בחינה של בחירה חיובית ושלילית הרתי ידי זרימת cytometry

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לבחון את התפתחותך בעכברים על ידי ציטומטריית זרימה. זה מושג על ידי הכנת תרחיפי תאים בודדים מהעכבר, התימוס והטחול. כשלב שני, התימוציטים והציטים מוכתמים בקוקטייל של נוגדנים לזיהוי אוכלוסיות ספציפיות שלך.

בסופו של דבר, ניתן להעריך את התדירות והמספר של אוכלוסיות לימפוציטים שונות על ידי ניתוח זרימה ציטומטרי. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בהתפתחות תאי T, כגון אילו גנים ומסלולים חשובים ליצירת רפרטואר תאי T פונקציונלי אך סובלני לתאים. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי התפתחות תאי T בתימוס, ניתן ליישם אותה גם בבחינת התפתחות של תאים חיסוניים אחרים.

בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו בתכנון קוקטיילי הנוגדנים שלהם לזרימה ציטומטרית. לפני תחילת הניתוח, הנח מסך רשת פלדה סטרילי לתוך צלחת פטרי בגודל 60 על 15 מילימטר. לאחר מכן הוסיפו חמישה מיליליטר HBSS לתבשיל ואחסנו את המנה על קרח כדי לקצור את התימוס.

ראשית, השתמש בזוג מלקחיים כדי להרים את הקצה התחתון של עצם החזה ולחשוף את הסרעפת. לאחר מכן, הימנעו מהכבד, חתכו את הסרעפת כדי לנתק את כלוב הצלעות ולאחר מכן חתכו את כלוב הצלעות בכיוון כלפי מעלה מכל צד. הקפדה על הימנעות מהריאות והלב.

כעת השתמש במלקחיים כדי למשוך בעדינות את כלוב הצלעות לאחור. בלוטת התימוס היא איבר לבן בעל אונות דו-אונות הממוקם מעל הלב. השתמש בקצה השטוח של המלקחיים כדי לתפוס את תחתית האונות.

לאחר מכן משוך בעדינות את בלוטת התימוס החוצה והנח אותו על אחד ממסכי הרשת שהוכנו קודם לכן. כדי לקצור את הטחול, בצע חתך דרך הצפק כדי לחשוף את חלל הבטן. הטחול הוא איבר אדום בצורת גלשן הממוקם בצד שמאל של חלל הבטן של העכבר מתחת לכבד.

לאחר מכן השתמש בזוג מלקחיים אחד כדי לשלוף את הטחול ובאחר כדי להקניט את רקמת החיבור. לאחר מכן הניחו את הטחול המנותח על רשת נפרדת. כעת השתמש בבוכנה ממזרק של שלושה מיליליטר כדי לטחון כל איבר למסך הרשת שלו עד שיישארו רק רקמת חיבור ושומן, פיפטה את התאים ו-HBSS לצינור חרוטי של 15 מיליליטר.

לאחר מכן שטפו כל רשת עם HBS S3 טרי פעמים. לאחר מכן, גלולה את התאים במשך חמש דקות בטמפרטורה של 335 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס. לאחר שאיבת ה-supernatant resus, השעו את הציטים ב-500 מיקרוליטר של מאגר ליזיס CK למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בזמן שתאי הדם האדומים של הטחול עוברים Resus.

השעו את התימוציטים ב-20 כפול 10 לששת התאים למיליליטר במאגר הפקס, והניחו אותם בצד על קרח. כעת הוסיפו חמישה מיליליטר של HBSS כדי להחזיר את הציטים לאיזוטוניות לאחר סיבוב התאים שוב, השעו את הגלולה החופשית של RBC ב-20 כפול 10 לתאים השישיים למיליליטר במאגר הפקס. התחל את השלב הזה על ידי עלי ווטינג.

ארבע פעמים 10 עד השישית של התימוציטים השמורים לדגימת ציטומטריית זרימה לכל באר של צלחת 96 בארות. לאחר מכן, הוסף ציטים לבארות של לוח 96 בארות לבקרות פיצוי. לאחר מכן חסמו את קולטני ה-FC בכל אחת מדגימות התא על ידי דגירה עם אנטי CD 1632 למשך 10 דקות על קרח.

