מדידה של אפקטי נוגדנים על תפקוד תאי של cardiomyocytes המבודד
8 במרץ 2013
השיטה הוצגה מציעה דרך לזהות נוגדנים עצמיים cardiotropic יעילים פונקציונליים בפלזמה של חולים עם קרדיומיופתיה המורחבת, ללא קשר לאנטיגן הספציפי, על ידי ניתוח ההשפעה של אימונוגלובולין חולה המבודד בקיצור הסלולר וארעי סידן תאי בcardiomyocytes חולדה המבודדת.
המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לזהות נוגדנים קרדיוטרופיים בפלזמה של מטופלים עם קרדיומיופתיה דילטטיבית או מחלות לב אחרות בעלות רקע אוטואימוני. דבר זה מושג על ידי מיני-ספיחה חיסונית ראשונית של פלזמת המטופל בעמודי ספירות anti IgG לניקוי אימונוגלובולין G כשלב שני. קרדיומיוציטים ונטריקולריים מבודלים מחולדות Wistar בוגרות, המספקות את הבסיס התאי לבדיקה ביולוגית זו.
בשלב הבא, מאפשרים לתאי השריר הלבבי (cardiomyocytes) להיצמד לזכוכית הכיסוי של התא וצובעים אותם ב-URA 2:00 AM כדי לאפשר תצפית על תנודות סידן תוך-תאיות במהלך התכווצויות, ולאחר מכן בודקים את ה-IgG של המטופל כדי לבחון את השפעתו על כושר התכווצות תאי השריר הלבבי. התוצאות מדגימות האם ה-IgG של המטופל מכיל נוגדנים טרופיים, בהתבסס על שינויים בכושר התכווצות ובנוד הסידן בתאי השריר הלבבי המבודדים. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון בדיקות אימונו-ספציפיות סטנדרטיות לזיהוי נוגדנים, הוא שהיא אינה תלויה באנטיגן ספציפי ומאפשרת להבחין בין נוגדנים מעוררים לנוגדנים חוסמים.
הדגמת הפרוצדורה תתבצע בעזרת סיוע טכני מהמעבדה שלנו. כדי להתחיל בפרוצדורה, הכינו את עמודי המיני-אימונו-אדסורפציה על ידי מילוי שלושה מיליליטר של anti IgG spheros לכל שני מיליליטר של פלזמת EDTA של המטופל לתוך עמוד econopak ריק. לאחר מכן, הניחו מסנן מעל ה-anti IgG spheros.
גזרו את הקצה התחתון של העמודה ולחצו על המסנן כדי להגיע לקצב זרימה של טיפה אחת בשנייה בקירוב. לאחר מכן, שטפו את העמודה שלוש פעמים עם נפח פלזמה אחד של Sodium chloride 0.9%. פפטו את הפלזמה אל תוך העמודה; כאשר הפלזמה ספגה לחלוטין ב-anti IgG Spheros, שטפו עם אותו נפח של sodium chloride 0.9%. לאחר מכן, פפטו אל תוך העמודה נפח פלזמה אחד של glycine hydrochloride 0.2 molar ב-pH 2.8 והניחו לו להיספג בתוך הפאזה.
לאחר מכן, הוסיפו נפח נוסף של glycine hydrochloride לעמודה. אספו את הזרימה למבחנה של 15 מיליליטר וכווננו את ה-pH ל-7.3 באמצעות 0.5 molar tris hydrochloride ב-pH 8.0 כדי להגדיש מחדש את העמודה. שטפו אותה בשלושה נפחי פלסמה של glycine hydrochloride לאחר שטיפה סופית של שני נפחים של 0.9% sodium chloride.
ניתן להשתמש בעמודה עבור דגימת הפלסמה הבאה לשימוש בתאי שריר לב (cardiomyocytes). יש לדialize את פראקציית ה-IgG שנאספה כנגד בופר ניסויי, תחילה על ידי מילוי פראקציית ה-IgG לתוך צינור ממברנת דיאליזה של cellulose ester עם סף משקל מולקולרי של 100 kilodaltons. לאחר מכן, מקריאים את הצינור לתוך ליטר אחד של EB ומערבבים באיטיות באמצעות מערבל מגנטי בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר שמונה שעות, מעבירים את צינור הדיאליזה לשלושה ליטרים של EB טרי ומבצעים דיאליזה למשך 20 שעות נוספות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.
