דימות פלואורסצנטי עם דיוק אחת ננומטר (FIONA)

המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים כיצד לבצע הדמיה פלואורסצנטית בדיוק של ננומטר אחד או ניסויי פיונה. זה מושג על ידי הגדרת הציוד הנדרש תחילה ויישור האופטיקה להחזר פנימי מלא, פלואורסצנטי, מיקרוסקופיה או דשא. השלב הבא הוא לשתק את CY 3D NA על פני השטח הפנימיים של תא דגימה ולמקם מולקולות בודדות CY 3D NA בדיוק ננומטרי.

לאחר מכן, פיונה מיושמת כדי לחקור את התנועה של מיוזין קטום יחיד חמש מנוע המסומן בנקודה קוונטית. בסופו של דבר, גודל הצעד של המיוזין כשהוא הולך, אקטון נמדד כ-36 ננומטר על ידי ניתוח פיונה. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי מנועים מולקולריים, ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות כגון מעקב אחר קולטנים על קרום התאים.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד את פרטי הניסוי. חשוב להרכיב משקפי בטיחות לייזר בכל עת במהלך ההתקנה. להשתקפות פנימית כוללת, פלואורסצנטיות, מיקרוסקופיה או דשא.

כדי להתחיל הגדר את הגבהים של כל הרכיבים האופטיים לגובה מרכז המיקרוסקופ, היציאה האחורית, התקן את מסנני הלייזר, תריס הלייזר וה-ND. השתמש במסנני ND כדי להחליש את עוצמת הלייזר נמוכה ככל האפשר תוך שמירה על הקרן גלויה. הדק את הברגים עם מפתחות המשושה המתאימים.

תכנן נתיב אלומה כפי שמוצג על ידי הקווים הכחולים המנוקדים. בסכימה זו, סמן את נתיב האלומה עם סרט או טוש על השולחן האופטי. הנח את המראה M1 בפנייה הראשונה בזווית ישרה, הנח את שתי הקשתיות לאורך החלק הישר השני של נתיב האלומה המתוכנן.

כוונן גם את המיקום וגם את ההטיה של M1 כך שהלייזר יעבור דרך הקשתית במקום המראה M שתיים. בפנייה השנייה בזווית ישרה הנח את מרחיב הקרן 10 x לאורך הקטע הישר השלישי של השביל. התאם את ההטיה שלו כך שמרחיב האלומה יהיה מקביל הן לשולחן האופטי והן לנתיב האלומה המתוכנן.

השלב הבא הוא להתאים את M1 ו-M שניים באופן איטרטיבי כך שהלייזר יעבור ישר דרך המרכזים של שתי העדשות, L אחד ו-L שניים של מרחיב האלומה. השתמש בפיסת נייר לבן כדי לחסום את הקורה לאחר מרחיב האלומה כדי לבדוק את פרופיל הקרן בעין. התאם עד שפרופיל האלומה של הקורה המורחבת אינו ED.

גאוס מכוון את המרחק בין L אחד ל-L שתיים כך שהקרן תהיה תריס אסוף. הלייזר משחרר את מטרת המיקרוסקופ ומבריג יישור פלורסנט. מראות מיקום המטרה M שלוש ו-M ארבע כדי לכוון את האלומה המורחבת לתוך יציאת המיקרוסקופ ואל המראה הדיכרואית.

בתוך הצריח. כוונן את M שלוש כדי למרכז את החלק הבהיר ביותר של הקרן על המטרה הפלואורסצנטית ו-M ארבע כדי לגרום לקרן להטות אנכית, תריס את הלייזר והברג את המטרה בחזרה. קנס. כוונן את ההטיות של M שלוש ו-M ארבע כדי לייעל את עוצמת הלייזר ופרופיל הקרן מחוץ למטרה.

התקן מצלמת E-M-C-C-D למיקרוסקופ וחבר את המצלמה למחשב. הפעל את התוכנה עבור המצלמה. הרכיב דגימת פלורסנט על המיקרוסקופ.

