נקודות קוונטיות קומפקטיות להדמית מולקולה בודדה

המטרה הכוללת של הליך זה היא להכין נקודות קוונטיות פלואורסצנטיות עם בהירות ויציבות אופטימליות, כמו גם גודל ממוזער וקשירה לא ספציפית לשימוש בהדמיית מולקולה בודדת. זה מושג על ידי הכנת ליבות נקודות קוונטיות קטנות של קדמיום סלניד. השלב השני הוא לסגסוגת את הליבות הללו עם כספית כדי להעביר את הקרינה שלהן לספקטרום האדום ולהגביר את הבהירות שלהן.

לאחר מכן, מגדלים מעטפת סגסוגת דקה על גבישי הננו כדי לייצב את פליטת הקרינה שלהם. השלב האחרון הוא העברת חלקיקים אלה מממיסים אורגניים למאגרים מימיים באמצעות פולימר רב משונן, הניתן לשינוי עם פוליאתילן גליקול אינרטי ביולוגית. בסופו של דבר, ספקטרומטריית פלואורסצנטיות, כרומטוגרפיה של ג'ל ואלקטרופורזה של ג'ל משמשות כדי להראות שלחלקיקים אלה יש פלואורסצנציה בהירה, גודל הידרודינמי קומפקטי ותכונות מטען אלקטרוסטטי ניטרליות המתאימות היטב להדמיית פלואורסצנציה של מולקולה בודדת בביולוגיה.

היתרון העיקרי של נקודות קוונטיות אלו על פני חומרים מסחריים קיימים הוא שלננו-חלקיקים אלה יש גודל הידרודינמי מופחת משמעותית. למרות שנקודות קוונטיות קטנות יותר מושפעות לרעה מירידה בעוצמת הקרינה, ירידה ביציבות הקרינה והפלואורסצנטיות רק בספקטרום הכחול, קיזזנו את ההשפעות הללו באמצעות תהליך חילופי קטיון כספית. ננו-גבישים אלה יכולים לעזור לענות על שאלות מפתח בביופיזיקה ובאיתות תאי על ידי מתן אפשרות להדמיה דינמית של ביומולקולות בודדות בסביבות ביולוגיות צפופות.

כדי להתחיל, הכינו תמיסה של 0.4 מולרית של סלניום מלמעלה על ידי הוספת סלניום ל -50 מיליליטר. בקבוק בעל שלושה צווארים, פינוי הבקבוק בוואקום גבוה ומילוי ארגון באמצעות קו שוק sch בתנאים נטולי אוויר. מוסיפים 10 מיליליטר של החלק העליון ומחממים ל-100 מעלות תוך כדי ערבוב במשך שעה כדי לקבל תמיסה צלולה וחסרת צבע.

מצננים את התמיסה לטמפרטורת החדר ומניחים את הבקבוק בצד. כמו כן, הכינו תמיסה של תחמוצת קדמיום TDPA ו-ODE בבקבוק תלת צוואר של 250 מיליליטר תוך שימוש בכמויות המפורטות בפרוטוקול הכתוב. בליווי סרטון זה, יש לפנות את התמיסה באמצעות קו שוק תוך כדי ערבוב.

העלו את הטמפרטורה ל-100 מעלות צלזיוס ופנו למשך 15 דקות נוספות. כדי להסיר זיהומים בנקודת רתיחה נמוכה מתחת לגז ארגון, מחממים את התערובת ל -300 מעלות צלזיוס למשך שעה כדי להמיס את תחמוצת הקדמיום במלואה. התמיסה תשתנה מצבע אדמדם לצלול וחסר צבע לקרר את התמיסה לטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, הוסף HDA לתמיסת הקדמיום, מחמם ל -70 מעלות צלזיוס ומפנים. לאחר השגת לחץ קבוע, העלו את הטמפרטורה והחזירו את התמיסה למשך 30 דקות. העבר את שסתום קו ה-schlink לגז אינרטי והכנס את הצמד התרמי ישירות לתמיסה.

בתנאים נטולי אוויר, הוסף DPP לתמיסת הקדמיום והעלה את הטמפרטורה ל -310 מעלות צלזיוס. כעת השתמש במזרק פלסטיק חד פעמי המחובר למחט בגודל 16 כדי להסיר 7.5 מיליליטר מתמיסת הסלניום העליונה 0.4 מולארית. לאחר שהטמפרטורה מאוזנת ל-310 מעלות צלזיוס, הגדר את בקר הטמפרטורה לאפס מעלות צלזיוס והזריק במהירות את תמיסת הסלניום העליונה ישירות לתמיסת הקדמיום.