הרתח את הדגימה למשך 30 דקות בטמפרטורה של 57 °C במקלח מים. כדי לנטרל את גורמי המשלים, קבע את ריכוז ה-IgG הכולל והכן מנות (aliquots) שכל אחת מהן מכילה 330 µg IgG. בהליך זה, הכן באפר בידוד נטול סידן בהתאם למאמר המצורף.
לאחר מכן, מלאו 80 מיליליטר של IB במאגר העליון של מערכת פרפוזיה תרמוסטטית מסוג lanor, שמרו את הבאפר בטמפרטורה של 37 °C ומאווררו אותו עם 95% oxygen ו-5% carbon dioxide למשך 30 דקות. המיסו כ-7,000 עד 10,000 יחידות של collagenase type two ו-174 מיליגרם BSA נטול חומצות שומן ב-20 מיליליטר של IB המכיל 112.5 µM של calcium chloride, ובמידת הצורך, כווננו את ה-pH של באפר הבידוד במאגר העליון.
בשלב הבא, הרדימו חולדה מסוג Wistar במשקל 175 עד 200 גרם באמצעות thiopental במינון של 375 מיקרוגרם לקילוגרם, עם 2,500 IU של heparin שנוספו לתמיסת ה-thiopental. לאחר פתיחת בית החזה (thoracotomy), הוציאו בזהירות את הלב עם קשת האביקום (aortic arch) שלמה, והעבירו אותו לתוך תמיסת sodium chloride בריכוז 0.0% קרה מאוד בקרח.
לאחר מכן העבירו אותו ל-0.9% sodium chloride טרי וחשפו את האורטה. הפעילו את מפחית הזרימה של מערכת ה-langor כדי להשיג מהירות טיפות של שתיים עד שלוש בשנייה. לאחר מכן חברו את הלב לקנולה.
בצעו פרפוזיה למשך עד שלוש דקות בקצב זרימה של טיפה אחת לשנייה כדי לשטוף את שאריות הדם. לאחר מכן, העבירו את ה-IB במערכת ה-LOR. כעת הוציאו 20 milliliters של בופר מהמאגר העליון.
מלאו את המאגר בתמיסת הקולגנאז (collagenase) והוסיפו בופר בכמות הדרושה כדי להגיע ל-80 milliliters. לאחר מכן, הניעו את תמיסת העיכול למשך 27 דקות נוספות. לבסוף, נתקו את הלב מהקנולה.
הסר את העליות ואת אבי העורקים, ולאחר מכן קצץ את החדרים לחתיכות קטנות. אפשר לתמיפת העיכול לזרום למאגר התחתון. הפחת את הנפח למקסימום של 40 milliliters כדי להמשיך בעיכול של החדרים הקצוצים למשך 10 עד 15 דקות תחת אוורור רציף של 95%oxygen, 5%carbon dioxide.
לאחר מכן, סננו את תרחיף התאים דרך גזה בעלת גודל רשת של 200 micron לתוך מבחנה של 50 milliliter. לבסוף, השביתו את תכולת הסידן של התאים על ידי צנטריפוגה של תרחיף התאים ב-40 3G למשך שתי דקות. בטמפרטורת החדר, השהו שוב את התאים ב-10 milliliters.
סבב צנטריפוגה נוסף של IB המכיל 200 micromolar calcium chloride, ולאחר מכן השהה מחדש את התאים ב-10 milliliters של IB עם 500 micromolar calcium chloride. לאחר צנטריפוגה סופית, השהה את התאי הלב (cardiomyocytes) ב-EB מסונן וסטרילי לצפיפות של 50,000 תאים למילליטר.
