Name: תאי גזע מהונדסים חסינות בהתבסס נגד HIV זיהום במודל העכבר האנושי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: למדו ליצור מודל עכברים מועשר בעכברי BLT לחקר HIV באמצעות תאי גזע CD34+ מהונדסים עם קולטנים כימריים. שיטה זו מאפשרת בדיקות טרום-קליניות לטיפולים בתאי גזע נגד זיהומים כרוניים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות לגב' ג'סיקה סלנדר על שסיפקה עוזרת אמנותית ביצירת הדמויות שלנו. עבודה זו מומנה על ידי מענקים מה-NIAID/NIH, מענק מס. RO1AI078806, המרכז לחקר האיידס של UCLA (CFAR), מענק מס. P30AI28697, המכון לרפואה רגנרטיבית בקליפורניה, מענק מס. TR4-06845, הפדרציה האמריקאית לחקר האיידס (amfAR), מענק מס. #108929-54-RGRL, ותוכנית המחקר והיוזמות הרב-קמפוסים של אוניברסיטת קליפורניה, המרכז לגילוי תרופות אנטי-ויראליות בקליפורניה (CCADD)

<ol><li>Karpel, M. E., Boutwell, C. L., Allen, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLT+humanized+mice+as+a+small+animal+model+of+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+virology%22%5BJournal%5D)">BLT humanized mice as a small animal model of HIV infection.</a> Current opinion in virology. 13, 75-80 (2015).</li>
<li>Zhen, A., Kitchen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem-cell-based+gene+therapy+for+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Stem-cell-based gene therapy for HIV infection.</a> Viruses. 6 (1), 1-12 (2014).</li>
<li>Goulder, P. J. R., Watkins, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+and+SIV+CTL+escape%3A+implications+for+vaccine+design%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Immunology%22%5BJournal%5D)">HIV and SIV CTL escape: implications for vaccine design.</a> Nature Reviews: Immunology. 4 (8), 630-640 (2004).</li>
<li>Kitchen, S. G., Bennett, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+Antigen-Specific+T+Cells+from+Genetically+Modified+Human+Hematopoietic+Stem+Cells+in+Immunodeficient+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Engineering Antigen-Specific T Cells from Genetically Modified Human Hematopoietic Stem Cells in Immunodeficient Mice.</a> PloS one. 4 (12), e8208(2009).</li>
<li>Goulder, P. J. R., Watkins, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+and+SIV+CTL+escape%3A+implications+for+vaccine+design%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Immunology%22%5BJournal%5D)">HIV and SIV CTL escape: implications for vaccine design.</a> Nature Reviews: Immunology. 4 (8), 630-640 (2004).</li>
<li>Kitchen, S. G. S., Levin, B. R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+suppression+of+HIV+by+antigen+specific+T+cells+derived+from+engineered+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">In vivo suppression of HIV by antigen specific T cells derived from engineered hematopoietic stem cells.</a> PLoS Pathogens. 8 (4), e1002649(2012).</li>
<li>Yang, O. O., Tran, A. C., Kalams, S. A., Johnson, R. P., Roberts, M. R., Walker, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysis+of+HIV-1-infected+cells+and+inhibition+of+viral+replication+by+universal+receptor+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Lysis of HIV-1-infected cells and inhibition of viral replication by universal receptor T cells.</a> PNAS. 94 (21), 11478-11483 (1997).</li>
<li>Zhen, A., Kamata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-specific+Immunity+Derived+From+Chimeric+Antigen+Receptor-engineered+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">HIV-specific Immunity Derived From Chimeric Antigen Receptor-engineered Stem Cells.</a> Molecular Therapy. 23 (8), 1358-1367 (2015).</li>
<li>Barrett, D. M., Singh, N., Porter, D. L., Grupp, S. A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+Antigen+Receptor+Therapy+for+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric Antigen Receptor Therapy for Cancer.</a> Annual Review of Medicine. 65 (1), 333-347 (2014).</li>
<li>Pejchal, R., Doores, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Potent+and+Broad+Neutralizing+Antibody+Recognizes+and+Penetrates+the+HIV+Glycan+Shield%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Potent and Broad Neutralizing Antibody Recognizes and Penetrates the HIV Glycan Shield.</a> Science. 334 (6059), 1097-1103 (2011).</li>
<li>Caskey, M., Klein, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viraemia+suppressed+in+HIV-1-infected+humans+by+broadly+neutralizing+antibody+3BNC117%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Viraemia suppressed in HIV-1-infected humans by broadly neutralizing antibody 3BNC117.</a> Nature. 522 (7557), 487-491 (2015).</li>
<li>West, A. P., Scharf, L., Scheid, J. F., Klein, F., Bjorkman, P. J., Nussenzweig, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+on+the+role+of+antibodies+in+HIV-1+vaccine+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structural insights on the role of antibodies in HIV-1 vaccine and therapy.</a> Cell. 156 (4), 633-648 (2014).</li>