כעת סובב את הצלחת ואז פיזר את הנוזל מהבארות על ידי הזזת הצלחת פעם אחת עם הפנים כלפי מטה לכיור, ואז השהה כל באר ב-200 מיקרוליטר של מאגר פקס וחזור על הכביסה. לאחר מכן, דגרו את דגימות הניסוי עם 200 מיקרוליטר של קוקטייל נוגדנים או נוגדנים מצומדים בודדים של פלואורוכרום עבור בקרות הפיצוי. הכל במאגר פקס על קרח בחושך.

לאחר 30 דקות, שטפו את התאים פעמיים עם מאגר פקס ולאחר מכן לאחר השעיית התאים במאגר פקס העבירו את הדגימות לצינורות פקס במודלים טרנסגניים פיזיולוגיים TCR ועכברים מסוג בר. ברירה חיובית מתחילה בשלב הבהיר החיובי הכפול לפני המעבר לשלב המשעמם החיובי הכפול. לאחר מפגש אנטיגן עם התימוציטים החיוביים הכפולים, ואז היכנס ל-CD 4 חיובי ל-CD שמונה שלב נמוך לפני שהוא הופך ל-CD 4.

תימוציטים חיוביים בודדים או CD שמונה תימוציטים חיוביים בודדים בוגרים תימוציטים חיוביים בודדים מאופיינים בביטוי TCR גבוה שלהם ואובדן CD 24. בעוד שפרופיל CD שמונה על CD ארבע יכול לחשוף פגמים בבחירה חיובית, בדיקת בטא TCR על ידי CD 69 או CD 5 יכולה לספק תובנה נוספת היכן נמצא הפגם. גם CD 69 וגם CD 5 מווסתים לאחר גירוי TCR עם אינטראקציות חזקות יותר המניעות ביטוי גבוה יותר של סמנים אלה.

בתרשים TCR beta על ידי CD 69 בעכבר מסוג בר, ההליכה השלילית TCR R beta low CD 69 מייצגת אוכלוסייה של תימוציטים חיוביים כפולים לפני הברירה. בעוד שההליכה החיובית של TCR בטא ביניים CD 69 מייצגת אוכלוסיית מעבר מיד לאחר מעורבות TCR ומורכבת מחיובי כפול בהיר עם כמה חיובי כפול, עמום ו-CD, ארבעה חיוביים, CD, שמונה תאים נמוכים. כאן ההליכה החיובית של TCR R בטא גבוהה CD 69 ממחישה את אוכלוסיית התאים ישירות לאחר הברירה החיובית, המורכבת מ-CD עמום כפול ארבעה חיוביים, CD שמונה נמוך ו-CD ארבעה תאים חיוביים בודדים.

לבסוף, הליכה שלילית זו של TCR בטא גבוהה CD 69 מראה אוכלוסייה בוגרת יותר של תאים המורכבת בעיקר מ-CD ארבע ו-CD שמונה תאים חיוביים בודדים. היעדר האוכלוסיות החיוביות ל-CD 69 בטא בינוני TCR R ו-TCR R בטא גבוה CD 69 עשוי להעיד על שינויי ברירה חיוביים לקויים ביחס בין CD 4 חיובי יחיד ל-CD 8. תאים חיוביים בודדים בתוך האוכלוסייה השלילית TCR בטא גבוהה CD 69 עשויים להצביע על שינויים במחויבות השושלת.

אובדן אוכלוסיות TCR בטא גבוהות CD 69 חיוביות ואוכלוסיות TCR בטא גבוהות CD 69 שליליות עשוי לשקף בעיות הישרדות לאחר בחירה חיובית. בחינת בטא TCR על ידי CD 5 היא אסטרטגיה נוספת לזיהוי אוכלוסיות לפני ואחרי ברירה חיובית. שתי האוכלוסיות הראשונות הללו מורכבות בעיקר מתימוציטים בהירים חיוביים כפולים.

האוכלוסייה הנמוכה של TCR בטא CD חמש נמוכה מייצגת תימוציטים חיוביים כפולים לפני הברירה, ואוכלוסיית הביניים של TCR בטא CD חמש מורכבת מהתאים היוזמים ברירה חיובית. ייצור לקוי של אוכלוסייה זו או קודמת מרמז על ברירה חיובית פגומה. עם זאת, האוכלוסייה הגבוהה TCR R beta ביניים CD 5 מייצגת תימוציטים בתהליך של ברירה חיובית ומורכבת בעיקר מכפול חיובי עמום ו-CD ארבע חיובי.

CD שמונה תימוציטים נמוכים. האוכלוסייה הגבוהה TCR בטא CD חמש גבוהה מורכבת בעיקר מבחירה פוסט חיובית. שינויים בתימוציטים חיוביים בודדים ביחס בין CD ארבע, חיובי יחיד ל-CD שמונה.