התמיסה תשתנה מחסרת צבע לצהוב, כתום, והטמפרטורה תרד במהירות ותעלה שוב לכ-280 מעלות צלזיוס. השלב הקשה ביותר בהליך זה הוא להזריק את כל נפח המזרק במהירות האפשרית לתמיסת הקדמיום. זה מבטיח שהחלקיקים מתגרענים בצורה הומוגנית.

לאחר דקה אחת של תגובה, הסר את הבקבוק ממעטפת החימום וקרר במהירות עם זרם אוויר עד שהטמפרטורה נמוכה מ -200 מעלות צלזיוס. כאשר הטמפרטורה מגיעה לכ- 40 מעלות צלזיוס, יש לדלל ב -30 מיליליטר הקסאן, רוב מבשר הקדמיום שנותר ישקע מהתמיסה. הסר את המשקע הזה על ידי צנטריפוגה.

בכל אחד משישה צינורות צנטריפוגה חרוטיים מפוליפרופילן בנפח 50 מיליליטר יש לדלל 12 מיליליטר מתמיסת הננו קריסטל הגולמית המתקבלת. עם 40 מיליליטר אצטון בעקבות צנטריפוגה עם אותם פרמטרים, יש לשפוך בזהירות ולהשליך את הסופרנטנט. לאחר מכן, ממיסים את כדורי הננו קריסטל בהקסאן.

חלץ את התמיסה בנפח שווה של מתנול תוך שמירה על השלב העליון. חזור על מיצוי זה פעמיים נוספות למיצוי השלישי. ניתן להתאים את נפח המתנול לכ-15 מיליליטר כדי לקבל תמיסת הקסאן מרוכזת של נקודות קוונטיות של קדמיום סלניד טהור בכ-200 מיקרומולר.

התשואה האופיינית של תגובה זו היא שלושה גבישי סלניד קדמיום מיקרומולרי בקוטר של שניים שלושה ננומטר קובעים את הקוטר והריכוז של ננו קריסטל על ידי מדידת ספקטרום הספיגה הנראה האולטרה סגול כמתואר בנוהל הכתוב, גבישי הננו עשויים להיות מוחלפים חלקית עם כספית להסחה לאדום, הקליטה ופליטת הקרינה. כדי לעשות זאת בבקבוקון זכוכית של 20 מיליליטר עם תערובת מוט ערבוב הקסאן וכלורופורם, ואז הוסף את תמיסת הנקודה הקוונטית של קדמיום סלניד OLA וכספית אוקטן מפר. לאחר טיהור גבישי הננו וקביעת ריכוזם כמתואר בנוהל הכתוב, אפשר לגבישי הננו להזדקן לפחות 24 שעות בטמפרטורת החדר לצורך צמיחת קליפה.

הכן תמיסות מבשר קונכייה טוחנת 0.1 ב-50 מיליליטר, שלוש צלוחיות צוואר מתחת לתמיסות חום ואקום של מבשר קדמיום, מבשר אבץ ומבשר גופרית לריפלוקס למשך שעה אחת כדי להניב תמיסות שקופות, ולאחר מכן טען עם ארגון לבקבוק בעל שלושה צווארים. הוסף את ה- ODE של הטופו ונקודות קוונטיות מוכנות, קדמיום סלניד כספית. פנה את הקסין בטמפרטורת החדר באמצעות קו האגף.

העלו את הטמפרטורה ל 100 מעלות צלזיוס וריפלוקס למשך 15 דקות. החלף את שסתום הקו לגז ארגון והכנס את הצמד התרמי לתמיסת ננו קריסטל. לאחר העלאת הטמפרטורה ל -120 מעלות צלזיוס, הוסף 0.5 חד שכבות או 140 מיקרוליטר של תמיסת מבשר גופרית ואפשר לתגובה להמשיך למשך 15 דקות.

העלו את הטמפרטורה ל -140 מעלות צלזיוס. הוסף 0.5 חד-שכבות או 140 מיקרוליטר של תמיסת מבשר קדמיום ואפשר לתגובה להמשיך למשך 15 דקות. לאחר מכן הוסף 500 מיקרוליטר של OLA נטול מים לתמיסת התגובה.

