Name: דימות פלואורסצנטי עם דיוק אחת ננומטר (FIONA) (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: למד את שיטת FIONA לאיתור מולקולות בודדות ברמת דיוק ננומטרית. החוקרים מדדו צעדים של 36 ננומטר במיוזין על אקטין באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענקים 068,625, מענקי NSF 1,063,188 ומרכז של הפיזיקה של תאי חיים 0822613. תודה מיוחדת לד&quot;ר מרינה Marjanovic בקמן מכון ללימודי מדע וטכנולוגיה למתנה של עיני ארנב.

<ol><li>Abbe, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Relation+of+Aperture+and+Power+in+the+Microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Microscopical+Society%22%5BJournal%5D)">The Relation of Aperture and Power in the Microscope.</a> Journal of the Royal Microscopical Society. 2 (3), 300-309 (1882).</li>
<li>Abbe, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Relation+of+Aperture+and+Power+in+the+Microscope+%28continued%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Microscopical+Society%22%5BJournal%5D)">The Relation of Aperture and Power in the Microscope (continued).</a> Journal of the Royal Microscopical Society. 2 (4), 460-473 (1882).</li>
<li>Thompson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+Nanometer+Localization+Analysis+for+Individual+Fluorescent+Probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Precise Nanometer Localization Analysis for Individual Fluorescent Probes.</a> Biophysical Journal. 82 (5), 2775-2783 (2002).</li>
<li>Yildiz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+V+Walks+Hand-Over-Hand%3A+Single+Fluorophore+Imaging+with+1.5-nm+Localization%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Myosin V Walks Hand-Over-Hand: Single Fluorophore Imaging with 1.5-nm Localization.</a> Science. 300 (5628), 2061-2065 (2003).</li>
<li>Yildiz, A., Tomishige, M., Vale, R. D., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin+Walks+Hand-Over-Hand%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Kinesin Walks Hand-Over-Hand.</a> Science. 303 (5658), 676-678 (2004).</li>
<li>Yildiz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+VI+Steps+via+a+Hand-over-Hand+Mechanism+with+Its+Lever+Arm+Undergoing+Fluctuations+when+Attached+to+Actin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Myosin VI Steps via a Hand-over-Hand Mechanism with Its Lever Arm Undergoing Fluctuations when Attached to Actin.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (36), 37223-37226 (2004).</li>
<li>Yildiz, A., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+Imaging+with+One+Nanometer+Accuracy%3A+Application+to+Molecular+Motors%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Fluorescence Imaging with One Nanometer Accuracy: Application to Molecular Motors.</a> Accounts of Chemical Research. 38 (7), 574-582 (2005).</li>
<li>Toprak, E., Yildiz, A., Hoffman, M. T., Rosenfeld, S. S., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+kinesin+is+so+processive%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Why kinesin is so processive.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (31), (2009).</li>
<li>Kural, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+melanosomes+inside+a+cell+to+study+molecular+motors+and+their+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Tracking melanosomes inside a cell to study molecular motors and their interaction.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (13), 5378-5382 (2007).</li>
<li>Gordon, M. P., Ha, T., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+high-resolution+imaging+with+photobleaching%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Single-molecule high-resolution imaging with photobleaching.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (17), 6462-6465 (2004).</li>
<li>Qu, X., Wu, D., Mets, L., Scherer, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanometer-localized+multiple+single-molecule+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Nanometer-localized multiple single-molecule fluorescence microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (31), 11298-11303 (2004).</li>
<li>Churchman, L. S., Ökten, Z., Rock, R. S., Dawson, J. F., Spudich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+molecule+high-resolution+colocalization+of+Cy3+and+Cy5+attached+to+macromolecules+measures+intramolecular+distances+through+time%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Single molecule high-resolution colocalization of Cy3 and Cy5 attached to macromolecules measures intramolecular distances through time.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (5), 1419-1423 (2005).</li>
<li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Super-Resolution+Imaging+by+Stochastic+Optical+Reconstruction+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy.</a> Science. 319 (5864), 810-813 (2008).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat Meth. 3 (10), 793-796 (2006).</li>
<li>Bates, M., Huang, B., Dempsey, G. T., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+Super-Resolution+Imaging+with+Photo-Switchable+Fluorescent+Probes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multicolor Super-Resolution Imaging with Photo-Switchable Fluorescent Probes.</a> Science. 317 (5845), 1749-1753 (2007).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Intracellular+Fluorescent+Proteins+at+Nanometer+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li>
<li>Abramoff, M. D., Magalhães, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+processing+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Biophotonics+international%22%5BJournal%5D)">Image processing with ImageJ.</a> Biophotonics international. 11 (7), 36-42 (2004).</li>
<li>Enderlein, J., Toprak, E., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization+effect+on+position+accuracy+of+fluorophore+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Polarization effect on position accuracy of fluorophore localization.</a> Optics Express. 14 (18), 8111-8120 (2006).</li>
<li>Cheezum, M. K., Walker, W. F., Guilford, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+comparison+of+algorithms+for+tracking+single+fluorescent+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Quantitative comparison of algorithms for tracking single fluorescent particles.</a> Biophysical Journal. 81 (4), 2378-2388 (2001).</li>
<li>Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonblinking+and+long-lasting+single-molecule+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).</li>
<li>Zhuang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Single-Molecule+Study+of+RNA+Catalysis+and+Folding%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Single-Molecule Study of RNA Catalysis and Folding.</a> Science. 288 (5473), 2048-2051 (2000).</li>
<li>Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Oxygen+Scavenging+System+for+Improvement+of+Dye+Stability+in+Single-Molecule+Fluorescence+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">An Oxygen Scavenging System for Improvement of Dye Stability in Single-Molecule Fluorescence Experiments.</a> Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

