נקודות קוונטיות קומפקטיות להדמית מולקולה בודדה

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להכין נקודות קוונטיות פלואורסצנטיות בעלות בהירות ויציבות אופטימליות, וכן גודל מינימלי וקישור לא-ספציפי מינימלי, לשימוש בדימוי של מולקולה בודדת. זאת מושגים תחילה על ידי הכנת ליבות קטנות של נקודות קוונטיות מכדמיום סלניד. השלב השני הוא סגסוג של ליבות אלו עם כספית כדי להסיט את הפלואורסצנציה שלהן לספקטרום האדום ולהגביר את הבהירות שלהן.

בשלב הבא, גדל מעטפת סגסוגת דקה על הננו-גבישים כדי לייצב את פליטת הפלואורסצנציה שלהם. השלב הסופי הוא העברת חלקיקים אלו מממסים אורגניים לבאפרים מימיים באמצעות פולימר רב-שיני, שניתן לשנותו עם פוליאתילן גליקול אינרטי ביולוגית. לבסוף, נעשה שימוש בספקטרומטריית פלואורסצנציה, כרומטוגרפיית ג'ל ואלקטרופורזה של ג'ל כדי להראות שלחלקיקים אלו פלואורסצנציה בהירה, גודל הידרודינמי קומפקטי ומטען אלקטרוסטטי ניטרלי, תכונות המתאימות היטב לדימות פלואורסצנציה של מולקולה בודדת בביולוגיה.

היתרון המרכזי של נקודות קוונטיות אלו על פני חומרים מסחריים קיימים הוא שלננו-חלקיקים אלו יש גודל הידרודינמי מופחת משמעותית. למרות שנקודות קוונטיות קטנות יותר מושפעות לרעה מירידה בעוצמת הפלואורסצנציה, ירידה ביציבות הפלואורסצנציה ופלואורסצנציה המתרחשת רק בספקטרום הכחול, קיזזנו השפעות אלו באמצעות תהליך חילוף קטיוני של כספית. ננו-גבישים אלו יכולים לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בביופיזיקה ובסיגנלינג תאי, על ידי אפשור דימוי דינמי של ביו-מולקולות בודדות בסביבות ביולוגיות צפופות.

כדי להתחיל, הכין תמיסה של selenium בריכוז 0.4 molar ב-top על ידי הוספת selenium לבקבוק תלת-צווארי בנפח 50 milliliter, ריקון הבקבוק תחת ואקום גבוה ומילוי בארגון באמצעות קו sch shank בתנאים נטולי אוויר. הוסף 10 milliliters של top וחמם ל-100 degrees Celsius תוך כדי ערבוב למשך שעה אחת לקבלת תמיסה צלולה וחסרת צבע.

קררו את התמיסה לטמפרטורת החדר והניחו את הבקבוק בצד. כמו כן, הכינו תמיסה של cadmium oxide, TDPA ו-ODE בבקבוק בעל שלושה פתחים בנפח 250 milliliters, תוך שימוש בכמויות המפורטות בפרוטוקול הכתוב המצורף לסרטון זה. רשפנו את התמיסה באמצעות קו ואקום (Schlenk line) תוך כדי ערבוב.

העלה את הטמפרטורה ל-100 °C ובצע ואקום למשך 15 דקות נוספות. כדי להסיר זיהומים בעלי נקודת רתיחה נמוכה תחת גז ארגון, חמם את התערובת ל-300 °C למשך שעה אחת כדי להמיס לחלוטין את תחמוצת הקדמיום. צבע התמיסה ישתנה מאדום לשקוף וחסר צבע; צנן את התמיסה לטמפרטורת החדר.

בשלב הבא, הוסיפו HDA לתמיסת הקדמיום, חממו ל-70 °C ובצעו ריקון (evacuate). לאחר הגעה ללחץ קבוע, העלו את הטמפרטורה ובצעו רפלקס (reflux) לתמיסה למשך 30 דקות. העבירו את שסתום קו השלינק (schlenk line) לגז אינרטי והחדירו את הטרמוקפל ישירות לתוך התמיסה.

בתנאים נטולי אוויר, הוסיפו DPP לתמיסת הקדמיום והעלו את הטמפרטורה ל-310 degrees Celsius. כעת, השתמשו במזרק פלסטיק חד-פעמי המחובר למחט בכיול 16 gauge כדי להוציא 7.5 milliliters של תמיסת הסלניום העליונה בריכוז 0.4 molar. ברגע שהטמפרטורה תתייצב על 310 degrees Celsius, הגדירו את בקר הטמפרטורה ל-zero degrees Celsius והזריקו במהירות את תמיסת הסלניום העליונה ישירות לתוך תמיסת הקדמיום.