<li>Lan, P., Tonomura, N., Shimizu, A., Wang, S., Yang, Y. -G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+a+functional+human+immune+system+in+immunodeficient+mice+through+combined+human+fetal+thymus%2Fliver+and+CD34%2B+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of a functional human immune system in immunodeficient mice through combined human fetal thymus/liver and CD34+ cell transplantation.</a> Blood. 108 (2), 487-492 (2006).</li>
<li>Melkus, M. W., Estes, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+mice+mount+specific+adaptive+and+innate+immune+responses+to+EBV+and+TSST-1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1.</a> Nature medicine. 12 (11), 1316-1322 (2006).</li>
<li>Shultz, L. D., Brehm, M. A., Garcia-Martinez, J. V., Greiner, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+mice+for+immune+system+investigation%3A+progress%2C+promise+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Immunology%22%5BJournal%5D)">Humanized mice for immune system investigation: progress, promise and challenges.</a> Nature Reviews: Immunology. 12 (11), 786-798 (2012).</li>
<li>Vatakis, D. N., Bristol, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+the+BLT+humanized+mouse+as+a+stem+cell+based+gene+therapy+tumor+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Using the BLT humanized mouse as a stem cell based gene therapy tumor model.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (70), e4181(2012).</li>
<li>De Rosa, S. C., Brenchley, J. M., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+six+colors%3A+a+new+era+in+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Beyond six colors: a new era in flow cytometry.</a> Nature medicine. 9 (1), 112-117 (2003).</li>
<li>Shimizu, S., Hong, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+efficient+short+hairpin+RNA+potently+down-regulates+CCR5+expression+in+systemic+lymphoid+organs+in+the+hu-BLT+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A highly efficient short hairpin RNA potently down-regulates CCR5 expression in systemic lymphoid organs in the hu-BLT mouse model.</a> Blood. 115 (8), 1534-1544 (2010).</li>
<li>Denton, P. W., Olesen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+HIV+latency+in+humanized+BLT+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Generation of HIV latency in humanized BLT mice.</a> Journal of virology. 86 (1), 630-634 (2012).</li>
<li>Zhou, J., Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryoid+bodies+formation+and+differentiation+from+mouse+embryonic+stem+cells+in+collagen%2FMatrigel+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">Embryoid bodies formation and differentiation from mouse embryonic stem cells in collagen/Matrigel scaffolds.</a> Journal of Genetics and Genomics. 37 (7), 451-460 (2010).</li>
<li>Vatakis, D. N., Arumugam, B., Kim, S. G., Bristol, G., Yang, O., Zack, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+Exogenous+T-cell+Receptors+Into+Human+Hematopoietic+Progenitors+Results+in+Exclusion+of+Endogenous+T-cell+Receptor+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Introduction of Exogenous T-cell Receptors Into Human Hematopoietic Progenitors Results in Exclusion of Endogenous T-cell Receptor Expression.</a> Molecular Therapy. 21 (5), 1055-1063 (2013).</li>
<li>Ito, R., Takahashi, T., Katano, I., Ito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+advances+in+humanized+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+%26+Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Current advances in humanized mouse models.</a> Cellular & Molecular Immunology. 9 (3), 208-214 (2012).</li>
<li>Martinez-Torres, F., Nochi, T., Wahl, A., Garcia, J. V., Denton, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypogammaglobulinemia+in+BLT+humanized+mice--an+animal+model+of+primary+antibody+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Hypogammaglobulinemia in BLT humanized mice--an animal model of primary antibody deficiency.</a> PloS one. 9 (10), e108663(2014).</li>
<li>McCune, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+applications+of+the+SCID-hu+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Development and applications of the SCID-hu mouse model.</a> Seminars in Immunology. 8 (4), 187-196 (1996).</li>
<li>Srivastava, S., Riddell, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+CAR-T+Cells%3A+Design+Concepts%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Engineering CAR-T Cells: Design Concepts.</a> Trends in immunology. 36 (8), (2015).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

עם מכונית ואת מומנטום צובר חסין מהונדסים מבוסס HSC כלפי מחקרים קליניים, חשוב להיות מודל חיה ראוי לבחון מקרוב את הבידול ותפקוד של תאים המהונדסים אלה. בפרוטוקול זה תארנו את השיטות לבנייה ובדיקת עכברים אנושיים עם תאי גזע מהונדסים גנטי המהונדסים נגד HIV. חשוב יש התמרה יעילה של תאי גזע לפני ההשתלה. עם זאת, בשל היכולת של תאי T להתרבות בעת ההכרה של תאי יעד, רמות נמוכות של שינוי תאי גזע הספיקו כדי ליצור תגובה חזקה נגד HIV שכפול 8. <p class="jove_content" style=";text-align:...