הסתכלו על הנקודה הפלואורסצנטית הבהירה במצלמה. בדוק שהנקודה אינה זזה על המסך מכיוון שהפוקוס השתנה. הנח את עדשת ה-TIR על שלב התרגום XY, Z במרחק ממישור המוקד האחורי של האובייקט השווה לאורך המוקד, ה-L שלוש, שהוא כ-30 סנטימטרים.

כוונן את המיקום של L שלוש כך שהלייזר יעבור דרך מרכז העדשה. תרגם את L שלוש לאורך נתיב האלומה כדי להתאים את איסוף האלומה. ודא שהקרן עדיין מרוכזת על הצג וצורתה סימטרית.

תרגם את L שלוש בניצב לנתיב האלומה כדי להטות את האלומה אל מחוץ למטרה. המשך לתרגם את עדשת ה-TIR כך ש-TIR יושג לפני ביצוע פיונה. ניסוי בלוקליזציה וגיוס CY 3D NA. מולקולות בודדות בונות תאי דגימה כמפורט בטקסט הפרוטוקול.

שתי רצועות של סרט דו צדדי מוחלות על המגלשה לאורך הקצוות הארוכים, משאירות פער של שלושה עד חמישה מילימטרים במרכז ואז מונחת החלקת כיסוי נקייה על גבי המגלשה בצד השקופית מוצגות תצוגות צד של החדר מימין ומקדימה. הקצוות הפתוחים של החדר נותרים פתוחים ומשמשים ככניסה ויציאה כדי לשתק את SI 3D NA על המשטחים הפנימיים של תא הדגימה. פיפטה 10 מיקרוליטר ביוטין BSA לתוך החדר.

המתן חמש דקות. שטפו את תא הדגימה על ידי פיפטינג של 40 מיקרוליטר של T 50 BSA לתוך החדר. לאחר מכן פיפטה 10 מיקרוליטר של נויט טראווין לתוך החדר ודגירה למשך חמש דקות.

שטפו את החדר שוב עם 40 מיקרוליטר של פיפטה T 50 BSA, 20 מיקרוליטר של SI 3D NA לתוך תא הדגימה ודגרו למשך חמש דקות. לבסוף, שטפו את החדר עם 80 מיקרוליטר של T 50 BSA. כדי להתחיל בהליך הדמיית SI 3D NA מולקולות בודדות מתחת לדשא M פיפטה 30 מיקרוליטר של מאגר הדמיה לתוך תא הדגימה והמתן שמונה עד 10 דקות.

הרכיב את הדגימה להדמיה על מיקרוסקופ דשא המצויד בלייזר ירוק, מטרת טבילה בשמן פי 100 ומצלמת E-M-C-C-D. הגדר את זמן החשיפה ואת רווח ה- EM. רכוש סרט של המדגם עבור 1000 פריימים.

הידור והפעלה של ניתוח Fiona Pro for Fiona. השתמש בתוכנית IDL זו כדי לייבא את התמונה שנרכשה כדי להזין את גודל הפיקסלים האפקטיבי ואת גורם ההמרה מעוצמה למספר פוטון ולבחור נקודות לניתוח פיונה. בסוף, התוכנית תפיק את תוצאות ההתאמה עם פונקציות גאוס דו-ממדיות, כמו גם מספרי פוטונים כוללים ודיוק לוקליזציה, הידור והפעלת ספירת pH pro.

כדי לאפיין את ספירת הפוטונים, השתמש בתוכנית DL זו כדי למדוד את המספר הממוצע של פוטונים הנפלטים על ידי פלורה. ארבעה לפני הלבנת תמונות כדי לייבא את התמונה שנרכשה ולהזין את מקדם ההמרה מעוצמה למספר פוטון. התוכנית תזהה כתמים פלואורסצנטיים, תחשב אוטומטית את ספירת הפוטונים כפונקציה של מספר המסגרת ותוציא את עקבות ספירת הפוטונים.

הכן את הדגימה לניסוי זה על ידי פיפטינג של 20 מיקרוליטר של BSA ביוטיניל במיליגרם אחד למיליליטר ב-DD H2O לתוך תא דגימה. דגירה למשך 10 דקות. שוטפים עם 30 מיקרוליטר D ddh, שני פיפטות O ב-0.5 מיליגרם למיליליטר של נויט טרביין ודוגרים למשך שתי דקות.