FIONA הוא טכניקה למקם את עמדתו של פולט ניאון (fluorophore אורגני או נקודה קוונטית) עם דיוק ננומטר ופתרון זמני עד ל1 msec 4 8. כאשר מספיק פוטונים נאספים, טכניקה זו מאפשרת לקבוע את המיקום של פולט ניאון הרבה יותר מדויק מגבול ההשתברות (~ 200 ננומטר) ולכן טכניקה זו פותחת את דרך לקיים את מה שלא כבר ראה במיקרוסקופ אופטי רגיל / מסורתי 4 - 8. מאז המצאתה, פיונה יושמה בהצלחה להתבוננות הליכה רבים מנועים מולקולריים, כגון myosins וkinesins. לאחרונה, זה, יחד עם עבודה אחרת <...

סביב 1882, ארנסט אבה מצא כי הרזולוציה של מיקרוסקופ אור הנראה היא ~ λ / 2nA, או ~ 200 ננומטר (שבו λ הוא אורך הגל וNA הוא הצמצם המספרי) 1,2. לכן כל חפץ קטן יותר מממד זה יופיע כנקודה עקיפה מוגבלת במיקרוסקופ אופטי. עם זאת, ניתן לקבוע את המרכז של המקום, כלומר, המיקום של האובייקט, עם דיוק גבוה בהרבה 3. דימות פלואורסצנטי עם דיוק אחד ננומטר (FIONA) היא טכניקה פשוטה אך שימושית לאיתור fluorophores היחיד עם דיוק ננומטר במישור XY 4. הדיוק של לוקליזציה, σ μ (כלומר, שגיאת התקן של הממוצע), תלויה במספר הכולל של פוטונים שנאספו, <img alt="משוואת 1" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/51774/intro_eqn.jpg" width="100"> , כאשר N הוא מספר הפוטונים, ים היא סטיית התקן של נקודת הניאון, הואגודל פיקסל של גלאי ההדמיה, וb הוא סטיית התקן של הרקע 3,4. לfluorophore פולט ~ 10,000 פוטונים, פיונה יכולה להשיג דיוק ננומטר ~ 1 4. FIONA יכול לשמש כדי לקבוע את המיקום של פולט נייח, או אחד מרגש (בהנחה שתמונות ניתן לקחת מספיק מהר) באופן מדויק. יכול להיות מיושם FIONA ברצף למסגרות של הסרט ובכך לעקוב אחר התנועה של המולקולה בודדת 4 8. ריאגנטים תמונה מגן עשויים להיות נחוצים כדי להבטיח כי המדגם אינו מתפרק באור. יתר על כן, עצם הניאון עצמו עשוי להיות בכל גודל, קטן יותר או גדול יותר מעקיפת limit- למשל, זה יכול להיות מורכב מאברון (~ 1 מיקרומטר) עם חלבוני ניאון רבים התפזרו על הממברנה שלו. באמצעות FIONA עדיין יכול להניב ממוצע מדויק מאוד (ננומטר) של המרכז של מסה הממוצע שלה. השיפור הגדול בדיוק לוקליזציה על ידי FIONA מאפשר פתרון nanomeתנועות ter בקנה מידה לאורך זמן. זה דחף את מיקרוסקופיה לתוך קנה המידה האורך המולקולרי 4 8. מאז המצאתה, וריאנטים של פיונה פותחו. לדוגמא, הדמיה בהירה שדה עם דיוק אחד ננומטר (bFIONA) 9, גרסה קלה של פיונה, תמונות וlocalizes אובייקטים צפופים כגון melanosomes in vivo (אובייקטים כהים המכילים את פיגמנט המלנין) עם אור מועבר. בנוסף, פיונה כבר מועסק כדי לפתור צבעים מרובים. לדוגמא, הדמיה מולקולה בודדת ברזולוציה גבוהה עם photobleaching (שרימפס) 10,11 או colocalization ברזולוציה גבוהה מולקולה בודדת (SHREC) 12 פותחו כדי לפתור שני צבעים בתוך כ10 ננומטר. (שים לב שזה הוא ברזולוציה, כלומר כמה במדויק אחד לא יכול להגיד צבעים זהים זה מזה.) לאחרונה, ניתוח FIONA תרם לתהליך הלוקליזציה של מיקרוסקופיה ברזולוציה סופר מסוימת, כגון RECO האופטי סטוכסטייםמיקרוסקופיה nstruction (STORM) 13- 15 ומיקרוסקופיה לוקליזציה המופעלת תמונה (PALM) 16, שבי fluorophores הכהה הזמני שמחים, ולאחר מכן הקרינה היא מקומית. על ידי שוב ושוב מרגשת צפיפות נמוכה למדי של צבעים (מקום מוגבל עקיפה לפחות מאחד), ולאחר מכן לאסוף את הקרינה, ניתוח כל אחד מהם על ידי פיונה, אחד יכול לבנות את המפה ברזולוציה גבוהה. הרזולוציה אז מוגבלת רק במספר הפוטונים כל צבע מעביר החוצה, כמו גם דברים כמו שמירה נייחת המדגם (כולל, למשל, את הבמה מיקרוסקופ) במהלך הרכישה. במאמר זה, סיכום של טכניקת פיונה ויתארו בקצרה דוגמאות של מחקר שבוצע באמצעות FIONA מדווח. ראשית, כיצד להגדיר את הציוד דרוש לשם ניסויי פיונה, כלומר, בסך הכל מיקרוסקופ פלואורסצנטי ההשתקפות הפנימי (TIRFM), עם פרטים על יישור אופטיקה, מתואר. אז איךלבצע ניסוי FIONA פשוט על הלוקליזציה של מולקולות בודדות Cy3-DNA המשותק באמצעות פרוטוקולים מתאימים, בא לידי ביטוי. אחרי זה, את השימוש בFIONA כדי למדוד את גודל צעד 36 ננומטר של מנוע Va יחיד שרירן הקטוע שכותרתו עם נקודה קוונטית מוצג. שרירן Va הוא חלבון מנוע התהליכית חיוני אשר נושא מטען סלולארי בזמן translocating לאורך סיביים אקטין. כאן שרירן Va לבנות קטום משמש כדי להסיר תחומים רלוונטיים לגודל הצעד, ועם תג דגל נוספו לC-הסופי כדי לאפשר הקלות של תיוג עם נקודות קוונטיות פונקציונליות עם נוגדני Anti-FLAG. ניסוי זה נעשה תחת ATP הנמוך להאט את שרירן ולאפשר את השימוש בזמני חשיפה ארוכים מספיק כדי לקבל ספירת פוטון טובה בכל מסגרת. כל תווית ניאון מספיק בהירה יכולה להיות תחליף בפרוטוקול הבא. לבסוף, המאמץ האחרון של הארכת היישום של פיונה לדגימות עבות מדווח. כעיקרון הוכחה של, נקודות קוונטיות היו ספוגותבסול ג'ל וקרניות עיני ארנב ולאחר מכן צילם ומקומי באמצעות פיונה. להדמיה, מטרת טבילת 60X מים עם NA = 1.2 שימשו כי יעד זה יש מרחק כבר לא עובד יותר אובייקטיבי טבילת שמן ששימש בעבר 100X. כדי לפצות על האובדן בהגדלה במטרה, עדשה נוספת להגדלה החזקה (3.3X או 4.0x) הוכנסה בנתיב הפליטה. בנוסף, עלית הקרינה (לא TIR) מיקרוסקופיה צריכה לשמש כדי לגשת אזורים עמוקים בדגימות העבות. הוא הראה כי נקודות קוונטיות ספוגות עמוק בסול ג'ל ובקרניות עיני ארנב (Z&gt; 200 מיקרומטר) יכול להיות מקומיות עם 2-3 דיוק ננומטר.