למרות ההצלחה של טיפול אנטי retroviral בשילוב, הידבקות ב- HIV היא עדיין מחלה לכל חיים. התגובה החיסונית התאית נגד HIV משחקת תפקיד חשוב מאוד מצליח לשלוט בהתרבות נגיף. התקדמות מניפולציה בתאי גזע אפשרה ההתפתחות המהירה של ריפוי גנטי גישות ל- HIV טיפול 1-3. כתוצאה מכך, חשוב יש במודל חיה נאה המאפשר במחקר vivo של היעילות של טיפולים מבוססי תאים נגד HIV. עבודה עם HIV במודלים של בעלי חיים הוא מסובך בשל העובדה כי הנגיף מדביק תאים אנושיים בלבד. כדי לעקוף מגבלה זו, מדענים נקטו באמצעות מודלים מחלה כמו וירוס הכשל החיסוני סימיאן (SIV) ב קופי רזוס 4,5. למרבה הצער, יש מגבלות עיקריות במודל זה בשל ההבדלים האינהרנטיים בין זנים ואת ההבדלים בין SIV ו- HIV. בנוסף, רק מאוד מתקנים מיוחדים הם גapable לתמוך עבודה עם פרימטים לא אנושיים וכל מקוק דורשת השקעה גדולה. לפיכך, יש צורך דחוף מודל זה מנצל את מערכת החיסון האנושית, אשר רגישה זיהום HIV / בפתוגנזה, והוא פחות כלכלי מונע. המגזר השקלי הלא צמוד שמנים סוכרתית (NOD) -severe immunodeficient משולב (SCID) בנוקאאוט שרשרת גמא -common (ג γ - / -) (או NSG) דם / כבד / קורנית (BLT) במודל העכבר האנושי הוכח ויותר להיות כלי חשוב ללמוד הידבקות ב- HIV. ידי השתלת תאי גזע hematopoietic (HSCs) ו התימוס העוברית, העכברים מסוגלים לפתח לשחזר מערכת חיסון אנושית 1-3. סוג אחד של ריפוי גנטי מבוסס תאי גזע כרוך &#39;הפניית&#39; תאי T היקפי למקד HIV על ידי תכנות מחדש בתאי גזע hematopoietic (HSCs) להתמיין לתאי T אנטיגן ספציפי. הראינו בעבר כי HSCs הנדסה עם מחדש T תאים ספציפיים מולקולרית משובטים נגד HIVceptor (TCR) נגד אפיטופ SL9 (חומצת אמינו 77-85; SLYNTVATL) של HIV-1 Gag יכול להפנות תאי גזע לתוך להרכיב תאי הבוגרים T מדכאים תרבות נגיף ה- HIV במודל עכבר NSG-BLT האנושי 6. האזהרה של שימוש TCR מולקולרית משובטת היא שזה מוגבל אנטיגן לויקוציטים אנושי ספציפי (HLA) תת סוג כי יגביל את היישום של טיפול זה. קולטנים אנטיגן Chimeric (CAR), מצד שני, יכול להיות מיושם אוניברסלית לכל תת HLA. מחקרים ראשוניים בוצעו ניצול מכונית נבנתה עם התחומים התאיים ו הטרנסממברני של CD4 האדם התמזג ζ איתות תאיים מושלם של CD3 (שמכונה CD4ζCAR). CD4ζCAR הביע על תאי CD8 T יכול לזהות מעטפת HIV ו לעורר תגובת תא T ציטוטוקסיים כי הוא דומה לזה מתווך על ידי קולטן תא T 7. אנחנו הוכחנו לאחרונה כי HSCs אדם יכול להיות שונה עם CD4ζCAR, אז מה שיכול להתמיין li hematopoietic המרובהneages, כולל תא פונקציונלי T מסוגל לדכאה שכפול HIV במודל העכבר האנושי 8. עם ההתקדמות המהירה טיפולים הקולטן לאנטיגן כימרי לסרטן 9, ואת האפיון המתמשך של נוגדנים מנטרלים רחבים חזקים 10-12 נגד HIV המאפשר בניית מכוניות נוגדני שרשרת אחת, זה נתפש שרבים בונים מועמד חדש, בנוסף CD4ζCAR , יופק ונבדקו על ריפוי גנטי מבוסס תאי גזע במחלות איידס ומחלות אחרות. בנוסף, במודל עכבר NSG-BLT האנושי המכיל מכוניות אנטיגן ספציפי אלה יכול גם לספק כלי שימושי לבדיקת תגובות תא T אנושיות מקרוב in vivo. חשוב לציין, הפרוטוקול שלנו נבדל שיטות שתוארו קודם לבניית מואנשים של עכברי BLT 13-15 בכך HSCs ב תערובת חלבונים דביקה משמש במקום הגזעי בכבד עובר 16. פרוטוקול זה מתאר: 1) בניית והרוחעכברי BLT zed מהונדסים עם CD4ζCAR; ו -2) אפיון של בידול של תאים מהונדסים גנטית; ו -3) אפיון של פונקציונליות של תאים מהונדסים גנטית.

