מדידה של אפקטי נוגדנים על תפקוד תאי של cardiomyocytes המבודד

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לזהות את הנוגדנים הלב-טרופיים בפלזמה של חולים עם קרדיומיופתיה מורחבת או מחלות לב אחרות עם רקע אוטואימוני. זה מושג על ידי ספיגה חיסונית מיני ראשונית של פלזמת המטופל על עמודות אנטי IgG כדי לטהר את האימונוגלובולין G כשלב שני. קרדיומיוציטים חדריים מבודדים מחולדות וויסטאר בוגרות ומספקים את הבסיס התאי לבדיקה ביולוגית זו.

לאחר מכן, הקרדיומיוציטים מורשים להיצמד להחלקות כיסוי החדר ומוכתמים ב-URA 2:00 לפנות בוקר על מנת לאפשר התבוננות בחולף סידן תוך תאי במהלך התכווצויות, ואז נבדק ה-IgG של המטופל כדי לבחון את השפעתו על התכווצות הקרדיומיוציטים. התוצאות מדגימות אם ה-IgG של המטופל מכיל נוגדנים טרופיים המבוססים על השינויים בהתכווצות ובסידן החולף בקרדיומיוציטים המבודדים. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו בדיקות אימונולוגיות סטנדרטיות לזיהוי נוגדנים הוא שהיא אינה תלויה באנטיגן ספציפי ושהיא מאפשרת להבחין בין נוגדנים מגרים וחוסמים.

הדגמת ההליך תביא לגוגל ולחוויה של סיוע טכני מהמעבדה שלנו. כדי להתחיל בהליך זה, הכן את עמודות הספיגה החיסונית המיני על ידי מילוי שלושה מיליליטר, ספרוס אנטי IgG לכל שני מיליליטר פלזמת EDTA של מטופל לעמודת אקונופק ריקה. לאחר מכן, הניחו פילטר על גבי הכדורים נגד IgG.

חותכים את הקצה התחתון של העמוד ולוחצים על המסנן כדי להגיע לקצב זרימה של כטיפה אחת לשנייה. לאחר מכן שטפו את העמודה שלוש פעמים בנפח פלזמה אחד של 0.9% נתרן כלורי פיפטה את הפלזמה בעמודה כאשר הפלזמה שקעה לחלוטין בשטיפת האנטי IgG Spheros באותו נפח של 0.9% נתרן כלורי. לאחר מכן, פיפטה נפח פלזמה אחד של 0.2 גליצין הידרוכלוריד מולרי ב-pH 2.8 בעמודה ותן לו לטבול לתוך הפוס.

לאחר מכן הוסף נפח נוסף של גליצין הידרוכלוריד לעמודה. אסוף את הזרימה בצינור של 15 מיליליטר והתאם את ה-pH ל-7.3 עם 0.5 טריס הידרוכלוריד מולארי ב-p pH 8.0 כדי לחדש את העמודה. שטפו אותו עם שלושה נפחי פלזמה של גליצין הידרוכלוריד לאחר שטיפה אחרונה עם שני נפחים של 0.9% נתרן כלורי.

העמודה עשויה לשמש לדגימת הפלזמה הבאה לשימוש על קרדיומיוציטים. יש לבצע דיאליזה של שבר ה-IgG שנאסף כנגד מאגר ניסיוני על ידי מילוי תחילה של שבר ה-IgG לצינור ממברנת דיאליזה של אסטר תאית עם חתך משקל מולקולרי ב-100 קילודלטון. לאחר מכן הכניסו את הצינור לליטר EB אחד וערבבו לאט עם ערבוב מגנטי בארבע מעלות צלזיוס לאחר שמונה שעות, העבירו את צינור הדיאליזה לשלושה ליטר EB טרי ודיאליזה למשך 20 שעות נוספות בארבע מעלות צלזיוס לאחר הדיאליזה.