צפו את זכוכית הכיסוי בתא בעל ארבעה בארות ב-10 micrograms למינין לבארה, והמתינו עד לייבוש מלא. לאחר מכן, מלאו מיליליטר אחד של תרחיף קרדיומיוציטים בכל בארה. בעזרת מיקרופיפט עם קצה חתוך, אפשרו לתאים להיקשר למשך שעה בטמפרטורת החדר. לדללו 10 microliters של תמיסת מלאי fira 2:00 AM בריכוז של מיליגרם אחד למיליליטר בתוך חמישה מיליליטרים של eb, ושמרו את תמיסות הצביעה בחשכה.
בשלב הבא, הסירו את הבופר ואת התאים שאינם קשורים ממעטי הכסות והעבירו בעזרת פיפט 0.5 milliliters של תמיססת הצביעה. בתוך כל באר, דגרו את התאים למשך 10 דקות תחת ניעור מתון. לאחר מכן, הסירו את תמיססת הצביעה ושטפו את התאים פעם אחת עם מיליליטר אחד של eb.
לאחר מכן, הוסיפו 0.5 milliliters של EB לכל באר בהליך זה, והניחו את זכוכית הכיסוי תחת מיקרוסקופ פלואורסצנציה הפוך המחובר למערכת להקלטת סיCם וסמיות של מיוציטים. מקמו אלקטרודה מותאמת אישית עם צינור כניסה וצינור יציאה בבאר הראשונה ושטפו את התאי השריר (cardiomyocytes) עם eb בקצב של one milliliter per minute.
התחילו את הגירוי החשמלי במתח של 20 volts, תדר של one hertz ומשך של five milliseconds לכל פולס, ואפשרו לתאים להסתגל לגירוי במשך כשתי דקות. בחרו cardiomyocyte תקין בעל צורה של מוט, עם פסיים ברורים והתכווצות קבועה, וממקמו במרכז שדה הראייה. לאחר מכן, פתחו את ערוץ המצלמה והכווינו את התא במצב אופקי בתוך שטח הווידאו על ידי סיבוב מתאם מסגור התא והזזת בסיס המיקרוסקופ.
כווננו את הגבולות של אלמנטי הבקרה לזיהוי באזור הווידאו. הפעילו את הערוץ הפלואורסצנטי והקליטו 10 עד 15 התכווצויות כדי לקבל את קיצור התא הראשוני ואת הטרנזיינט של הסידן. לאחר מכן, כבו את ערוץ התאורה של המיקרוסקופ כדי למנוע דהייה (bleaching) של הצבע הפלואורסצנטי.
העבירו את הזרימה מ-EB למעקף הדגימה באמצעות שסתום תלת-כיווני והזרמיחו (perfuse) את התאי השריר הלבבי (cardiomyocytes) עם מיליליטר אחד של IgG של המטופל. הפסיקו את פעולת המשאבה רגע לפני שהאוויר מגיע לבאר, הדליקו את ערוץ האור והקליטו 10 עד 15 התכווצויות נוספות כדי לקבל את התגובה התאית החריפה. לאחר מכן, השקיטו את ההקלטה וכבו שוב את ערוץ האור, חזרו על ההקלטות לאחר שתי וחמש דקות, והוציאו את האלקטרודה מהבאר בסיום התהליך. בסוף, נתחו את קיצור התא ואת הטרנזיאנט של הסידן באמצעות תוכנת ion wizard, תוך שימוש בחלונות edge length/length ו-URA two numeric subtracted/ratio בהתאמה.
בשלב הבא, חשבו את אחוזי השינוי עבור התגובות האקוטיות, התגובה לאחר שתי דקות והתגובה לאחר חמש דקות, ביחס לקיצור התא הראשוני ולגובה שיא הטרנזיינט של הסידן. להלן דוגמה מייצגת של מדידת הבקרה. קיצור התא והטרנזיינט של הסידן נוטרו באופן מקוון לפני הסופרופוזיה עם IgG ומיד לאחר מכן, שתי דקות וחמש דקות אחרי הסופרופוזיה עם IgG.