<table><tbody><tr><td>ערכת מיקרו-חרוזים CD34</td><td>Miltenyi</td><td>130-046-702</td><td>למיון תאי אב אנושיים CD34+</td></tr><tr><td>Bambanker</td><td>Wako</td><td>302-14681</td><td>להקפאת תאים</td></tr><tr><td>ערכת QIAamp RNA ויראלי&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>52904</td><td>למדידת עומס נגיפי בסרום</td></tr><tr><td>MACSQuant Flow Cytometer</td><td>Miltenyi</td><td></td><td>לניתוח זרימה</td></tr><tr><td>BD LSRFortessa&trade;</td><td>BD biosciences</td><td></td><td>לניתוח זרימה</td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Sigma</td><td>H6254-500MG&nbsp;</td><td>לעיכול רקמות</td></tr><tr><td>דאוקסיריבונוקלאז I&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>וורת'ינגטון</td><td>LS002006&nbsp;</td><td>לעיכול רקמות</td></tr><tr><td>טכנולוגיית חיים קולגנאז</td><td></td><td>17104-019&nbsp;</td><td>לעיכול רקמות</td></tr><tr><td>מערכת זיהוי PCR בזמן אמת CFX</td><td>Biorad</td><td></td><td>למדידת עומס נגיפי וביטוי גנים</td></tr><tr><td>עכברים, זן NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ</td><td>מעבדת ג'קסון</td><td>5557</td><td>לבניית העכברים המואנשים</td></tr><tr><td>פניצילין סטרפטומיצין (Pen Strep)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10378016</td><td>לתרבית תאים</td></tr><tr><td>Piperacillin/tazobactam</td><td>Pfizer</td><td>Zosyn</td><td>אנטי פטרייתי</td></tr><tr><td>Amphotericin B (Fungizone antimycotic)Thermo</td> <td>Fisher Scientific</td><td>15290-018</td><td>אנטי פטרייתי</td></tr><tr><td>קליפס לפצעים אוטוקליפ, 9 מ"מ - 1,000 יחידות</td><td>בקטון דיקינסון</td><td>427631&nbsp;</td><td>לניתוח</td></tr><tr><td>חלוקי כירורגיה סטריליים מחוזקים בפולי, 30 למקרה&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>מדליין</td><td>DYNJP2707&nbsp;</td><td>לניתוח</td></tr><tr><td>תפרים, 4-0, ויקריל&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>אוונס ומינור</td><td>23000J304H&nbsp; &nbsp;</td><td>לניתוח</td></tr><tr><td>פדים להכנת אלכוהול&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>אוונס ומינור</td><td>3583006818</td><td>לניתוח</td></tr><tr><td>כפפות, כירורגיות, 6 1/2</td><td>אוונס ומינור</td><td>4075711102</td><td>לניתוח</td></tr><tr><td>Yssel' s ללא סרום T-Cell בינוני</td><td>מזל תאומים ביו-מוצרים</td><td>400-102</td><td>להעברת תאי CD34+</td></tr><tr><td>אלבומין סרום אנושי&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A9511</td><td>עבור התמרת תאים CD34+</td></tr></tbody></table>

תאי גזע מהונדסים חסינות בהתבסס נגד hiv זיהום במודל העכבר האנושי

Stem-cell Based Engineered Immunity Against HIV Infection in the Humanized Mouse Model

עם ההתפתחות המהירה של טיפולים גן מבוססי תאי גזע נגד HIV, יש לחיצה דרישה במודל חיה ללמוד את הבידול hematopoietic ותפקוד מערכת החיסון של תאים מהונדסים גנטית. The-מוח העצם האנושי / כבד / קורנית (BLT) במודל של עכברים מאפשר כינון מחדש מלא של מערכת חיסון אנושית בפריפריה, הכוללת תאי T, תאי B, תאי NK ומונוציטים. השתל הרתי האדם גם מאפשר לבחירה הרתי של תאי T ברקמות הרתי עצמיות. בנוסף המחקר של הידבקות ב- HIV, המודל עומד ככלי רב עצמה כדי ללמוד בידול, פיתוח פונקציונלי של תאים שמקורם בתאי גזע hematopoietic (HSCs). כאן נתאר את בניית אנושי ללא השמנת יתר סוכרת (NOD) -severe immunodeficient משולב (SCID) בנוקאאוט שרשרת גמא -common (ג γ - / -) -Bone מח / כבד / קורנית (NSG-BLT) עכברים עם HSCs transduced עם קולטן אנטיגן chimeric CD4 (CD4CAR)וקטור lentivirus. אנו מראים כי CD4CAR HSCs יכול להבחין בהצלחה לתוך שושלות מרובות יש פעילות אנטי HIV. מטרת המחקר היא להדגים את השימוש במודל עכבר NSG-BLT כמודל in vivo לחסינות מהונדסת נגד HIV. ראוי לציין, כי lentivirus ורקמות אדם משמשים, ניסויים וניתוחים צריכים להתבצע בתוך ארון בטיחות ביולוגי Class II בתוך 2 רמת בטיחות ביולוגית (BSL2) עם אמצעי זהירות מיוחדת מתקן (BSL2 +).