התמיסה תשנה את צבעה משקיף לצהוב, כתום, והטמפרטורה תרד במהירות ותעלה שוב לכ-280 degrees Celsius. השלב המאתגר ביותר בהליך זה הוא הזרקת הנפח המלא של המזרק במהירות המקסימלית אל תוך תמיסת הקדמיום. פעולה זו מבטיחה גרעין הומוגני של החלקיקים.

לאחר דקה אחת של תגובה, הוצא את הבקבוק ממעטפת החימום קרר אותו במהירות באמצעות זרם אוויר עד שהטמפרטורה תרד לפחות מ-200 °C. כאשר הטמפרטורה תגיע לכ-40 °C, דלל עם 30 milliliters של hexane; רוב שארית חומר המוצא של הקדמיום ישקע מתוך התמיסה. הסר משקע זה באמצעות צנטריפוגציה.

בכל אחד משישה מבחנות צנטריפוגה קוניות מפוליפרופילן בנפח 50 milliliter, יש לדלל 12 milliliters של תמיסת ה-nano Krystal הגולמית שהתקבלה. בעזרת 40 milliliters של acetone, ולאחר צנטריפוגה באותם פרמטרים, יש לשפוך בזהירות ולהשליך את הנוזל העליון (supernatant). לאחר מכן, יש להמיס את כדוריות ה-nano krysttal ב-hexane.

חלץ את התמיסה באמצעות נפח שווה של מתנול תוך שמירה על הפאזה העליונה. חזור על חילוץ זה פעמיים נוספות עבור החילוץ השלישי. ניתן להתאים את נפח המתנול לכ-15 milliliters כדי לקבל תמיסת הקסאן מרוכזת של נקודות קוונטיות של cadmium selenide טהור בריכוז של כ-200 micromolar.

התנובה הטיפוסית של תגובה זו היא גבישי cadmium selenide בריכוז שלושה µM ובקוטר של שניים עד שלושה ננומטרים. קבעו את קוטר הננו-גבישים ואת ריכוזם על ידי מדידת ספקטרום בליעה בטווח העל-סגול והנראה (UV-Vis) כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. ניתן להחליף חלקית את הננו-גבישים בבדיל כדי להשיג הזזה לאדום (redshift) של הבליעה ושל פליטת הפלואורסצנציה. לצורך כך, ערבבו בבקבוק זכוכית של 20 mL עם מוט ערבוב hexane ו-chloroform, ולאחר מכן הוסיפו את תמיסת נקודות הקוונטום של cadmium selenide ב-OLA ו-mercury octanoate. לאחר טיהור הננו-גבישים וקביעת ריכוזם כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב, השאירו את הננו-גבישים להתבגר למשך 24 שעות לפחות בטמפרטורת החדר לצורך צמיחת המעטפת.

הכינו תמיסות מקדימות של קליפה בריכוז 0.1 מולרי בבקבוקי צוואר תלתית בנפח 50 מיליליטר; תחת ואקום, חממו תמיסות של מקדימי קדמיום, אבץ וגופרית לרפלקס למשך שעה אחת עד לקבלת תמיסות צלולות, ולאחר מכן מלאו בקבוק צוואר תלתית בארגון. הוסיפו את ה-topo ODE ואת נקודות הקוונטום של סלניד קדמיום-כספית שהוכנו. שאבו את ה-hexine בטמפרטורת החדר באמצעות קו הוואקום (flank line).

העלה את הטמפרטורה ל-100 °C ובצע רפלקס במשך 15 דקות. העבר את שסתום הקו לגז ארגון והכנס את התרמוקופל לתוך תמיסת ה-nano Krystal. לאחר העלאת הטמפרטורה ל-120 °C, הוסף 0.5 מונו-שכבות או 140 µL של תמיסת חומר מוצא של גופרית והמתן עד לסיום התגובה במשך 15 דקות.

העלה את הטמפרטורה ל-140 °C. הוסף 0.5 מונו-שכבות או 140 µL של תמיסת קדמון קדמיום והמת 15 דקות להמשך התגובה. לאחר מכן, הוסף 500 µL של OLA אנहाइडרי לתמיסת התגובה.

בטמפרטורה של 160 °C, הוסיפו 0.5 מונושכבות, או 220 µL של תמיסת פרקורסור גופרית, ולאחר מכן כמות שווה של תמיסת פרקורסור אבץ בטמפרטורה של 170 °C, עם מרווח של 15 דקות בין כל הוספה. לאחר מכן, בטמפרטורה של 180 °C, הוסיפו 0.25 מונושכבות, או 150 µL של תמיסת פרקורסור גופרית ותמיסת פרקורסור אבץ במרווחים של 15 דקות. צננו את התמיסה לטמפרטורת החדר וקבעו מקדם ניכוי חדש עבור חלקיקים אלו.