<table><tbody><tr><td>סרט דו צדדי</td><td>3M</td><td></td> <td>~ 75 & # 181; </td></tr><tr><td>מצלמת EMCCD</td> עבה m <td>Andor Technology</td><td>DU-897E-CS0-#BV</td><td></td></tr><tr><td>מנקה אולטרסאונד</td><td>ברנסון</td><td>2510</td><td></td></tr><tr><td>סט מסנני פלואורסצנטי</td><td>Chroma</td><td>49016</td><td></td></tr><tr><td>מאגר פילמור אקטין&nbsp;</td><td>שלד ציטו&nbsp;</td><td>BSA02</td><td></td></tr><tr><td>ביוטין G-אקטין</td><td>שלד ציטו&nbsp;</td><td>AB07</td><td></td></tr><tr><td>ג'י-אקטין&nbsp;</td><td>שלד ציטו&nbsp;</td><td>AKL95</td><td></td></tr><tr><td>מאגר אקטין כללי&nbsp;</td><td>שלד ציטו&nbsp;</td><td>BSA01</td><td></td></tr><tr><td>תריס לייזר (עם דרייבר)</td><td>Electro-Optical Products Corp.&nbsp;</td><td>SH-10-MP</td><td></td></tr><tr><td>IDL</td><td>Exelis פתרונות</td><td></td><td></td>מידע חזותי</tr><tr><td>Neutravidin&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>PI-31000</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Fisherbrand&nbsp;</td><td>22X30-1.5</td><td>0.16-0.19 מ"מ עובי</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ שקופית</td><td>חותם זהב מיקרושקופיות&nbsp;</td><td>30103X1</td> מנקה פלזמה <td>בעובי 0.93-1.05 מ"מ</td></tr><tr><td></td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תחתונה מזכוכית&nbsp;</td><td>במבחנה מדעית</td><td>D35-20-1.5-N</td><td></td></tr><tr><td>Cy3-DNA oligos</td><td>טכנולוגיות DNA</td><td></td> משולבות <td>5'-Cy3/GCCTCGCTGCCGTCGCCA-3'חרוזים</td></tr><tr><td>פלואורסצנטיים ביולוגיים&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>T-7280</td><td></td></tr><tr><td>Qdot 605-streptavidin&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>Q10101MP</td><td></td></tr><tr><td>Qdot605&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>Q21301MP</td><td></td></tr><tr><td>Qdot705</td><td>Invitrogen</td><td>Q22021MP&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Qdot705 ערכת צימוד נוגדנים</td><td>Invitrogen</td><td>Q22061MP</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>שולחן אופטי</td><td>Newport Corp</td><td></td><td>RS4000 Series</td></tr><tr><td>60X מטרה</td><td>Nikon</td><td>Plan Apo VC 60x WI</td><td></td></tr><tr><td>100X Objective</td><td>Olympus</td><td>PlanApo 100X/1.45 Oil &infin;/0.17</td><td></td></tr><tr><td>60X Objective</td><td>מיקרוסקופ הפוך Olympus</td><td>UPlanApo 60X/1.20W</td><td></td></tr><tr><td>Olympus</td><td></td><td>IX71/IX70/IX81</td><td></td></tr><tr><td>Origin OriginLab</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד FLAG</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>F7425-.2MG</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>BME&nbsp;</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>63689-25ML-F</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>BSA-ביוטין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>A8549-10MG</td><td></td></tr><tr><td>CK</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>C3755</td><td>קריאטין פוספוקינאז משריר ארנב</td></tr><tr><td>CP</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>P1937</td><td>פוספוקריאטין די (טריס) מלח</td></tr><tr><td>DTT</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>43815</td><td>DL-Dithiothreitol</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E3889</td><td>אתילן גליקול-ביס(2-אמינואתילאתר)-N,N,N&prime;,N&prime; -חומצה טטראצטית</td></tr><tr><td>HCl&nbsp;</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>93363-500 גרם</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>PCA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>03930590</td><td>חומצה פרוטוקטכואית&nbsp;</td></tr><tr><td>PCD</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>P8279</td><td>פרוטוקאטצ'ואט-3,4-דיאוקסיגנאז&nbsp;</td></tr><tr><td>TMOS</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>341436-25G</td><td>טטרמתיל אורתוסיליקט</td></tr><tr><td>Tris-HCl&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>93363</td><td></td></tr><tr><td>Trolox</td><td>Sigma Aldrich</td><td>238813</td><td>6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid</td></tr><tr><td>מראות דיאלקטריות בפס רחב בקוטר 1 אינץ' עם תושבות</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>BB1-E02, KM100</td><td>כמות: 2</td></tr><tr><td>&frac12; &rdquo; עמודי קוטר</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>כמות TR4</td><td>&ge; 6</td></tr><tr><td>מרחיב קרן 10X</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>עדשת BE10M-A</td><td></td></tr><tr><td>בקוטר 2 אינץ' f = 300 מ"מ עם תושבת</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>עדשת LA1256-A, LMR2</td><td>TIR</td></tr><tr><td>יעד יישור פלואורסצנטי&nbsp;</td><td>ת'ורלאבס&nbsp;</td><td></td><td></td>VRC2SM1</tr><tr><td>משקפי בטיחות לייזר</td><td>Thorlabs&nbsp;</td>מסנני <td>LG3</td><td></td></tr><tr><td>NDThorlabs</td><td>&nbsp;</td><td>פרופיל קרן אופטי FW1AND</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>BP209-VIS</td><td></td></tr><tr><td>דיאפרגמת קשתית לאחר התקנה</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>כמות ID25</td><td>: 2</td></tr><tr><td>אינטרפרומטר גזירה</td><td>Thorlabs&nbsp;</td>שלב התרגום <td>SI100</td><td></td></tr><tr><td>XYZ, &frac12; &rdquo; נסיעות&nbsp;</td><td>ת'ורלאבס&nbsp;</td><td>T12XYZ</td><td></td></tr><tr><td>לייזר</td><td>וורלד סטאר טכנולוגיות&nbsp;</td><td>TECGL-30</td><td>532 ננומטר, 30 mW</td></tr></tbody></table>