איור 1 מציג מתווה של בניית עכברי BLT אנושיים עם תאי גזע מהונדסים. 10 שבועות לאחר ניתוח השתל, העכברים הוקרבו כדי להעריך את ההתמיינות והתפתחות של תאים מהונדסים גנטיים. כפי שניתן לראות בתרשים 2, רקמות הלימפה מרובות (דם, טחול, התימוס ומח עצם) נבצרו עכבר שעבר שינוי עם CD4ζCAR. CD4ζCAR להשתמש בפרוטוקול זה מכיל הקולטן לאנטיגן כימרי CD4 ו- GFP כי ניתן לאתר על ידי נוגדן אנטי CD4 והביטוי של ה- GFP 8. תאים בודדו ומ...

פרוטוקול זה מתאר את השיטות לבניית מודל עכבר מח עצם/כבד/תימוס אנושי עם חסינות מהונדסת מבוססת תאי גזע נגד זיהום HIV.

תאי גזע מהונדסים חסינות בהתבסס נגד HIV זיהום במודל העכבר האנושי

With the rapid development of stem cell-based gene therapies against HIV, there is pressing requirement for an animal model to study the hematopoietic ...

המטרה הכללית של הליך זה היא ליצור עכבר האנושי עם קולטן אנטיגני כימרי (CAR). שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחומי ה-HIV והאימונולוגיה בנוגע לבחינת היעילות של חסינות מהונדסת המבוססת על תאי גזע כנגד זיהום ב-HIV וזיהומים כרוניים וממאירות אחרות. דוגמה לכך היא מנגנון של כשל חיסוני ודרכים לשיפור מערכת החיסון ולפיתוח טיפול ליצירת חסינות אנטי-ויראלית או אנטי-גידולית טובה יותר.היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת מספר רב של מניפולציות ניסיוניות. מודל עכברי BLT הומניזים מחקה את החסינות האנושית ובמקרה זה מאפשר בדיקות פרה-קליניות לטיפולים גנטיים מבוססי תאים נגד זיהום ב-HIV. את הפרוצדורה ידגימו Valerie Rezek ו-Brianna Lam, טכנאיות מהמעבדה שלי.התחילו בחיתוך התימוס לחתיכות קטנות של כ-1 מילימטר מעוקב בתוך צלחת המכילה מצע RPMI מועשר, באמצעות סקלפלים. לאחר מכן, השתמשו בפינצטה עקומה וקהה כדי להניח כל חתיכה בודדת של תימוס בבאר נפרדת בלוחית של 96 בארות. הוסיפו 100-200 µL של מצע לכל הבארות כדי למנוע מהרקמה להתייבש.בחנו את הרקמה תחת המיקרוסקופ כדי להסיר כל רקמה שאינה תימוס או כזו שיש לה רקמת חיבור צמודה. לאחר מכן, הוציאו את חתיכות התימוס המאושרות והעבירו אותן לבקבוק תרבית תאים T25. הוסיפו לבקבוק 7 mL של מצע RPMI מועשר באנטיביוטיקה ונערה בעדינות לערבוב.לאחר מכן, הניחו את הבקבוק בתוך אינקובטור לתרביות רקמה. שלב זה מונע זיהום חיידקי של הרקמה. התחילו בבידוד של HSCs חיוביים ל-CD34 מכבד עוברי, על ידי חיתוך הכבד לחתיכות קטנות של כ-3 mm³ באמצעות שני סכיני ניתוח, בתוך צלחת המכילה IMDM.הסיר והשלך כל רקמת חיבור לבנה. לאחר מכן, השתמש במזרק של 10 milliliter המצויד במחט קהה בכיול 16 gauge כדי להוציא את חלקי הכבד והתווך ולהעבירם לשפופרת קונית של 50 milliliter. שאב והזרק בעדינות חמש עד שבע פעמים נוספות כדי להומוגניזציה מלאה של הרקמה.לאחר הכנת 10 milliliters של מצע IMDM, יש להוסיף לו collagenase, hyaluronidase, אנטיביוטיקה, Dnase וחומר אנטי-פטרייתי. העבירו את המצע דרך מסנן של 0.22 micron. לאחר מכן, הוסיפו את המצע המסונן לת сусפנסיית הכבד.