Name: בידוד, זיהוי, וטיהור של תאי Murine הרתי אפיתל (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: למדו לבודד ולטהר תאי אפיתל תימוס ממקור מורי באמצעות עיכול אנזימטי, ציטומטריית זרימה ומיון תאים פלואורסצנטי. שיטה זו מאפשרת חקר פיתוח תאי T ותפקוד התימוס ביולוגיה של התא והאימונולוגיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות גרנט R01 AI088209 (לקה). אנו מודים גם לאוניברסיטת מינסוטה cytometry זרימת המשאבים.

במחקר זה, למבוגרים - הנשי (6 8 שבועות) C57Bl / 6 עכברים היו בשימוש. עכברים שנרכשו מהמכון הלאומי לסרטן וקיומם תחת תנאי הפתוגן ללא ספציפיים. אוניברסיטת ועדת בעלי החיים המוסדית מינסוטה טיפול ושימוש (IACUC) אישרה את כל הניסויים בבעלי החיים. .1 הכנת מכשירים והחוצצים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון אנזים (בינוני RPMI1640 עם 0.05% [w / v] של Liberase TH ו100 U / ml של DNase I), חיץ אלבומין העשיר (1X PBS [Ca 2 + / 2 + -חינם Mg] עם 0.5% בסרום שור אלבומין ו2 חומצת Ethylenediamine Tetraacetic מ&quot;מ [EDTA]), חיץ FACS (1X PBS [Ca 2 + / Mg 2 + -חינם] 1% בסרום שור עוברי המכיל [FBS] ו0.02% NaN 3), FACS מיון חיץ (1X PBS [Ca 2 + / Mg 2 + -חינם] (בינוני RPMI-1640 המכיל 2% FBS), ובינוני RP10 מסופק עם 10% FBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 10 צלחות צילום פנורמי. הכן פתרון ציפוי 40 מ&quot;ל (0.01 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​Gשיבולת שועל אנטי העכברוש-IgG ב0.1 M NaHCO הצפת 3), ולהוסיף 4 מ&quot;ל של תמיסת ציפוי לכל 100 x 15 צלחת מ&quot;מ, מערבולת ולדגור על 4 CO ° / N. יוצקים את פתרון נוגדן ולשטוף את הצלחת באמצעות 5 מ&quot;ל של 1x PBS עבור 2 פעמים, מערבולת במרץ בין שטיפות. אחסן את הצלחות מוכנות ב 4 ° C.. </li></ol> .2 קציר של רקמות קורנית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכבר בתא CO 2. שים את החיה על גבה על מחצלת לנתיחה, להצמיד את הרגליים על המזרן ולהרטיב את הפרווה על ידי ריסוס עם אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך קו האמצע דרך העור, החל מלמעלה פתיחת השופכה ישר עד הלסת התחתונה עם מספריים ולהאריך את החתך כלפי מטה עד הברכיים בשני הצדדים. החתך נראה כמו במהופך &quot;Y&quot;. משוך את העור הרפוי לאחור בצדדים, ולהצמיד אותו למזרן לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנקב את הסרעפת מxiphoid, לחתוך את הצלעות בכל צד עד כ עצם הבריח, ואז להרים את הצלעות עםמלקחיים ולהצמיד אותו למזרן לנתיחה. התימוס הוא בדיוק מתחת לצלעות, ונראה כמו שתי אונות הלבנות דקות שמעל הלב (איור 1). רקמת חיבור נתק המקיף את בלוטת התימוס, משוך בעדינות ולהסיר את זוג אונות התימוס עם מלקחיים משוננים מעוקלים. אונות התימוס מקום לצלחת 6 היטב המכילה 5 מ&quot;ל RPMI-1640. </li></ol> .3 הכנת התאים הרתי סטרומה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתוך את כל רקמת שומן וחיבור המקיפה ולהעביר את אונות התימוס לבאר חדשה של צלחת 6 היטב המכילה 5 מ&quot;ל טרי להכין פתרון אנזים. לעשות חתכים קטנים באונות התימוס עם מספריים עדינים, ודגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות פיפטה לעכל רקמה עד התימוס וירידה של 2 - 3 פעמים באמצעות 5 פיפטה מ&quot;ל לניתוק רקמות. לאסוף חלק supernatant בצינור 50 מ&quot;ל מכיל 10 מ&quot;ל חיץ אלבומין העשיר קר לנטרל אנזימים. שמור את צינור האיסוף על קרח. הוסף 2.5פתרון מ&quot;ל אנזים לרקמות שנותרו ודגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע תסיסה מכאנית עדינה עם מזרק 3 מ&quot;ל ומחט 18 G כדי לשבור את אגרגטים. supernatant בריכה לצינור האיסוף. הוסף פתרון 2.5 מ&quot;ל אנזים לרקמות שנותרו ודגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על תסיסה מכאנית עדינה עם מזרק 3 מ&quot;ל ו25 מחט G, ודגירה את הצלחת נוספת 5 - 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר עיכול מלא, בריכת supernatant לתוך צינור האיסוף. צנטריפוגה צינור האיסוף ב XG 400, 4 מעלות צלזיוס למשך 8 דקות כדי לאסוף את התאים. לשאוב את הנוזל ולהשעות את תאי pelleted ב10 מ&quot;ל חיץ אלבומין העשיר ולסנן את המדגם באמצעות 100 רשת מ&quot;מ. ספירת תאים באמצעות hemocytometer. ואז לבצע ניתוח תזרים cytometic (סעיף 4) או העשרת Tecs (סעיף 5). </li></ol> .4 זיהוי של Tecs על ידי cytometry הזרימה </p&gt; <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תאים לריכוז סופי של 4 x 10 6 תאים במאגר FACS 100 μl מכתים בצלחת מבחן גם מסביב לתחתית 96 ולשמור את הצלחת על קרח. הוסף 20 μl פתרון לחסום Fc (אנטי CD16-/ נוגדן CD32 ב10 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​במאגר FACS) לתאי דגירה התאים ל10 דקות על קרח. ספין הצלחת ב XG 400, 