דימות פלואורסצנטי עם דיוק אחת ננומטר (fiona)

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

דימות פלואורסצנטי עם דיוק אחד ננומטר (FIONA) היא טכניקה פשוטה אך שימושית לאיתור fluorophores היחיד עם דיוק ננומטר במישור XY. הנה סיכום של טכניקת פיונה דיווח ודוגמאות של מחקר שבוצעו באמצעות FIONA יתוארו בקצרה. ראשית, כיצד להגדיר את הציוד דרוש לשם ניסויי פיונה, כלומר, בסך הכל מיקרוסקופ פלואורסצנטי ההשתקפות הפנימי (TIRFM), עם פרטים על יישור אופטיקה, מתואר. אז איך לבצע את ניסוי FIONA פשוט על הלוקליזציה של מולקולות בודדות Cy3-DNA המשותק באמצעות פרוטוקולים מתאימים, ואחריו את השימוש בFIONA כדי למדוד את גודל צעד 36 ננומטר של מנוע Va יחיד שרירן הקטוע שכותרתו עם נקודה קוונטית, בא לידי ביטוי. לבסוף, המאמץ האחרון כדי להרחיב את היישום של פיונה לדגימות עבות מדווח. הוא הראה כי, באמצעות מטרת טבילה במים ונקודות קוונטיות ספוגות עמוקות בסול ג&#39;ל וקרניות עיני ארנב (&gt;200 מיקרומטר), דיוק לוקליזציה של 2-3 ננומטר יכול להיות מושגת.

התקנת TIRFM אובייקטיבי מסוג טיפוסית מוצגת באיור 3. ראשון, מדגם Cy3-DNA-משותק משטח היה צילם. תמונה טיפוסית מוצגת באיור 4 א. התמונה צולמה עם זמן חשיפה 0.5 שניות, עם רווח EM = 50 ורגישות CCD = 12.13 למצלמה. נקודת התפשטות הפונקציה (כוחות הביטחון הפלסטיניים) של מולקולת Cy3-DNA בודד מוצגת באיור 4 ב (מהמקום המסומן בחץ באיור 4 א), שבו הצבע בר מציג את הסולם של עוצמות פיקסל. ספירת הפוטון בפועל יכולה להיות מחושבת על ידי הכפל...

יכול להיות מקומי fluorophores יחיד עם דיוק ננומטר באמצעות פיונה. הנה סיכום של טכניקת FIONA מדווח, וכיצד לבצע את ניסויי FIONA מתואר.