לאחר סגירת המבחנה הקונית בנפח 50 מיליליטר המכילה את תגלוש הכבד, אטמו אותה היטב באמצעות סרט איטום עצמי כגון parafilm כדי למנוע דליפות. סובבו את המבחנה ברוטטור למבחנות בתוך אינקובטור בטמפרטורה של 37 degrees celsius למשך 90 דקות. לאחר האינקובציה, סננו את תגלוש התאים שעברו עיכול דרך מסננת תאים של 100 מיקרון אל תוך מבחנה נקייה בנפח 50 מיליליטר.הוסיפו PBS לתליה כדי להביא את הנפח הכולל ל-50 milliliters. חלקו זאת לשתי מבחנות של 50 milliliter, כך שבכל אחת תהיה 25 milliliters של תליה של תאים. הניחו באיטיות ובזהירות מתחת לתאים בכל מבחנה 10 milliliters של מדיום לצנטריפוגה לפי צפיפות, כגון Ficoll.סבב במהירות של 1200 ×g למשך 20 דקות ללא הפסקה. לאחר הצנטריפוגה, הסר בזהירות את השכבה הממשקית (interface) מכל מבחנה והעבר אותה לשתי מבחנות נפרדות של 50 milliliter. השלם את הנפח של השכבה הממשקית בכל מבחנה עד ל-50 milliliters באמצעות PBS.לאחר מכן, סבב במערך צנטריפוגה במהירות של 300 ×g למשך שבע עד 10 דקות. איחד ושטוף את משקעי התאים שלוש פעמים ב-50 milliliters של PBS המכיל 2% FBS, תוך סבב ב-300 ×g למשך שבע עד 10 דקות בכל פעם. לאחר הסבב האחרון, השב את המשקע ב-50 milliliters של מצע RPMI בתוספת 10% FBS.ספרו את התאים באמצעות המוציטומטר. לאחר מכן, בצעו מיון מיידי של תאים חיוביים ל-CD34 באמצעות ערכת מיון CD34 בהתאם לפרוטוקול היצרן, ושמרו הן את הפракציה החיובית ל-CD34 והן את הפракציה השלילית ל-CD34. שפכו את חלקי הטימוס והמדיום מהבקבוק לתוך צלחת של 60 מילימטר.קררו מספר טיפים של פפיטה עם דחיקה חיובית (positive displacement pipette tips) על ידי הנחתם בתוך מבחנות סטריליות עם פקק הברגה בנפח 1.5 מיליליטר, כשהן פתוחות, על קרח. כמו כן, הניחו על קרח את משקעי התאים ונפח של תערובת חלבונים ג'לטינית כגון matrigel. הרדימו את העכברים המקבלים באמצעות חומר הרדמה להזרקה, בהתאם לפרוטוקול בעלי חיים מאושר.בדקו את רמת ההרדמה של העכבר על ידי לחיצה על כף הרגל. היעדר תגובה ללחיצה מעיד על מישור הרדמה כירורגי. גלחו את הצד השמאלי של כל עכבר מאזור השכיבה ועד לכתף, בין מרכז הגב לבטן.הזריקו תת-עורית שש מיליגרם לקילוגרם של Carprofen מדולל לכתף של בעל החיים או למשולש המפשעה. שטפו את הקנולה של הטרוקר באמצעות PBS בצלחת של 60 מילימטר. בעזרת פינצטה מעוקלת קהה, הניחו פיסה של תימוס מהצלחת של 60 מילימטר ממש בתוך פתח הקנולה, ולאחר מכן משכו את הטרוקר לאחור כדי לשאוב את הרקמה לתוך הקנולה.בשלב הבא, השתמשו בפיפט עם דחיקה חיובית (positive displacement pipette) ובטיפ מקורר כדי להוסיף 5 µL של תערובת חלבון ג'לטינית קרה לתוך המבחנה המכילה את משקע התאים. ערבבו בעדינות כדי ליצור את תגסוס התאים. העבירו באמצעות פיפט את תגסוס התאים לפתח הקנולה ומשכו לאט את הטרוקר כדי למלא את המחט.נגב את האזור הגולח של העכבר עם povidone iodine ולאחר מכן עם isopropenyl שלוש פעמים. קבע את הנקודה הכהה ביותר מתחת לעור המצביעה על מיקומו של הטחול. הכליה נמצאת כ-5 millimeters גבייה (dorsal) לטחול.