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות. בטל נוזל מבארות על ידי מצליף את פני הצלחת לתוך כיור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות את תאי pelleted ב100 קוקטייל נוגדני μl (אנטי CD45, -EpCAM, כיתת -MHC השנייה, ו-Ly51 נוגדנים, וקטיני UEA-1 שכותרתו עם fluorochromes שונה ביצרן מומלץ או נבדקים ריכוזים אופטימליים של כל נוגדן במאגר FACS ), ודגירת התאים על קרח ל20 דקות בחושך. לפיצוי, להכתים 1 x 10 6 תאים עם כל fluorochrome הבודד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספה של חיץ FACS 100 μl היטב כל אחד ולסובב את הצלחת ב XG 400, 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות. חזור על צעד אחד לשטוףזמן, ולאחר מכן resuspend תאי חיץ FACS 100 μl. להעביר את תאי צינור FACS מסביב לתחתית 12 x 15 מ&quot;מ מלא ב300 μl FACS חיץ. לרכוש דגימות על cytometer זרימה ולנתח נתונים באמצעות תוכנת ניתוח FACS. אסטרטגית gating TEC מוצגת באיור 2. </li></ol> .5 העשרה של Tecs על ידי צילום פנורמי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה תאי התימוס (שהוכנו בסעיף 3) ב XG 400, 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. לשאוב את הנוזל ולהשעות את תאי pelleted במאגר מיון FACS בריכוז של 2 x 10 8 תאים לכל מ&quot;ל בצינור חרוטי 15 מ&quot;ל או 50 מ&quot;ל. הוסף נוגדן אנטי CD90.2 (Clone 30-H12) (או אנטי CD45) בריכוז סופי של 2.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​של השעיה תא דגירה תאים בעדינות על מיקסר מסתובב על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר הדגירה, לשטוף עם 5 - 10x נפח בינוני RP10 וצנטריפוגות הצינור ב XG 400, 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את הנוזל וresuspend תאי pelleted בבינוני RP10 בריכוז של 1 x 10 7 לכל מ&quot;ל. הוסף השעיה תא 5 מ&quot;ל לכל צלחת מצופה צילום פנורמי (מוכנה בשלב 1.3), מערבולת ולדגור ל30 דקות ב RT. מערבולת במרץ; להעביר את supernatants לתוך צינור חרוטי. יש לשטוף את הצלחת שתי פעמים באמצעות מדיום RP10 וברכת supernatants לתוך צינור האיסוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צינור האיסוף ב XG 400, 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. לשאוב את הנוזל וresuspend תאי pelleted במדיום RP10 5 מ&quot;ל. מוסיף את ההשעיה התא לצלחת צילום פנורמי חדשה, מערבולת ולדגור ל30 דקות ב RT. לאסוף את התאים לשטוף את הצלחת וברכה אותם לתוך צינור חרוטי. ברגע שTecs מועשרים, ספין למטה התאים ב XG 400, 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ולהשעות תאי 5 FACS מ&quot;ל מיון חיץ. </li></ol> .6 טיהור Tecs על ידי מיון תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים באמצעות hemocytometer ולהכין השעיה תא בריכוז של 4 x 10 7 תאי חיץ מיון FACS. הוספת נוגדני described בסעיף 4.4 לפתרון תא דגירה תאים בעדינות על מיקסר מסתובב על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. בעקבות צביעה, לשטוף ולהשעות תאים לריכוז של 10 x 10 6 תאים לכל מ&quot;ל של חיץ מיון FACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיין תת TEC דרך נחיר 100 מיקרומטר באמצעות מיון תא הקרינה הופעלה. תא ממוין נאספים ב30% (v / v) FBS בRPMI-1640). ברגע שמיון תא נעשה, תאי צנטריפוגות ב XG 400, 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ולהתכונן לניתוח במורד הזרם. </li></ol>

<ol><li>Rothenberg, E. V., Moore, J. E., Yui, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Launching+the+T-cell-lineage+developmental+programme%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Launching the T-cell-lineage developmental programme.</a> Nat. Rev. Immunol. 8, 9-21 (2008).</li>
<li>Anderson, G., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymic+epithelial+cells%3A+working+class+heroes+for+T+cell+development+and+repertoire+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymic epithelial cells: working class heroes for T cell development and repertoire selection.</a> Trends Immunol. 33, 256-263 (2012).</li>
<li>Klein, L., Hinterberger, M., Wirnsberger, G., Kyewski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+presentation+in+the+thymus+for+positive+selection+and+central+tolerance+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antigen presentation in the thymus for positive selection and central tolerance induction.</a> Nat. Rev. Immunol. 9, 833-844 (2009).</li>
<li>Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+and+negative+selection+of+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Positive and negative selection of T cells.</a> Annu. Rev. Immunol. 21, 139-176 (2003).</li>