מוסיפים 160 מעלות צלזיוס, מוסיפים 0.5 חד-שכבות, או 220 מיקרוליטר של תמיסת מבשר גופרית, ואחריה כמות שווה של תמיסת מבשר אבץ ב-170 מעלות צלזיוס עם 15 דקות בין כל הוספה. לאחר מכן ב-180 מעלות צלזיוס, הוסף 0.25 חד-שכבות, או 150 מיקרוליטר של תמיסת מבשר גופרית ותמיסת מבשר אבץ במרווחים של 15 דקות. קריר. הפתרון לטמפרטורת החדר ומקדם הכחדה חדש לחלקיקים אלה.

באמצעות ספקטרום UV vis, בהנחה שמספר גבישי הננו לא השתנה, אחסן את תמיסת התגובה כתערובת גולמית במקפיא. בשלב זה ניתן לאפיין את הננו גבישים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים, ספקטרוסקופיה של ספיגת UV וספקטרוסקופיה פלואורסצנטית. הוסף נקודות קוונטיות של מעטפת ליבה מטוהרת לבקבוק של 50 מיליליטר בעל שלושה צווארים והסר את הקסין תחת ואקום גבוה.

כדי להניב סרט יבש, מלאו את הבקבוק בארגון. הוסף פורין נטול מים לסרט הננו-חלקיקים וחמם את התרחיץ ל-80 מעלות צלזיוס במהלך שעה עד שעתיים. הננו-חלקיקים יתמוססו במלואם.

הוסיפו לתמיסה מיליליטר אחד של גליצרול FIO אחד וערבבו בחום של 80 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. לאחר קירור התמיסה לטמפרטורת החדר, הוסיפו 0.5 מיליליטר טריאתילאמין כדי לשחרר את התיו גליצרול וערבבו במשך 30 דקות. התמיסה עלולה להיות עכורה לאחר הוספת טריאתילאמין עקב המסיסות הירודה של גבישי ננו קוטביים בתערובת ממס זו.

העבירו את תמיסת הנקודה הקוונטית לצינור צנטריפוגה חרוטי של 50 מיליליטר המכיל תערובת של 20 מיליליטר הקסאן ו -20 מיליליטר אצטון וערבבו היטב. בודד את גבישי הננו המשקעים באמצעות צנטריפוגה, ואחריו שטיפת גלולה עם אצטון, ממיס את גלולת הנקודה הקוונטית בחמישה מיליליטר של DMSO עם סוניקציה באמבטיה ועקוב אחר צנטריפוגה. כדי להסיר אגרגטים אפשריים, קבע את ריכוז הננו-חלקיקים מספקטרום ספיגת UV V.

יש להשתמש בתמיסה של נקודות קוונטיות טהורות תוך שלוש שעות מכיוון שפני השטח יכולים להתחמצן לאט בתנאי הסביבה באוויר. יש לדלל את תמיסת הנקודה הקוונטית ל-10 מיקרומולר או פחות עם DMSO ולהעביר לבקבוק של 50 מיליליטר. הוסף תמיסה מוכנה של חמישה מיליגרם למיליליטר של חומצה פוליאקרילית מורחבת ב-DMSO, טיפתית לתמיסת הנקודה הקוונטית תוך כדי ערבוב והסרת התמיסה בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.

נקה את תמיסת פולימר הנקודה הקוונטית עם ארגון וחמם ל 80 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות. לאחר קירור התמיסה לטמפרטורת החדר, מוסיפים נפח שווה של 50 מילי-מולרי נתרן אטום pH שמונה טיפות ומערבבים במשך 10 דקות. טהר את הנקודות הקוונטיות כמתואר בנוהל הכתוב וקבע את הריכוז מספקטרום ספיגת UV בבקבוקון זכוכית של ארבעה מיליליטר עם מוט ערבוב נקודות קוונטיות שומה אחת במאגר בוראט עם עודף טוחנת פי 40, 000 של 750 דלטון מונו-אמינו פוליאתילן גליקול.

ניתן למצוא הוראות בנוהל הכתוב כיצד להוסיף פונקציונליות כימית ספציפית לגבישי הננו. הוסף במהירות עודף טוחנת פי 25, 000 של תמיסה טרייה שהוכנה של תמיסת החומר המפעיל לתמיסת הנקודה הקוונטית וערבב אותה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. חזור על שלב זה ארבע פעמים נוספות כדי להרוות את משטח הננו קריסטל ב-PEG.