בעזרת ספקטרום UV vis, תחת ההנחה שמספר הננו-גבישים לא השתנה, אחסנו את תמיסת התגובה כתערובת גולמית במקפיא. בשלב זה, ניתן לאפיין את הננו-גבישים באמצעות מיקרוסקופיה אלקטרונית, ספקטרוסקופיית בליעת UV vis וספקטרוסקופיית פלואורסצנציה. הוסיפו נקודות קוונטיות מזוקקות מסוג core shell לבקבוק בעל שלושה צוואריים בנפח 50 milliliters והסירו את ה-hexine תחת ואקום גבוה.

כדי להפיק סרט יבש, מלאו את הבקבוק ב-argonne. הוסיפו purine אנहाइडרי לסרט הננו-חלקיקים וחממו את התמיחה ל-80 °C במשך שעה עד שעתיים. הננו-חלקיקים ימוסו לחלוטין.

הוסיפו מיליליטר אחד של glycerol בריכוז 1 FIO לתמיסה וערבבו בטמפרטורה של 80 °C במשך שעתיים. לאחר קירור התמיסה לטמפרטורת החדר, הוסיפו 0.5 מיליליטר של triethylamine כדי לבצע דה-פרוטונציה ל-thio glycerol וערבבו במשך 30 דקות. התמיסה עשויה להפוך לעכורה לאחר הוספת ה-triethylamine בשל המסיסות הנמוכה של nanocrystals פולריים בתערובת ממסים זו.

העבירו את תמיסת הנקודות הקוונטיות למבחנה קונית של 50 מיליליטר המכילה תערובת של 20 מיליליטר hexane ו-20 מיליליטר acetone וערבבו היטב. בדלו את הננו-גבישים שהשקיעו באמצעות סרקיגציה, ולאחר מכן שטפו את המשקע באמצעות acetone, המיסו את משקע הנקודות הקוונטיות ב-5 מיליליטר של DMSO באמצעות סוניקציה במסבך (bath sonication) וביצעו סרקיגציה נוספת. פעולה זו נועדה להסיר אגרגטים אפשריים, ולאחר מכן קבעו את ריכוז הננו-חלקיקים באמצעות ספקטרום בליעה של UV-Vis.

יש להשתמש בתמיסת נקודות הקוונטום הטהורות תוך שלוש שעות, כיוון שהפנימה עלולה להתחמצן באיטיות בתנאי סביבה באוויר. יש לדלל את תמיסת נקודות הקוונטום לריכוז של 10 µM או פחות באמצעות DMSO ולהעבירה לבקבוק של 50 mL. הוסף בטיפות לתמיסת נקודות הקוונטום תמיסה מוכנה של חומצה פוליאקרילית מדוללת ב-DMSO בריכוז של 5 mg/mL תוך כדי ערבוב, ובצע ניקוך גזים (degas) לתמיסה בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.

יש לשטוף את תמיסת פולימר הנקודות הקוונטיות בארגון ולחמם ל-80 °C למשך 90 דקות. לאחר קירור התמיסה לטמפרטורת החדר, יש להוסיף טיפה אחר טיפה נפח שווה של sodium בריכוז 50 millimolar ב-pH שמונה ולערבב במשך 10 דקות. יש לטהר את הנקודות הקוונטיות כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב ולקבוע את הריכוז באמצעות ספקטרום בליעה UV vis; בתוך מבחנה מזכוכית בנפח 4 mL עם מקל ערבוב, ערבב מול אחד של נקודות קוונטיות בבופר בוראט עם עודף מולרי של 40,000 פעמים של mono amino polyethylene glycol במשקל 750 Dalton.

ניתן למצוא הנחיות בנוגע להוספת פונקציונליות כימית ספציפית לננו-גבישים בפרוצדורה הכתובה. הוסיפו במהירות עודף מולרי של 25,000 פעמים של תמיסה שהוכנה טרי של חומר המפעיל לתמיסת הנקודות הקוונטיות, וערבבו בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. חזרו על שלב זה ארבע פעמים נוספות כדי להוסיף PEG עד לרוויה על פני השטח של הננו-גביש.