מרתיחים את הדגימה במשך 30 דקות בחום של 57 מעלות צלזיוס באמבט מים. כדי לנטרל את גורמי המשלים, קבע את ריכוז ה-IgG הכולל והכן אליקוטים כאשר כל אחד מהם מכיל 330 מיקרוגרם IgG. בהליך זה, הכינו מאגר בידוד נטול סידן על פי כתב היד המצורף.

לאחר מכן מלאו 80 מיליליטר IB במאגר העליון של מערכת זילוף תרמוסטט ושמרו על המאגר ב-37 מעלות צלזיוס ואווררו אותו עם 95% חמצן, 5% פחמן דו חמצני למשך 30 דקות. ממיסים כ-7,000 עד 10,000 יחידות של קולגנאז מסוג 2 ו-174 מיליגרם BSA ללא חומצות שומן ב-20 מיליליטר. IB המכיל 112.5 סידן כלורי מיקרו-מולרי ולהתאים את ה-pH של מאגר הבידוד במאגר העליון במידת הצורך.

לאחר מכן, יש להרדים חולדת וויסטאר במשקל של 175 עד 200 גרם באמצעות תיופנטל ב-375 מיקרוגרם לק"ג עם תוספת של 2,500 יחב"ל הפרין לתמיסת התיאופנטל. לאחר כריתת בית החזה, כרתו את הלב בזהירות עם קשת אבי העורקים השלמה והעבירו אותו לנתרן כלורי קר כקרח, אפס אחוז נתרן כלורי בנתרן כלורי קר כקרח. הסר את הדם והרקמות שמסביב מהלב.

לאחר מכן העבירו אותו ל-0.9% נתרן כלורי טרי וחשפו את אבי העורקים. הפעל את מפחית הזרימה של מערכת הלנגור כדי לקבל מהירות ירידה של שתיים עד שלוש בשנייה. ואז חבר את הלב לצינורית.

החדרו אותו עד שלוש דקות בקצב זרימה של טיפה אחת לשנייה כדי לשטוף את הדם שנותר. לאחר מכן, הפיצו את ה-IB במערכת LOR. כעת הסר מאגר של 20 מיליליטר מהמאגר העליון.

מלאו את המאגר בתמיסת הקולגנאז ומלאו מחדש את המאגר הנדרש כדי להגיע ל-80 מיליליטר. לאחר מכן הפיצו את תמיסת העיכול למשך 27 דקות נוספות. לאחר מכן, נתק את הלב מהצינורית.

הסר את הפרוזדורים ואת אבי העורקים, ואז קוצץ את החדרים לחתיכות קטנות. אפשר למאגר העיכול לרוץ למאגר התחתון. צמצם את הנפח למקסימום של 40 מיליליטר כדי לעכל עוד יותר את החדרים הקצוצים למשך 10 עד 15 דקות תחת אוורור רציף עם 95% חמצן, 5% פחמן דו חמצני.

לאחר מכן, סנן את תרחיף התא דרך גזה בגודל רשת של 200 מיקרון לתוך צינור של 50 מיליליטר. לבסוף, שחזר את תכולת הסידן של התאים על ידי צנטריפוגה של תרחיף התאים ב-40 3G למשך שתי דקות. בטמפרטורת החדר, השעו מחדש את התאים ב -10 מיליליטר.

IB המכיל שוב 200 צנטריפוגה מיקרו-מולרית של סידן כלורי ומשעה תאים ב-10 מיליליטר. IB עם 500 מיקרו-מולרי סידן כלורי. לאחר צנטריפוגה אחרונה, החייאה, השעו את הקרדיומיוציטים ב-EB מסונן סטרילי לצפיפות של 50,000 תאים למיליליטר.