דימות פלואורסצנטי עם דיוק אחת ננומטר (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים כיצד לבצע הדמיה פלואורסצנטית בדיוק של ננומטר אחד או ניסויי פיונה. זה מושג על ידי הגדרת הציוד הנדרש תחילה ויישור האופטיקה להחזר פנימי מלא, פלואורסצנטי, מיקרוסקופיה או דשא. השלב הבא הוא לשתק את CY 3D NA על פני השטח הפנימיים של תא דגימה ולמקם מולקולות בודדות CY 3D NA בדיוק ננומטרי.לאחר מכן, פיונה מיושמת כדי לחקור את התנועה של מיוזין קטום יחיד חמש מנוע המסומן בנקודה קוונטית. בסופו של דבר, גודל הצעד של המיוזין כשהוא הולך, אקטון נמדד כ-36 ננומטר על ידי ניתוח פיונה. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי מנועים מולקולריים, ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות כגון מעקב אחר קולטנים על קרום התאים.הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד את פרטי הניסוי. חשוב להרכיב משקפי בטיחות לייזר בכל עת במהלך ההתקנה. להשתקפות פנימית כוללת, פלואורסצנטיות, מיקרוסקופיה או דשא.כדי להתחיל הגדר את הגבהים של כל הרכיבים האופטיים לגובה מרכז המיקרוסקופ, היציאה האחורית, התקן את מסנני הלייזר, תריס הלייזר וה-ND. השתמש במסנני ND כדי להחליש את עוצמת הלייזר נמוכה ככל האפשר תוך שמירה על הקרן גלויה. הדק את הברגים עם מפתחות המשושה המתאימים.תכנן נתיב אלומה כפי שמוצג על ידי הקווים הכחולים המנוקדים. בסכימה זו, סמן את נתיב האלומה עם סרט או טוש על השולחן האופטי. הנח את המראה M1 בפנייה הראשונה בזווית ישרה, הנח את שתי הקשתיות לאורך החלק הישר השני של נתיב האלומה המתוכנן.כוונן גם את המיקום וגם את ההטיה של M1 כך שהלייזר יעבור דרך הקשתית במקום המראה M שתיים. בפנייה השנייה בזווית ישרה הנח את מרחיב הקרן 10 x לאורך הקטע הישר השלישי של השביל. התאם את ההטיה שלו כך שמרחיב האלומה יהיה מקביל הן לשולחן האופטי והן לנתיב האלומה המתוכנן.השלב הבא הוא להתאים את M1 ו-M שניים באופן איטרטיבי כך שהלייזר יעבור ישר דרך המרכזים של שתי העדשות, L אחד ו-L שניים של מרחיב האלומה. השתמש בפיסת נייר לבן כדי לחסום את הקורה לאחר מרחיב האלומה כדי לבדוק את פרופיל הקרן בעין. התאם עד שפרופיל האלומה של הקורה המורחבת אינו ED.גאוס מכוון את המרחק בין L אחד ל-L שתיים כך שהקרן תהיה תריס אסוף. הלייזר משחרר את מטרת המיקרוסקופ ומבריג יישור פלורסנט. מראות מיקום המטרה M שלוש ו-M ארבע כדי לכוון את האלומה המורחבת לתוך יציאת המיקרוסקופ ואל המראה הדיכרואית.בתוך הצריח. כוונן את M שלוש כדי למרכז את החלק הבהיר ביותר של הקרן על המטרה הפלואורסצנטית ו-M ארבע כדי לגרום לקרן להטות אנכית, תריס את הלייזר והברג את המטרה בחזרה. קנס. כוונן את ההטיות של M שלוש ו-M ארבע כדי לייעל את עוצמת הלייזר ופרופיל הקרן מחוץ למטרה.התקן מצלמת E-M-C-C-D למיקרוסקופ וחבר את המצלמה למחשב. הפעל את התוכנה עבור המצלמה. הרכיב דגימת פלורסנט על המיקרוסקופ.הסתכלו על הנקודה הפלואורסצנטית הבהירה במצלמה. בדוק שהנקודה אינה זזה על המסך מכיוון שהפוקוס השתנה. הנח את עדשת ה-TIR על שלב התרגום XY, Z במרחק ממישור המוקד האחורי של האובייקט השווה לאורך המוקד, ה-L שלוש, שהוא כ-30 סנטימטרים.כוונן את המיקום של L שלוש כך שהלייזר יעבור דרך מרכז העדשה. תרגם את L שלוש לאורך נתיב האלומה כדי להתאים את איסוף האלומה. ודא שהקרן עדיין מרוכזת על הצג וצורתה סימטרית.תרגם את L שלוש בניצב לנתיב האלומה כדי להטות את האלומה אל מחוץ למטרה. המשך לתרגם את עדשת ה-TIR כך ש-TIR יושג לפני ביצוע פיונה. ניסוי בלוקליזציה וגיוס CY 3D NA. מולקולות בודדות בונות תאי דגימה כמפורט בטקסט הפרוטוקול.שתי רצועות של סרט דו צדדי מוחלות על המגלשה לאורך הקצוות הארוכים, משאירות פער של שלושה עד חמישה מילימטרים במרכז ואז מונחת החלקת כיסוי נקייה על גבי המגלשה בצד השקופית מוצגות תצוגות צד של החדר מימין ומקדימה. הקצוות הפתוחים של החדר נותרים פתוחים ומשמשים ככניסה ויציאה כדי לשתק את SI 3D NA על המשטחים הפנימיים של תא הדגימה. פיפטה 10 מיקרוליטר ביוטין BSA לתוך החדר.המתן חמש דקות. שטפו את תא הדגימה על ידי פיפטינג של 40 מיקרוליטר של T 50 BSA לתוך החדר. לאחר מכן פיפטה 10 מיקרוליטר של נויט טראווין לתוך החדר ודגירה למשך חמש דקות.