לבסוף, הוסף 200 µL של tris buffer בריכוז 1 M כדי להפסיק את התגובה לפני טיהור הננו-גבישים באמצעות מסנני דיאליזה צנטריפוגליים או אולטרה-צנטריפוגה. ניתן לנתח את הננו-גבישים שהתקבלו כדי לבחון מונו-דיספרסיות, גודל הידרודינמי ומטען פני שבאמצעות כרומטוגרפיה נוזלית, אלקטרופורזה של ג'ל ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית. מוצגים כאן ספקטרום בליעה וספקטרום פלואורסצנציה מייצגים עבור ננו-גבישי cadmium selenide, ננו-גבישי mercury, cadmium, selenide לאחר החלפת קטיונים, וננו-גבישי ליבה של mercury cadmium selenide ומעטפת של cadmium, zinc sulfide לאחר צמיחת המעטפת. לננו-גבישי ליבת cadmium selenide יש נבחיות פלואורסצנציה של כ-15%, אך נצילות זו יורדת לפחות מ-1% לאחר החלפת mercury, ככל הנראה עקב מלכודות של נשאי מטען שנוצרו כתוצאה מהפרעה לאטומים שעל הפני השטח.

גידול של מעטפת דקה של cadmium zinc sulfide מעלה את היעילות הזו ליותר מ-70%, נתון שנשמר במידה רבה לאחר העברה למים. לעומת זאת, ננו-גבישים בעלי ליבה של cadmium selenide ומעטפת של cadmium zinc sulfide ללא שילוב של כספית, מאבדים חלק ניכר מהנבוא הקוונטית שלהם במים, אלא אם כן גודלה מעטפת עבה. חשוב לציין כי ציפוי ב-cadmium zinc sulfide מסיט את הספקטרה לכיוון האדום בשל דליפה של נושאי המטען האלקטרוניים אל חומר המעטפת.

הסטה זו היא של כ-20 עד 30 nanometers עבור ליבות קדמיום, והיא גדלה עם עליית תכולת הכספית בליבה. לכן, על ידי שילוב כספית בתוך הננו-גביש של הליבה, ניתן לשמור על הגודל הקטן של הננו-גביש מבלי להקריב את הבהירות. הגודל הקטן מודגם במיקרוגרף אלקטרונים חודר זה ובפיזור גודל החלקיקים של ננו-גבישי ליבת כספית, קדמיום, סלניד ומעטפת קדמיום, אבץ סולפיד, המראים קוטר ממוצע של 3.2 פלוס או מינוס 0.6 nanometers.

השימוש בהעברה דו-שלבית של פאזה למים הוא קריטי להשגת אוכלוסייה הומוגנית של ננו-גבישים שאינם דורשים מיון גדלים נוסף להסרת צבירים ואגרגטים באמצעות הפרדה גדלית. הכרומטוגרמה המוצגת כאן מאשרת כי הגודל דומה לזה של con albumin. ב-75 kilodaltons ולאחר מודיפיקציה עם amino PEG של 750 Dalton, הגודל עולה ל-12 nanometers בלבד, בדומה לגודלה של נוגדן IgG.

מודיפיקציה של PEG מנטרלת את מטען הפני, כפי שמאושר בניסוי האגרוז (agarose gel electrophoresis) המוצג כאן; הבאר מסומנת בחץ וקוטביות האלקטרודות מצוינת מימין, מה שמראה שלפני הצמידה ננו-הגבישים נעים כחלקיקים טעונים וכי הננו-גבישים שעברו פגילציה הם ניטרליים מבחינה אלקטרוסטטית. מוצגת כאן מיקרוגרפ של פלואורסצנציה אפי-פלואורסצנטית של ננו-גבישים אלו, שהורסבו על לוחית זכוכית ועוררו באמצעות אור נראה באורך גל של 545 nanometer. ניתן לצפות בננו-גבישים אלו בקלות ברמת המולקולה הבודדת בקצב של 30 frames per second באמצעות מצלמת CCD עם הכפלה אלקטרונית.

גרף זה מראה כי מספר החלקיקים הפלואורסצנטיים שנצפו בכל פריים משתנה לאורך זמן תחת עירור רציף. הדבר נובע משילוב של הבהוב (blinking) ודעיכה פוטוכימית. ההבהוב הוא הגורם השולט במהלך שבע הדקות הראשונות, לפני שהדעיכה הפוטוכימית החמצונית הופכת ניכרת בהדרגה.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לסנתז נקודות קוונטיות באופן כימי, כיצד להעביר אותן לתמיסות באפר מימיות, וכיצד לשנות אותן עבור יישומי הדמיה ביולוגית. זכרו כי עבודה עם ריאגנטים המכילים cadmium ו-mercury עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט באמצעי זהירות נוספים כדי למנוע חשיפה אישית.