<li>Takahama, Y., Takada, K., Murata, S., Tanaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta5t-containing+thymoproteasome%3A+specific+expression+in+thymic+cortical+epithelial+cells+and+role+in+positive+selection+of+CD8%5BTitle%5D)+AND+%22T+cells.+Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">beta5t-containing thymoproteasome: specific expression in thymic cortical epithelial cells and role in positive selection of CD8.</a> T cells. Curr. Opin. Immunol. 24, 92-98 (2012).</li>
<li>Xing, Y., Wang, X., Igarashi, H., Kawamoto, H., Sakaguchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+phosphatase+subunit+G5PR+that+regulates+the+JNK-mediated+apoptosis+signal+is+essential+for+the+survival+of+CD4+and+CD8+double-positive+thymocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Protein phosphatase subunit G5PR that regulates the JNK-mediated apoptosis signal is essential for the survival of CD4 and CD8 double-positive thymocytes.</a> Mol. Immunol. 45, 2028-2037 (2008).</li>
<li>Benoist, C., Mathis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treg+cells%2C+life+history%2C+and+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Perspect.+Biol%22%5BJournal%5D)">Treg cells, life history, and diversity.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, a007021(2012).</li>
<li>Pobezinsky, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+deletion+and+the+fate+of+autoreactive+thymocytes+that+survive+negative+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Clonal deletion and the fate of autoreactive thymocytes that survive negative selection.</a> Nat. Immunol. 13, 569-578 (2012).</li>
<li>Stritesky, G. L., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+self-reactive+T+cells+in+the+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Selection of self-reactive T cells in the thymus.</a> Annu. Rev. Immunol. 30, 95-114 (2012).</li>
<li>Xing, Y., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+tolerance%3A+central+and+peripheral%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Perspect.+Biol%22%5BJournal%5D)">T-cell tolerance: central and peripheral.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, (2012).</li>
<li>Anderson, G., Lane, P. J., Jenkinson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+intrathymic+microenvironments+to+establish+T-cell+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Generating intrathymic microenvironments to establish T-cell tolerance.</a> Nat. Rev. Immunol. 7, 954-963 (2007).</li>
<li>Xing, Y., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymoproteasome+subunit-beta5T+generates+peptide-MHC+complexes+specialized+for+positive+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Thymoproteasome subunit-beta5T generates peptide-MHC complexes specialized for positive selection.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 6979-6984 (2013).</li>
<li>Petrie, H. T., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zoned+out%3A+functional+mapping+of+stromal+signaling+microenvironments+in+the+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Zoned out: functional mapping of stromal signaling microenvironments in the thymus.</a> Annu. Rev. Immunol. 25, 649-679 (2007).</li>
<li>Rezzani, R., Bonomini, F., Rodella, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histochemical+and+molecular+overview+of+the+thymus+as+site+for+T-cells+development%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Histochemical and molecular overview of the thymus as site for T-cells development.</a> Prog. Histochem. Cytochem. 43, 73-120 (2008).</li>
<li>Rodewald, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymus+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymus organogenesis.</a> Annu. Rev. Immunol. 26, 355-388 (2008).</li>
<li>Griffith, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+mapping+of+thymic+stromal+microenvironments+reveals+unique+features+influencing+T+lymphoid+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunit%22%5BJournal%5D)">Spatial mapping of thymic stromal microenvironments reveals unique features influencing T lymphoid differentiation.</a> Immunit. 31, 999-1009 (2009).</li>