לבסוף, הוסף 200 מיקרוליטר של מאגר טריס מולארי אחד כדי להרוות את התגובה לפני טיהור גבישי הננו באמצעות מסננים צנטריפוגליים של דיאליזה או אולטרה-צנטריפוגה, ניתן לנתח את הננו קריסטל המתקבל עבור גודל הידרודינמי של פיזור מונו-ומטען פני השטח באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית, אלקטרופורזה של ג'ל ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית. מוצג כאן ספקטרום ספיגה ופלואורסצנטי מייצג עבור גבישי ננו קדמיום סלניד, כספית, קדמיום, סלניד, גבישי ננו לאחר חילופי קדיון, וליבת כספית קדמיום סלניד, קדמיום קליפה, ננו גבישי אבץ גופרתי לאחר צמיחת קליפה. לגבישי הליבה של ננו קדמיום סלניד יש תפוקה קוונטית של פלואורסצנטיות קרובה ל-15%, עם זאת, יעילות זו יורדת לפחות מ-1% לאחר חילופי כספית, ככל הנראה עקב מלכודות נושאות מטען שהוכנסו באמצעות שיבוש אטומי פני השטח.

צמיחה של קליפה דקה של קדמיום אבץ גופרתי מגבירה את היעילות הזו ליותר מ-70% שנשמרת ברובה לאחר העברתה למים. לעומת זאת, גבישי ננו קדמיום סלניד, קדמיום קליפה, אבץ גופרתי ללא שילוב כספית מאבדים חלק ניכר מהתפוקה הקוונטית שלהם במים אלא אם כן מגדלים קליפה עבה. חשוב לציין כי מכסה עם אבץ גופרתי קדמיום מעביר את הספקטרום לאדום עקב דליפה של נושאי המטען האלקטרוניים לחומר המעטפת.

שינוי זה הוא בסביבות 20 עד 30 ננומטר עבור ליבות קדמיום ליבה, וגדל עם הגדלת תכולת הכספית בליבה. לפיכך, על ידי שילוב כספית בגביש הננו הליבה, ניתן לשמור על גודלו הקטן של הננו קריסטל מבלי להקריב את הבהירות. הגודל הקטן מודגם במיקרוגרף אלקטרונים זה ובהתפלגות גודל החלקיקים של גבישי ננו כספית, קדמיום, סלניד, קדמיום קליפה, אבץ גופרתי המראים קוטר ממוצע של 3.2 פלוס מינוס 0.6 ננומטר.

השימוש בהעברת פאזה דו-שלבית למים הוא קריטי להשגת אוכלוסייה הומוגנית של גבישי ננו שאינם דורשים מיון גודל נוסף כדי להסיר אשכולות ואגרגטים את אי הכללת הגודל. כרומטוגרמה המתוארת כאן מאשרת שהגודל דומה לזה של קון אלבומין. ב-75 קילודלטון ולאחר שינוי עם 750 Dalton amino PEG, הגודל גדל ל-12 ננומטר בלבד, בדומה לזה של נוגדן IgG.

שינוי PEG מנטרל את מטען פני השטח כפי שאושר בניסוי האלקטרופורזה של ג'ל ארוס המתואר כאן, הבאר מסומנת בחץ וקוטביות האלקטרודות מסומנות מימין מה שמראה שלפני ההצמדה גבישי הננו נודדים כחלקיקים אוניים וכי גבישי הננו הפגיליים הם ניטרליים מבחינה אלקטרוסטטית. מוצג כאן מיקרוגרף אפי פלואורסצנטי של גבישי הננו הללו המונחים על פתק כיסוי זכוכית ונרגשים באור נראה של 545 ננומטר. גבישי ננו אלה נצפים בקלות ברמת המולקולה הבודדת ב-30 פריימים לשנייה עם מצלמת CCD המכפיל אלקטרונים.

תרשים זה מראה שמספר החלקיקים הפלואורסצנטיים הנצפים בכל מסגרת משתנה לאורך זמן עם עירור מתמשך. זה נובע משילוב של מהבהב והשפלת צילום. המצמוץ שולט בשבע הדקות הראשונות לפני שפירוק הצילום החמצוני מתגלה לאט לאט.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לסנתז נקודות קוונטיות באופן כימי, כיצד להעביר אותן למאגרים מימיים וכיצד לשנות אותן ליישומי הדמיה ביולוגית. אל תשכח שעבודה עם ריאגנטים המכילים קדיום וכספית עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט באמצעי זהירות נוספים כדי למנוע חשיפה אישית.