והנה דוגמה למדידה של דגימת IgG המכילה נוגדנים המדכאים את פעילות הלב. קיצור התא והטרנזיאנט של הסידן נמדדו בזמן אמת לפני הסופרפוזיה עם IgG, ומיד לאחר מכן שתי דקות וחמש דקות אחרי הסופרפוזיה עם IgG. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכיבו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לזהות נוגדנים המשפיעים על תפקוד הלב בפלזמה של חולים, על ידי מדידת ההשפעה של IgG מבודד על קיצור התא ובטרנזיאנט של סידן בתאי שריר לב (cardiomyocytes) מבודדים של מבוגרים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג שיטה לזיהוי נוגדנים עצמיים קרדיוטרופיים אפקטיביים ופונקציונליים בחולים עם קרדיומיופתיה מורחבת. הטכניקה מנתחת את השפעתו של אימונוגלובולין מבודד מהמטופל על התקצרות תאית ועל תנודות סידן תוך-תאיים בקרדיומיוציטים מבודדים של חולדה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- קרדיולוגיה
- אימונולוגיה
- ביולוגיה של התא
רקע
- קרדיומיופתיה מורחבת קשורה לתגובות אוטואימוניות.
- גילוי נוגדנים קרדיוטרופיים הוא חיוני להבנת מחלות לב.
- שיטות קיימות מסתמכות לרוב על אנטיגנים ספציפיים.
- קיים צורך בטכניקות המסוגלות להבחין בין נוגדנים מעוררים לנוגדנים חוסמים.
מטרת המחקר
- לזיהוי נוגדנים קרדיוטרופיים בפלזמה של מטופלים.
- להערכת ההשפעות של IgG של המטופל על התכווצות תאי שריר הלב (cardiomyocytes).
- לספק שיטה שאינה תלויה באנטיגנים ספציפיים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- מיני-אימונו-אבסורפציה של פלזמה מחולית על עמודי spheros נגד IgG.
- בידוד של קרדיומיוציטים ונטריקולריים מחולדות Wistar בוגרות.
- צביעה של קרדיומיוציטים לצפייה בתנודות סידן תוך-תאיות.
- הערכת ההשפעה של IgG מהחולה על כושר הכיווץ של הקרדיומיוציטים.
תוצאות עיקריות
- שינויים ביכולת הכיווץ ובטרנסיאנטים של סידן מעידים על נוכחותם של נוגדנים טרופיים.
- השיטה מבדילה בהצלחה בין סוגים שונים של נוגדנים.
- התוצאות מדגימות את יעילות הטכניקה בהשוואה לבדיקות אימונו-סבסטיות סטנדרטיות.
- הממצאים תורמים להבנת המנגנונים האוטו-אימוניים במחלות לב.
מסקנות
- השיטה המוצגת היא גישה מהימנה לזיהוי נוגדנים קרדיוטרופיים.
- היא משפרת את היכולת לחקור תגובות אוטואימוניות בקרדיומיופתיה מורחבת.
- טכניקה זו עשויה לשפר את יכולות האבחון בקרדיולוגיה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו מאפשרת למחקר ופיתוח בביופארמה לזהות נוגדנים קרדיוטרופיים פעילים תפקודית בפלזמה של חולים ללא צורך בזיהוי מוקדם של האנטיגן, ובכך היא נותנת מענה לפער מרכזי במחקר של מחלות לב אוטואימוניות. באמצעות מדידת ההשפעות על התכווצות קרדיומיוציטים ועל מעברים של סידן, היא מספקת קריאה תפקודית המבדילה בין נוגדנים אוטואנטיגניים מעוררים לאלו החוסמים, ובכך תומכת בהפחתת סיכונים של מטרות בשלבי גילוי מוקדמים. הגישה שאינה תלויה באנטיגן מגבירה את הביטחון החזוי לאסטרטגיות של התערבות טיפולית בקרדיומיופתיה מורחבת ובהתוויות קשורות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקה של היפותזות טיפוליות באמצעות זיהוי נוגדנים עצמיים המודולטים באופן ישיר את תפקוד התאיים השריריים של הלב (cardiomyocytes).
- ערך תפעולי: מספק מערכת בדיקה תפקודית שאינה תלויה באנטיגנים ידועים, ובכך מרחיב את מרחב המטרות עבור קרדיולוגיה אוטו-אימונית.