<li>Guerder, S., Viret, C., Luche, H., Ardouin, L., Malissen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+processing+of+self-antigens+by+subsets+of+thymic+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differential processing of self-antigens by subsets of thymic stromal cells.</a> Curr. Opin. Immunol. 24, 99-104 (2012).</li>
<li>Hogquist, K. A., Xing, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+CD8%2B+T+cells+need+diversity+when+growing+up%5BTitle%5D)+AND+%22Immunit%22%5BJournal%5D)">Why CD8+ T cells need diversity when growing up.</a> Immunit. 32, 5-6 (2010).</li>
<li>Jenkinson, E. J., Parnell, S., Shuttleworth, J., Owen, J. J., Anderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specialized+ability+of+thymic+epithelial+cells+to+mediate+positive+selection+does+not+require+expression+of+the+steroidogenic+enzyme+p450scc%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Specialized ability of thymic epithelial cells to mediate positive selection does not require expression of the steroidogenic enzyme p450scc.</a> J. Immunol. 163, 5781-5785 (1999).</li>
<li>Murata, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+CD8%2B+T+cell+development+by+thymus-specific+proteasomes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of CD8+ T cell development by thymus-specific proteasomes.</a> Science. 316, 1349-1353 (2007).</li>
<li>Chidgey, A. P., Pircher, H., MacDonald, H. R., Boyd, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+adult+thymic+stromal-cell+suspension+model+for+in+vitro+positive+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">An adult thymic stromal-cell suspension model for in vitro positive selection.</a> Dev. Immunol. 6, 157-170 (1998).</li>
<li>Izon, D. J., Nieland, J. D., Godfrey, D. I., Boyd, R. L., Kruisbeek, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+reveals+unexpected+shared+antigens+between+histologically+defined+populations+of+thymic+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis reveals unexpected shared antigens between histologically defined populations of thymic stromal cells.</a> Int. Immunol. 6, 31-39 (1994).</li>
<li>Jenkinson, E. J., Anderson, G., Owen, J. J. Studies on T cell maturation on defined thymic stromal cell populations in vitro. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJenkinson%2C+EJ+%22J.+Exp.+Med%22">J. Exp. Med</a>. 176, 845-853 (1992).</li>
<li>Klein, L., Klugmann, M., Nave, K. A., Tuohy, V. K., Kyewski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shaping+of+the+autoreactive+T-cell+repertoire+by+a+splice+variant+of+self+protein+expressed+in+thymic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Shaping of the autoreactive T-cell repertoire by a splice variant of self protein expressed in thymic epithelial cells.</a> Nat. Med. 6, 56-61 (2000).</li>
<li>Shortman, K., Vremec, D., D'Amico, A., Battye, F., Boyd, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nature+of+the+thymocytes+associated+with+dendritic+cells+and+macrophages+in+thymic+rosettes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Nature of the thymocytes associated with dendritic cells and macrophages in thymic rosettes.</a> Cell. Immunol. 119, 85-100 (1989).</li>
<li>Volkmann, A., Zal, T., Stockinger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen-presenting+cells+in+the+thymus+that+can+negatively+select+MHC+class+II-restricted+T+cells+recognizing+a+circulating+self+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antigen-presenting cells in the thymus that can negatively select MHC class II-restricted T cells recognizing a circulating self antigen.</a> J. Immunol. 158, 693-706 (1997).</li>
<li>Yang, S. J., Ahn, S., Park, C. S., Choi, S., Kim, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+subpopulations+of+thymic+epithelial+cells+by+flow+cytometry+using+a+new+specific+thymic+epithelial+marker%2C+Ly110%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Method%22%5BJournal%5D)">Identifying subpopulations of thymic epithelial cells by flow cytometry using a new specific thymic epithelial marker, Ly110.</a> J. Immunol. Method. 297, 265-270 (2005).</li>