שטפו את החדר שוב עם 40 מיקרוליטר של פיפטה T 50 BSA, 20 מיקרוליטר של SI 3D NA לתוך תא הדגימה ודגרו למשך חמש דקות. לבסוף, שטפו את החדר עם 80 מיקרוליטר של T 50 BSA. כדי להתחיל בהליך הדמיית SI 3D NA מולקולות בודדות מתחת לדשא M פיפטה 30 מיקרוליטר של מאגר הדמיה לתוך תא הדגימה והמתן שמונה עד 10 דקות.הרכיב את הדגימה להדמיה על מיקרוסקופ דשא המצויד בלייזר ירוק, מטרת טבילה בשמן פי 100 ומצלמת E-M-C-C-D. הגדר את זמן החשיפה ואת רווח ה- EM. רכוש סרט של המדגם עבור 1000 פריימים.הידור והפעלה של ניתוח Fiona Pro for Fiona. השתמש בתוכנית IDL זו כדי לייבא את התמונה שנרכשה כדי להזין את גודל הפיקסלים האפקטיבי ואת גורם ההמרה מעוצמה למספר פוטון ולבחור נקודות לניתוח פיונה. בסוף, התוכנית תפיק את תוצאות ההתאמה עם פונקציות גאוס דו-ממדיות, כמו גם מספרי פוטונים כוללים ודיוק לוקליזציה, הידור והפעלת ספירת pH pro.כדי לאפיין את ספירת הפוטונים, השתמש בתוכנית DL זו כדי למדוד את המספר הממוצע של פוטונים הנפלטים על ידי פלורה. ארבעה לפני הלבנת תמונות כדי לייבא את התמונה שנרכשה ולהזין את מקדם ההמרה מעוצמה למספר פוטון. התוכנית תזהה כתמים פלואורסצנטיים, תחשב אוטומטית את ספירת הפוטונים כפונקציה של מספר המסגרת ותוציא את עקבות ספירת הפוטונים.הכן את הדגימה לניסוי זה על ידי פיפטינג של 20 מיקרוליטר של BSA ביוטיניל במיליגרם אחד למיליליטר ב-DD H2O לתוך תא דגימה. דגירה למשך 10 דקות. שוטפים עם 30 מיקרוליטר D ddh, שני פיפטות O ב-0.5 מיליגרם למיליליטר של נויט טרביין ודוגרים למשך שתי דקות.שטפו את החדר עם 30 מיקרוליטר של M חמש PSA. יש להכין את האקטון לניסוי זה ביום הקודם כמתואר בטקסט הפרוטוקול. מדללים את האקטין המוכן 25 פעמים באופן כללי, מאגר אקטין לריכוז סופי של כ-0.004 מיליגרם למיליליטר.הכניסו את תמיסת האקטין לתא והמתינו 10 דקות. שטפו את החדר עם 30 מיקרוליטר חיץ מדללים מיוזין חמש A עם תגי דגל ב -30. קפלו מאגר M חמש לריכוז סופי של 250 ננו טוחנת.מערבבים מיקרוליטר אחד של המיוזין המדולל עם מיקרוליטר אחד של Anti-Flag Q.Do 7 0 5. מוסיפים שמונה מיקרוליטר של M חמש למילוי ל -10 מיקרוליטר ופיפטה למעלה ולמטה לערבוב. ובכן לדגור במשך 10 דקות על קרח.פיפטה 20 מיקרוליטר של מאגר הדמיה המכיל מיוזין Q נקודה לתוך תא הדגימה. דוגרים במשך שמונה עד 10 דקות. דמיין את הדגימה במיקרוסקופ הדשא בחשיפה של 30 אלפיות השנייה.רכוש לפחות 1000 פריימים כדי להתחיל בניתוח נתונים. פתח את קובץ הווידאו בתמונה J וחתוך את הסרטון סביב נקודה נעה. עקוב אחר הנקודה דרך הסרטון כדי ליצור קואורדינטות X ו-Y לאורך זמן בפיקסלים על ידי החלת ניתוח פיונה על כל פריים ופריים של הסרטון.המרת פיקסלים לננומטרים כמתואר בטקסט הפרוטוקול. חשב תזוזה מהמיקום ההתחלתי כפונקציה של זמן. הפעל מבחן T על התזוזה כדי לקבל את השלבים של הליכה מיוזין.מחק את כל ערכי האפס מהעמודה גודל צעד. שרטט את התפלגות גדלי המדרגות באמצעות מקור או matlab. התאם גאוס להיסטוגרמה.בתמונה טיפוסית זו של שיתוק פני השטח SI 3D NA. החץ הצהוב מצביע על מולקולת SI 3D NA בודדת שפונקציית התפשטות הנקודה שלה או PSF מוצגת כאן. ה-PSF מצויד בפונקציה גאוס דו-ממדית, ומוצגים גם שאריות מתאימות. תרשים זה הוא עקבה אופיינית של ספירת פוטונים לעומת מספר מסגרת והתאמה מעריכית נותנת את מספר הפוטון הממוצע של כ-1.4 כפול 10 עד השישי כדי למדוד את גודל צעד המיוזין קובץ וידאו עם אות טוב לרעש של מיוזין בודד.תוך כדי הליכה, חוט אקטין נלכד. שלוש מסגרות לדוגמה מוצגות. יישום פיונה על כל מסגרת מניב מרחק לעומת עקבות זמן המשורטטים באדום.אלגוריתם למציאת צעדים המבוסס על מבחן T משמש לחילוץ שלבים בודדים והפלט מכוסה בלבן גדלי צעדים וננומטרים מסומנים בלבן. כאשר שלבים מעקבות מרובים משולבים בהיסטוגרמה, גדלי הצעדים הנמדדים מפוזרים על ידי גאוס כ-35.8 פלוס מינוס 0.4 ננומטר. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע ניסויים בפיונה, כולל הקמת מיקרוסקופ דשא כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר בעזרת נהלים אלה, חשוב למזער נזקי צילום לשימוש בכוח הרצפה ולניסויים.אל תשכח שעבודה עם מיקרוסקופ דשא ופיונה עלולה להיות מסוכנת ביותר ויש להרכיב אמצעי זהירות כגון משקפי בטיחות בעת ביצוע הליך זה.