מצפים את כוסות הכיסוי בתא ארבע בארות עם 10 מיקרוגרם למינין לבאר, ומחכים עד לייבוש מלא. לאחר מכן מלאו מיליליטר אחד של תרחיף הקרדיומיוציטים לכל באר. בעזרת מיקרו פיפטה עם קצה חתוך ואפשר לתאים להיצמד למשך שעה בטמפרטורת החדר, לדלל 10 מיקרוליטר של מיליגרם אחד למיליליטר פירה 2:00 AM תמיסת מלאי בחמישה מיליליטר, eb, ולשמור על תמיסת הצביעה בחושך.

לאחר מכן, הסר את המאגר ואת התאים הלא מחוברים מפיפטת משקפי הכיסוי 0.5 מיליליטר מתמיסת הצביעה. בכל אחד מהם, דגרו היטב את התאים למשך 10 דקות תחת טלטול מתון. לאחר מכן, הסר את תמיסת הצביעה ושטוף את התאים פעם אחת עם מיליליטר eb אחד.

לאחר מכן הוסף 0.5 מיליליטר EB לכל באר בהליך זה, הנח את זכוכית הכיסוי מתחת למיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך המחובר למערכת הקלטת סידן והתכווצות מיוציטים. מקם אלקטרודה בהתאמה אישית עם צינור זרם וזרם בבאר הראשונה ובסופר. התיך את הקרדיומיוציטים עם מיליליטר אחד לדקה eb.

התחילו את הגירוי החשמלי ב-20 וולט, הרץ אחד וחמש אלפיות השנייה לכל פולס, ואפשרו לתאים להסתגל לגירוי למשך כשתי דקות. בחר קרדיומיוציט שלם בצורת מוט עם פסים ברורים והתכווצות מתמדת ומקם אותו במרכז שדה הראייה. לאחר מכן פתח את ערוץ המצלמה וכוון את התא אופקית בתוך אזור הווידאו על ידי סיבוב מתאם מסגור התא והזזת שלב המיקרוסקופ.

התאם את גבול רכיבי הבקרה המזהים של אזור הווידאו. הפעל את התעלה הפלואורסצנטית ורשום 10 עד 15 התכווצויות כדי להשיג את קיצור התא הראשוני ואת חולף הסידן. לאחר מכן, כבה את תעלת האור של המיקרוסקופ כדי למנוע הלבנה של הכתם הפלורסנט.

העבירו את הזרימה מ-EB למעקף הדגימה עם שסתום תלת-כיווני והיכו את הקרדיומיוציטים עם מיליליטר אחד של IgG של המטופל. עצור את המשאבה רגע לפני שהאוויר מגיע, הפעל היטב את תעלת האור ורשום עוד 10 עד 15 התכווצויות כדי להשיג את תגובת התא החריפה. לאחר מכן השהה את ההקלטה וכבה שוב את ערוץ האור, חזור על ההקלטות לאחר שתיים וחמש דקות והוצא את האלקטרודה מהבאר בסיום הסוף, נתח את קיצור התאים ואת חולף הסידן באמצעות תוכנת אשף היונים באמצעות אורך הקו הנטוי באורך הקצה וחלון יחס הלוכסן החסר המספרי URA בהתאמה.

לאחר מכן, חשב את אחוז השינויים עבור התגובות האקוטיות, שתי הדקות וחמש הדקות מקיצור התא הראשוני וגובה השיא החולף של הסידן. להלן דוגמה מייצגת למדידת הבקרה. קיצור תאים וסידן חולף נוטרו באופן מקוון לפני הסופר-איפוזיה עם IgG ומיד שתי דקות וחמש דקות לאחר הסופר-איפוי עם IgG.

והנה דוגמה למדידת דגימת IgG המכילה נוגדנים לדיכאון לבבי. קיצור תאים וסידן חולף נמדדו באופן מקוון לפני הסופר-איחוי עם IgG ומיד שתי דקות וחמש דקות לאחר הסופר-איחוי עם IgG. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לזהות נוגדנים לתנועת לב בפלזמה של המטופל על ידי מדידת ההשפעה של IgG מבודד על קיצור תאים בחולף סידן של קרדיומיוציטים אדומים בוגרים מבודדים.