<li>Gray, D. H., Chidgey, A. P., Boyd, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+thymic+stromal+cell+populations+using+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Method%22%5BJournal%5D)">Analysis of thymic stromal cell populations using flow cytometry.</a> J. Immunol. Method. 260, 15-28 (2002).</li>
<li>Gray, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+analysis%2C+enrichment+and+purification+of+thymic+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Method%22%5BJournal%5D)">Unbiased analysis, enrichment and purification of thymic stromal cells.</a> J. Immunol. Method. 329, 56-66 (2008).</li>
<li>Williams, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+analysis+of+complex+thymus+stromal+cell+populations%3A+rapid+thymic+epithelia+preparation+characterizes+radiation+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Transl.+Sci%22%5BJournal%5D)">Single cell analysis of complex thymus stromal cell populations: rapid thymic epithelia preparation characterizes radiation injury.</a> Clin. Transl. Sci. 2, 279-285 (2009).</li>
<li>Kanof, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+T+cell+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Purification of T cell subpopulations.</a> Curr. Protoc. Immunol. 7 (Unit 7.3), (2001).</li>
<li>Mage, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractionation+of+T+cells+and+B+cells+using+panning+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fractionation of T cells and B cells using panning techniques.</a> Curr. Protoc. Immunol. 3 (Unit 3.5), (1991).</li>
<li>Wekerle, H., Ketelsen, U. P., Ernst, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymic+nurse+cells.+Lymphoepithelial+cell+complexes+in+murine+thymuses%3A+morphological+and+serological+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicin%22%5BJournal%5D)">Thymic nurse cells. Lymphoepithelial cell complexes in murine thymuses: morphological and serological characterization.</a> The Journal of experimental medicin. 151, 925-944 (1980).</li>
<li>Kyewski, B. A., Kaplan, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphoepithelial+interactions+in+the+mouse+thymus%3A+phenotypic+and+kinetic+studies+on+thymic+nurse+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immuno%22%5BJournal%5D)">Lymphoepithelial interactions in the mouse thymus: phenotypic and kinetic studies on thymic nurse cells.</a> J Immuno. 128, 2287-2294 (1982).</li>
<li>Nakagawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymic+nurse+cells+provide+microenvironment+for+secondary+T+cell+receptor+alpha+rearrangement+in+cortical+thymocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Thymic nurse cells provide microenvironment for secondary T cell receptor alpha rearrangement in cortical thymocytes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 20572-20577 (2012).</li>
<li>McLelland, B. T., Gravano, D., Castillo, J., Montoy, S., Manilay, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+isolation+of+adult+thymic+epithelial+cell+subsets+for+multiparameter+flow+cytometry+and+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Method%22%5BJournal%5D)">Enhanced isolation of adult thymic epithelial cell subsets for multiparameter flow cytometry and gene expression analysis.</a> J. Immunol. Method. 367, 85-94 (2011).</li>
<li>Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purified+enzymes+improve+isolation+and+characterization+of+the+adult+thymic+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunological+method%22%5BJournal%5D)">Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium.</a> Journal of immunological method. 385, 23-34 (2012).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

בפרוטוקול, שלבים קריטיים הם ההכנה של תאי התימוס סטרומה (סעיף 3) וההעשרה של Tecs (סעיף 4). מומלץ מאוד שפתרון אנזים טרי מוכן בכל פעם, והוא התייחס אל הרקמה בהקדם האפשרי. לthymi נקווה, אופטימיזציה של הנפח של פתרון אנזים נדרש בהתאם למספר של thymi. אם כל שאריות רקמה שנשארו לאחר העיבוד, והוסיף עוד פתרון אנזים והארכת זמן דגירה יכול להגדיל את תשואת תא. במהלך העשרת Tecs, השלים אוסף של supernatant וחוזר לשטוף הצלחת שתוארה בסעיף .5.3 יקטן אובדן תא. <p class="jove_content" style=";text-ali...