לאחר וידוא של רמת הרדמה מתאימה על ידי היעדר תגובה לצביטה בכף הרגל, השתמשו בפינצטה מעוקלת כדי להרים את העור ובמספריים כירורגיים כדי לבצע חתך של 15 מילימטר בעור במקביל לטחול. לאחר מכן בצעו חתך דומה בשכבת הפריטונאום שמתחתיה. בזכרים, הכליה נראית בבירור, ולכן ניתן להוציאה פשוט על ידי לחיצה על הבטן.תמכו את הכליה באמצעות המוסטט או זוג פינצטות קעורות קהות. בנקבות, השחלות נוטות לחסום את הכליה ולמנוע שליפה קלה. בעזרת המוסטט, הרימו את השחלה וחשפו בזהירות את הכליה.השתמשו בפינצטה בעלת קצה מחט כדי ליצור חור קטן בקצה האחורי של קפסולת הכליה. החליקו את הטרוקאר לתוך חור זה לאורך הכליה, עד שפתח הקנולה יהיה מכוסה לחלוטין על ידי קפסולת הכליה. דחפו בעדינות את הרקמה מתחת לקפסולת הכליה ומשכו את הטרוקאר החוצה.השתמשו בפינצטה העקומית כדי לוודא שפיסת התימוס אינה יוצאת שוב יחד עם המחט. לאחר מכן, הרימו את הפריטוניאום בעזרת הפינצטה והשתמשו בעדינות בהמוסטט כדי לדחוף את הכליה חזרה למקומה. קשרו תפר אחד עם קשר כפול באמצעות חוט תפירה כירורגי בפריטוניאום.יש להניח שני תפסני Autoclips לסגירת העור. כעת ערבב את תאי ה-CD34 החיוביים שעברו טרנסדוקציה, ושאב למזרק אינסולין 0.5 × 10⁶ תאים בנפח של 100 µL. הזרק תאים אלה לעכבר באמצעות הזרקה לווריד הרטרו-אורביטלי.לאחר ההזרקה, מרחו טיפה קטנה של חומר סיכוך לעיניים בכל עין, והניחו את העכבר על צדו חזרה בתוך כלוב. לאחר השתלה בכל העכברים, ודאו שהבעליים חזרו למצב של ערנות ושהם מסוגלים לנוע לפני השבתם לחדר הגידול. העכברים נשחטו 10 שבועות לאחר הניתוח, ודם, טחול, תימוס ומחית עצם נאספו.התאים שהתקבלו נצבעו בנוגדנים anti-human CD45 ו-anti-human CD4 ונולאו באמצעות ציטומטריה של זרימה. כפי שניתן לראות כאן, ניתן לזהות תאים שעברו שינוי באמצעות קולטן אנטיגן כימרי CD4 ברקמות לימפואידיות מרובות באמצעות ציטומטריה של זרימה. התאים שעברו שינוי באמצעות קולטן אנטיגן כימרי CD4 יכולים להתמיין לסוגי תאים (lineages) מרובים.כאן, נאספו ספלנוציטים מעכברים שעברו מודיפיקציה של קולטן אנטיגני כימרי CD4, והם נצבעו לסמנים של תאי T ותאי B. תאים שהיו שליליים לסמני תאי T ו-B היו חיוביים לסמנים של מונוציטים ומקרופאגים ולסמנים של תאי NK. ספלנוציטים מעכברים עם קולטן אנטיגני כימרי CD4 שהודבקו ב-HIV עוררו באמצעות תאי T one שהודבקו ב-HIV או תאים לא מודבקים, והייצור התוך-תאי של ציטוקינים מוצג.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן בנייתם של עכברי BLT האנושיים שעברו מודיפיקציה באמצעות קולטני אנטיגן כימריים. ברגע שהטכניקה תהיה שולטת, ניתן לבצעה בתוך 48 שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לעבוד בקצב קבוע ולהקדיש תשומת לב רבה למצבו של העכבר שעובר את הניתוח.עבור מתחילים, חשוב להתאמן בניתוחים ובהזרקות לעין לפני העבודה עם רקמות ותאי גזע יקרי יותר. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום ה-HIV ומחלות זיהומיות אחרות לחקור את הפתוגנזה של המחלה וטיפולים מבוססי מערכת החיסון במודל של עכבר אנושי (humanized mouse model).