fluorescence-imaging-with-one-nanometer-accuracy-fiona

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מתארים שיטה לאיתור חלבונים מתויגים fluorescently בmicrographs אלקטרונים. פלואורסצנטי הוא מקומי הראשון באמצעות מיקרוסקופ לוקליזציה תמונה המופעל על חלקי Ultrathin. תמונות אלה אז מיושר לmicrographs אלקטרונים של אותו הסעיף.

ננו פאם: לוקליזציה חלבון באמצעות מיקרוסקופ לוקליזציה תמונה מופעלת ומיקרוסקופי אלקטרונים

אנו מתארים את ההכנה של נקודתי קוונטיות colloidal עם גודל הידרודינמית ממוזער עבור דימות פלואורסצנטי מולקולה בודדה. בהשוואה לנקודות קוונטיות קונבנציונליות, חלקיקים אלה הם בגודל דומים לחלבונים כדוריים ומותאמים לבהירות מולקולה בודדה, יציבות נגד photodegradation, והתנגדות לקשירה לא ספציפית לחלבונים ותאים.

נקודות קוונטיות קומפקטיות להדמית מולקולה בודדה

אנו מדגימים את השימוש במיקרוסקופ לוקליזציה של הפעלת פוטו פלואורסצנטי (FPALM) כדי לדמות בו זמנית סוגים מרובים של מולקולות המסומנות באופן פלואורסצנטי בתוך התאים. הטכניקות המתוארות מניבות לוקליזציה של אלפי עד מאות אלפי חלבונים בודדים המסומנים בסימון פלואורסצנטי, עם דיוק של עשרות ננומטרים בתוך תאים בודדים.

הדמיה סימולטנית רב-צבעונית של מבנים ביולוגיים עם מיקרוסקופ לוקליזציה של פוטו-אקטיבציה פלואורסצנטית

הדמיה ארבעה ממדים (4D) מנוצל כדי ללמוד את ההתנהגות ואינטראקציות בין שני סוגים של endosomes בחיים מסוף עצב חוליות. תנועה של המבנים הקטנים האלה מתאפיינת בשלושה ממדים, המאפשרת אישור של אירועים כגון היתוך endosome וexocytosis.

ויזואליזציה של Endosome Dynamics בחי מסוף עצב עם דימות פלואורסצנטי ארבעה ממדים

אנו מציגים פרוטוקול עבור היישום של interferometric PhotoActivated לוקליזציה מיקרוסקופי (iPALM), שיטה מיקרוסקופית 3 ממדי מולקולה בודדת לוקליזציה סופר רזולוציה, אל ההדמיה של שלד התא יקטין בתאי יונקים חסידים. גישה זו מאפשרת הדמיה מבוססת אור של תכונות מבניות ננו שאחרת נותרו לא פתורים על ידי מיקרוסקופיה אופטית-מוגבל עקיפה קונבנציונלית.

תלת מימדי סופר רזולוציה מיקרוסקופית של סיבים F- אקטין ידי interferometric PhotoActivated לוקליזציה מיקרוסקופית (iPALM)

אנו מציגים את הליך ההתקנה והניסוי להשגת נתוני smFRET מרשתות תורמים-מקבלות גדולות עם מיקרוסקופ TIRF. הניתוח שלב אחר שלב של מדידות אלו עם תוכנת ההסקה הבייסיאנית Fast-NPS מניב מידע מבני ברזולוציה גבוהה באמצעות יישום מודלים מותאמים של צבע.

מידע מבני מ-מולקולה בודדת סריג ניסויים באמצעות מערכת ננו-המיצוב המהירה

תיוג תחום תאי של חלבון הממברנה עם fluorophore pH רגיש, superecliptic pHluorin (ספטמבר), מאפשר לוקליזציה, ביטוי subcellular, וסחר שייקבע. הדמיה ספטמבר- שכותרתו חלבונים עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי השתקפות פנימית מוחלטת (TIRFM) מאפשרת כימות של רמות חלבון בקרום ER ו פלזמה הפריפריה.

ניצול רצפטורים-tagged pHluorin לפקח subcellular לוקליזציה וסחר

המטרה הכוללת של מתודולוגיה זו היא לתת את התנאים ניסיוני אופטימלית של הכנת הדוגמא ייבוא תמונות ושיחזור על מנת לבצע צבע כפול 2D תמונות dSTORM של microtubules חוטים ביניים בתאים...

הדמיה חוטים ביניים Microtubules עם מיקרוסקופ 2-ממדי ישירה שחזור אופטי סטוכסטי

כאן אנו מציגים מדריך מעשי של בניית מערכת משולבת מיקרוסקופ, אשר ממזג הדמיה epi-פלורסנט קונבנציונלי הדמיה המבוססת על זיהוי סופר-ברזולוציה מולקולה בודדת, גילוי מולקולה בודדת צבע רב, כולל מולקולה בודדת פלורסצנטיות תהודה העברת האנרגיה הדמיה, לתוך הגדרת אחד באופן יעיל.

ניצוח מספר מצבי הדמיה עם מיקרוסקופ זריחה אחת

זרימת עבודה זו מאפשרת ייצור למלה המכוון למבנים ביולוגיים בעלי תווית פלואורסצנטית שהם קטנים (&lt;1 מיקרומטר בהיקף צירי) ונדירים (עותק אחד לתא) באמצעות פלטפורמת הדמיה תלת-צירית קריוגנית. פלטפורמה זו משלבת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, כרסום קרן יונים ממוקדת ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק במיקום מוקד יחיד ומאפשרת מיקרוסקופ פלואורסצנטי בו זמנית בזמן הכרסום.

זרימת עבודה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, אלקטרונים וקרן יונים קריוגני לכרסום ממוקד של תאים

למד את שיטת FIONA לאיתור מולקולות בודדות ברמת דיוק ננומטרית. החוקרים מדדו צעדים של 36 ננומטר במיוזין על אקטין באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה.

דימות פלואורסצנטי עם דיוק אחת ננומטר (FIONA)

גלה סרטונים נוספים