שטפו את החדר עם 30 מיקרוליטר של M חמש PSA. יש להכין את האקטון לניסוי זה ביום הקודם כמתואר בטקסט הפרוטוקול. מדללים את האקטין המוכן 25 פעמים באופן כללי, מאגר אקטין לריכוז סופי של כ-0.004 מיליגרם למיליליטר.

הכניסו את תמיסת האקטין לתא והמתינו 10 דקות. שטפו את החדר עם 30 מיקרוליטר חיץ מדללים מיוזין חמש A עם תגי דגל ב -30. קפלו מאגר M חמש לריכוז סופי של 250 ננו טוחנת.

מערבבים מיקרוליטר אחד של המיוזין המדולל עם מיקרוליטר אחד של Anti-Flag Q.Do 7 0 5. מוסיפים שמונה מיקרוליטר של M חמש למילוי ל -10 מיקרוליטר ופיפטה למעלה ולמטה לערבוב. ובכן לדגור במשך 10 דקות על קרח.

פיפטה 20 מיקרוליטר של מאגר הדמיה המכיל מיוזין Q נקודה לתוך תא הדגימה. דוגרים במשך שמונה עד 10 דקות. דמיין את הדגימה במיקרוסקופ הדשא בחשיפה של 30 אלפיות השנייה.

רכוש לפחות 1000 פריימים כדי להתחיל בניתוח נתונים. פתח את קובץ הווידאו בתמונה J וחתוך את הסרטון סביב נקודה נעה. עקוב אחר הנקודה דרך הסרטון כדי ליצור קואורדינטות X ו-Y לאורך זמן בפיקסלים על ידי החלת ניתוח פיונה על כל פריים ופריים של הסרטון.

המרת פיקסלים לננומטרים כמתואר בטקסט הפרוטוקול. חשב תזוזה מהמיקום ההתחלתי כפונקציה של זמן. הפעל מבחן T על התזוזה כדי לקבל את השלבים של הליכה מיוזין.

מחק את כל ערכי האפס מהעמודה גודל צעד. שרטט את התפלגות גדלי המדרגות באמצעות מקור או matlab. התאם גאוס להיסטוגרמה.

בתמונה טיפוסית זו של שיתוק פני השטח SI 3D NA. החץ הצהוב מצביע על מולקולת SI 3D NA בודדת שפונקציית התפשטות הנקודה שלה או PSF מוצגת כאן. ה-PSF מצויד בפונקציה גאוס דו-ממדית, ומוצגים גם שאריות מתאימות. תרשים זה הוא עקבה אופיינית של ספירת פוטונים לעומת מספר מסגרת והתאמה מעריכית נותנת את מספר הפוטון הממוצע של כ-1.4 כפול 10 עד השישי כדי למדוד את גודל צעד המיוזין קובץ וידאו עם אות טוב לרעש של מיוזין בודד.

תוך כדי הליכה, חוט אקטין נלכד. שלוש מסגרות לדוגמה מוצגות. יישום פיונה על כל מסגרת מניב מרחק לעומת עקבות זמן המשורטטים באדום.

אלגוריתם למציאת צעדים המבוסס על מבחן T משמש לחילוץ שלבים בודדים והפלט מכוסה בלבן גדלי צעדים וננומטרים מסומנים בלבן. כאשר שלבים מעקבות מרובים משולבים בהיסטוגרמה, גדלי הצעדים הנמדדים מפוזרים על ידי גאוס כ-35.8 פלוס מינוס 0.4 ננומטר. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע ניסויים בפיונה, כולל הקמת מיקרוסקופ דשא כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר בעזרת נהלים אלה, חשוב למזער נזקי צילום לשימוש בכוח הרצפה ולניסויים.

אל תשכח שעבודה עם מיקרוסקופ דשא ופיונה עלולה להיות מסוכנת ביותר ויש להרכיב אמצעי זהירות כגון משקפי בטיחות בעת ביצוע הליך זה.