התאים בנפח של 100 מיקרוליטר למזרק אינסולין. הזרקת תאים אלה לעכבר באמצעות הזרקת ורידים רטרו אורביטליים.

לאחר ההזרקה, יש לספוג טיפה קטנה של חומר סיכה לעיניים על כל עין, ולהניח את העכבר על צדו בחזרה בכלוב. לאחר השתלת כל העכברים, ודא שבעלי החיים חזרו למצפוניות והם אמבולטוריים לפני החזרתם לחדר הדיור. עכברים הוקרבו 10 שבועות לאחר הניתוח ונקצרו דם, טחול, בלוטת התימוס ומח העצם.

התאים שהתקבלו נצבעו בנוגדני CD45 אנטי-אנושיים ונוגדני CD4 אנטי-אנושיים ונותחו על ידי ציטומטריית זרימה. כפי שניתן לראות כאן, ניתן לזהות תאים שעברו שינוי בקולטן אנטיגן כימרי CD4 ברקמות לימפה מרובות על ידי ציטומטריית זרימה. התאים שעברו שינוי בקולטן אנטיגן כימרי CD4 יכולים להתמיין למספר שושלות.

כאן, טחול מעכברים שעברו שינוי בקולטן אנטיגן כימרי CD4 נקצרו ונצבעו לסמנים של תאי T ו-B. תאים שליליים לסמני תאי T ו-B היו חיוביים לסמנים של מונוציטים ומקרופאגים ולתאי הרג טבעיים. טחול מעכברי קולטני אנטיגן כימריים CD4 נגועים ב- HIV עוררו עם תאי T 1 נגועים או לא נגועים והוצג ייצור ציטוקין תוך תאי.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבנות עכברי BLT מואנשים שעברו שינוי עם קולטני אנטיגן כימריים. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך 48 שעות אם היא מבוצעת כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לעבוד בקצב קבוע ולשים לב היטב למצב העכבר המנותח.

למתחילים חשוב לתרגל ניתוחים והזרקות עיניים לפני שעובדים עם רקמות ותאי גזע יקרים יותר. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום HIV ומחלות זיהומיות אחרות לחקור פתוגנזה של מחלות וטיפולים מבוססי חיסון במודל העכברים המואנש.