- ערך ניבוי: מבדיל בין השפעות של נוגדנים מעוררים לנוגדנים חוסמים, ובכך משפר את רמת הביטחון בבחירת מטרות המבוססת על מנגנון פעולה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: מייצרת קריאות כמותיות בזמן אמת של התקצרות תאים וטרנזיאנטים של סידן לצורך סריקת תרכובות או נוגדנים.
- שחזוריות: פרוטוקולים סטנדרטיים של בידוד וצביעה תומכים בתגובות תאיות עקביות בין ניסויים שונים.
- תועלת הפלטפורמה: מבססת ביו-אסיי (bioassay) רב-פעמי להערכת מועמדים לאימונומודולציה במודלים של מחלות קרדיווסקולריות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: שימוש בתאי שריר לב (cardiomyocytes) של חולדה בוגרת בעלי הומולוגיה גבוהה לחלבוני לב אנושיים, דבר המשפר את הפוטנציאל התרגומי.
- הפחתת סיכונים מכניסטיים: קשירת נוכחות נוגדנים עצמיים לתוצאות תאיות תפקודיות, התומכת בהסקה סיבתית במודלים של מחלות.
- המשכיות פרה-קלינית: מאפשר הערכה לאורכית של השפעת נוגדנים על כושר התכווצות וטיפול בסידן במערכת הרלוונטית למחלה.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד לזיהוי מולקולת מובילה (lead), ומספקת תובנות אימונולוגיות פונקציונליות המכוונות את בחירת המועמדים הפרה-קליניים במחקר של מחלות אוטואימוניות קרדיו-וסקולריות.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות על ידי קישור של IgG מהחולה לשינויים מדידים בפיזיולוגיה של קרדיומיוציטים.
- סריקה: מספקת מדידות כמותיות בזמן אמת של התכווצות וזרימת סידן להערכת השפעות אימונומודולטוריות.
- אנליטיקה: מאפשרת השוואה סטטיסטית של תגובות חריפות ותלויות-זמן לסופרפוזיה של IgG, ובכך תומכת באפיון קינטי ובקשר בין מינון לתגובה.
- מחקר טרנסלציונלי: עושה שימוש במערכת תאית רלוונטית למחלה עם הומולוגיה של אנטיגנים בין מינים, מה שמקל על אקסטרפולציה לפתופיזיולוגיה אנושית.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה סטנדרטית לסריקת תרכובות אימונומודולטוריות או תכשירים ביולוגיים בהקשרים של מחלות אוטואימוניות קרדיווסקולריות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מספק תובנה מכניסטית לגבי תפקוד לקוי של קרדיומיוציטים המתווך על ידי נוגדנים עצמיים, ובכך מפחית עמימות בתיקוף המטרה.
- ערך תפעולי: מספק מדדי תפקוד סטנדרטיים וניתנים לשחזור הממזערים את השונות במבחנים בין מעבדות שונות.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go) על ידי זיהוי מוקדם של נוגדנים עצמיים פעילים תפקודית, ובכך מפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים של תוכניות לבביות-כליות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של מטרות מבוסס רמת סיכון, בהסתמך על השפעות תפקודיות המתווכות על ידי נוגדנים במערכת הרלוונטית למחלה.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בבידוד קרדיומיוציטים, בדימות סידן ובמערכות לניטור כיווצות.
- תלוי בציוד פרפוזיה מסוג Langendorff, במיקרוסקופיה פלואורסצנטית ובתוכנה לניתוח המבוססת על ion/wizard.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית עבור טהרת IgG, הכנת תאים ופרוטוקולי גרייה.
- התאמה למערכות מודל אחרות עשויה לדרוש תיקוף של הומולוגיה של אנטיגנים ותגובתיות תאית.
- מגבלות מעשיות כוללות גישה לרקמות, חלונות חיוניות של תאים והצורך בתשתית ייעודית לפרפוזיה ולדימות.
שאלות נפוצות בנושא ביו-פרמה
Chapters in this video
0:05
Title
1:51
IgG Isolation from Patient Samples
4:39
Isolation of Rat Cardiomyocytes
8:27
Fura-2 Staining of Cardiomyocytes
9:43
Recording of Cell Shortening and Ca2+ Transients
12:24
Results: The Measurement of an IgG Sample Containing Cardiodepressive Antibodies
13:15
Conclusion