stem-cell-based-engineered-immunity-against-hiv-infection-humanized

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

הדור והאפיון של תאי T ספציפיים סרטניים באמצעות עכבריים מתואר כאן. רקמה הרתי אדם ותאי גזע hematopoietic מהונדס גנטי אדם מושתלת לעכברי מדוכאי חיסון. התוצאה הוא הכינון מחדש של מערכת חיסון אנושית מהונדסת מאפשרת בבדיקת vivo של תגובות חיסוניות אנטי סרטניות.

שימוש בעכבר האנושי של BLT כמודל לתאי גזע מבוסס Gene Therapy גידול

סרטון זה מדגים טכניקה ליצירת עכברי מערכת החיסון האנושית (HIS). CD34+ תאי גזע hematopoietic (HSC) מבודדים מתאי מעיל דם טבורי אנושי באמצעות חרוזים מגנטיים מצופים נוגדנים. CD34+ HSCs מורחבים במדיום גידול מועשר בציטוקינים ונשמר בהקפאה. לבסוף, HSCs מופשרים מוזרקים לתוך גור עכבר מדוכא חיסון כדי לבסס את מודל העכבר שלו.

בידוד תאי גזע המטופויטיים מדם טבורי ליצירת עכברי מערכת החיסון האנושית

סרטון זה מדגים שיטה ליצירת מודל עכבר כפול אנושי עם מערכת חיסון אנושית ותאי כבד. היא כרוכה בהשתלת תאי כבד אנושיים ותאי גזע ואב המטופויטיים בעכבר מהונדס מדוכאי חיסון באמצעות הזרקה תוך ספלנית, מה שמוביל לקליטת תאי כבד והתפתחות תאי חיסון אנושיים.

פיתוח מודל עכבר אנושי עם תאי כבד אנושיים ותאי חיסון

הסרטון מדגים טכניקה ליצירת מודל עכבר אנושי עם חסינות מהונדסת מבוססת תאי גזע נגד נגיף הכשל החיסוני האנושי (HIV). רקמת תימוס עוברית אנושית ותאי גזע המטופויטיים מהונדסים (HSC) מושתלים בכמוסת הכליה של עכבר מדוכא חיסון חמור. HSCs, המבטאים קולטני אנטיגן כימריים (CARs) נגד HIV, מעורבבים בתערובת חלבונים ג'לטינית המקדמת את לוקליזציה משותפת שלהם עם רקמת בלוטת התימוס. לאחר ההליך, HSCs להתמיין לתאים חיסוניים אנושיים שונים, וכתוצאה מכך לפתח מודל עכבר אנושי עם מערכת חיסון אנושית פונקציונלית נגד HIV.

בניית מודל עכבר אנושי עם חסינות מהונדסת נגד HIV

פרוטוקול זה מספק שיטה ליצירת עכברים humanized (hu-NSG) באמצעות intrahepatic הזרקה של תאי גזע hematopoietic אנושי לתוך ממוזגים קרינה עכברים NSG neonatal. העכבר hu-NSG חשופה הידבקות ב- HIV טיפול תרופתי קומבינטורית (עגלה), משמש כמודל pathophysiological מתאימים לחקירות שכפול וההשהיה HIV.

העכבר (hu-NSG) humanized הנד/SCID/IL2rγnull מודל עבור שכפול HIV ולימודי השהיה

פרוטוקול זה מספק שיטה אמינה להקמת עכברים הומניזציה עם מערכת החיסון האנושית ותאי הכבד. השני עכברים לקויה מחדש השיגה באמצעות הזרקה התוך הטחול של האדם hepatocytes ו CD34+ תאי גזע המטרופאיות רגישים לנגיף הכשל החיסוני האנושי-1 זיהום ונזק הכבד לכידה כפי שנצפתה ב . חולים נגועים...

הקמתה של הומניזציה Dual-TK-חעוגה מודל העכבר עבור הנגיף הקשור HIV פתוגנזה

המתואר כאן הם שלוש גישות ניסיוני ללמוד את הדינמיקה של זיהום HIV בעכברים הומניזציה. הראשון מתיר את המחקר של אירועי זיהום כרונית, בעוד שני האחרונים מאפשר לימוד של אירועים חריפים לאחר זיהום ראשוני או נגיפי ההפעלה מראש.

כרונית, חריפה, ו-HIV ההפעלה מופעל מודלים העכבר חיסוני הומניזציה

פיתחנו פרוטוקול עבור הדור והערכה של הומניזציה ונגיף הכשל החיסוני האנושי חעוגה מודל העכבר מבוסס על השתלת תא גזע, הנגיף החיסוני intravaginal האדם חשיפה, ו-droplet דיגיטלי PCR RNA כימות.

הומניזציה חעוגה עכברים עבור חשיפה Intravaginal HIV וטיפול בזיהום HIV

פרוטוקול זה מתאר שיטה חדשנית להעברת תרופות אנטי-רטרו-ויראליות משולבות דרך הפה המדכאות בהצלחה שכפול RNA של HIV-1 בעכברים אנושיים.

טיפול אנטי-רטרו-ויראלי משולב דרך הפה בעכברים נגועים ב- HIV-1

פרוטוקול זה מתאר את הדור של עכברי מערכת החיסון האנושית (HIS) עבור מחקרים אימונו-אונקולוגיים. הוראות ושיקולים בשימוש במודל זה לבדיקת אימונותרפיה אנושית על גידולים אנושיים המושתלים במודל זה מוצגים בדגש על אפיון התגובה של מערכת החיסון האנושית לגידול.

בדיקת אימונותרפיה לסרטן במודל עכבר אנושי הנושא גידולים אנושיים

למדו ליצור מודל עכברים מועשר בעכברי BLT לחקר HIV באמצעות תאי גזע CD34+ מהונדסים עם קולטנים כימריים. שיטה זו מאפשרת בדיקות טרום-קליניות לטיפולים בתאי גזע נגד זיהומים כרוניים.

תאי גזע מהונדסים חסינות בהתבסס נגד HIV זיהום במודל העכבר האנושי

גלה סרטונים נוספים