תאים חיוביים בודדים בתוך אוכלוסייה זו, למרות אוכלוסיות קודמות נורמליות, עשויים להצביע על שינויים במחויבות השושלת. יתר על כן, היעדר אוכלוסייה זו עשוי להצביע על ירידה בהישרדות של תימוציטים בעקבות ברירה חיובית שכן ברירה שלילית כרוכה במחיקה של אוכלוסיות ספציפיות לאנטיגן קטן. פגמים בתהליך זה נצפים בצורה הטובה ביותר באמצעות עכברים טרנסגניים TCR ב-HY CD ניתן לזהות ארבעה עכברים המבטאים את ה-H-Y-T-C-R הטרנסגני עם הנוגדן החד-שבטי T 3.7.

ה-H-Y-T-C-R מזהה את אנטיגן ה-HY הספציפי לזכר המוצג ב-MHC Class one db. לפיכך, ארבעה עכברים זכרים עוברים ברירה שלילית של תימוציטים חיוביים ל-H-Y-T-C-R כפי שמצוין על ידי ירידה ב-T שלוש נקודות 70 חיוביים כפולים חיוביים במספרי התימוציטים החיוביים, וירידה דרמטית יותר ב-T 3.7 CD חיובי שמונה, מספר הציטים החיוביים היחידים. לעומת זאת, HY CD ארבע עכברות נקבות עוברות ברירה חיובית כדי לייצר CD חיובי T 3.7 שמונה תאי T חיוביים בודדים.

בעוד שהפחתה במספרי thy חיוביים כפולים מעידה על ברירה שלילית, היעדר תימוציטים חיוביים בודדים ספציפיים לאנטיגן הוא המדד המדויק ביותר. בדיקה נוספת של מעט T שלוש נקודות 70 CD חיובי שמונה תימוציטים חיוביים בודדים ב-HY CD ארבעה עכברים זכרים מגלה שרובם הם תאים לא בשלים גבוהים CD 24. בעוד שרוב ה-T שלוש נקודות 70 חיובי CD שמונה תימוציטים חיוביים בודדים ב-HY CD ארבע נקבות הגיעו לבגרות והם נמוכים CD 24, מה שמספק תמיכה נוספת, הברירה השלילית מתרחשת ב-HY CD ארבעה עכברים זכרים.

אזהרה אחת של המודלים הטרנסגניים של TCR היא שקשה לאפיין עוד יותר את הברירה החיובית על ידי זיהוי אוכלוסיות המבוססות על ביטוי TCR ו-CD 69 או CD 5 עקב ביטוי TCR גבוה לאורך התפתחות ה-CYTE שלך, ל-HY CD ארבע עכברים נקבות יש אוכלוסייה גדולה של T שלוש נקודות 70 תימוציטים חיוביים כפולים חיוביים שעוברים ברירה חיובית. כפי שמצוין על ידי עלייה באוכלוסייה החיובית CD 69 בהשוואה לסוג בר, ברירה שלילית כרוכה בגירוי TCR גבוה יותר מאשר ברירה חיובית. זה מסומן על ידי ביטוי גבוה יותר של CD 69 על T שלוש נקודות 70 תימוציטים חיוביים כפולים חיוביים ב-HY CD ארבעה עכברים זכרים וכתוצאה מכך הסטה של שיא ההיסטוגרמה ימינה.

מגמות דומות נראות עם ביטוי CD five בעת ניתוח ברירה תימית בעכברים שעברו מניפולציה גנטית. בחינת ביטוי CD 69 או CD 5 יכולה לקבוע אם הפגם נעוץ באיתות TCR או תוצאה במורד הזרם של גירוי TCR. לאחר השליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שעתיים וחצי להכנת תאים וצביעה, בתוספת שעה נוספת לאיסוף נתונים על ציטומטר הזרימה.

אם מבוצע כהלכה, כל עכבר נוסף יוסיף כ-30 דקות. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לטפל בתימוציטים בעדינות ולוודא שתכננת את אסטרטגיית הצביעה מראש. בצע הליך זה.

ניתן לבצע בדיקות אחרות כגון בדיקות הרג או בדיקות ייצור ציטוקינים על מנת לענות על שאלות נוספות כמו האם התימוציטים המיוצאים מתפקדים כראוי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לנתח את התפתחות אתר התימוס באמצעות ציטומטריית זרימה.