בשלב מוקדם בהתפתחות תא T, אבות multipotent מח עצם גזע hematopoietic שמקורן בתאים מגויסים לקליפה של בלוטת התימוס, עובר מחויבות לשושלת T ולהיות מבשרי תא T 1. בקליפת המוח, השלילי כפול thymocytes מבשר תא T מסוג CD4 ו CD8 (DN) להרחיב ולהתמיין CD4 לא בוגר וthymocytes החיובי כפול CD8 (DP), ויצר מאגר גדול של אבות עם קולטני תא T משתנה מאוד 1. רק קבוצת משנה מוגבל-MHC נבחרת של תאי DP יהפוך החיובי יחיד thymocytes CD4 או CD8 (SP), לעבור למדולה של התימוס, ולהתמיין לתאי T בוגרים מבחינה תפקודית המוסמכים, אירוע שנקרא סלקציה חיובית כ2 6. בניגוד לכך, שיבוטים של thymocytes האוטומטי-reactive עוברים סלקציה שלילית ויוסרו באמצעות אפופטוזיס, יומרו לתאי T רגולטורים לסובלנות עצמית, או מופנים לימפוציטים intraepithelial למטרות שאינן ברורים עדיין 3,7-10. בבלוטת התימוס, תאי סטרומה הרתי ליצור microenvironment ייחודי המספק אותות לאלה גורלות פיתוח תאים השונים T 5,11,12. תאי סטרומה הרתי מורכבים מתאי אפיתל הרתי (Tecs) - כולל Tecs קליפת המוח (cTECs) וTecs הלשדי (mTECs), תאים דנדריטיים, מקרופאגים, פיברובלסטים, תאי אנדותל, pericytes המופק מרכס העצבי ותאי mesenchymal אחרים 13-15. בין אלה, Tecs הם קריטיים בשלבים השונים של פיתוח תאי T 1,2,16,17. עם זאת, חוסר דרך חזקה כדי לבודד Tecs עכב הבנה מקיפה של הפונקציות שלהם 16. בפרט, cTECs, אשר יוצר רשת תלת ממדים המקיפה את האבות בקליפת המוח, חיוני לסלקציה חיובית 13,18,19 מסיבות שאינן ברורים עדיין. מחקרים קודמים סיפקו רמזים לגבי ההטרוגניות והתפקיד של Tecs, בעיקר להסתמך על כלים מורפולוגיים והיסטולוגית 13 </sup&gt;. לאחרונה התפקידים הייחודיים של תת TEC טופלו על ידי גישות גנטיות בעכברי מודל 12,20. דרך חזקה ושחזור כדי לבודד Tecs היא יסוד להשגת אפיון משוחד של תת TEC, הערכה כמותית ואיכותית של פונקציות TEC, והבהרה של מנגנונים איך cTECs יתמוך בבחירה חיובית. בשל הנדירות של Tecs בבלוטת התימוס והאינטראקציות הדוקות הם יוצרים באיבר שלם, הבידוד של Tecs היה מאתגר. הפרוטוקול המתואר כאן מבוסס על תגליות קודמות, כיום ריאגנטים זמינים, טכניקות, ואת הידע של מבנה בלוטת התימוס והרכב סטרומה. לפני כמעט שני עשורים, כמה נהלים דווחו לdisaggregate רקמות בלוטת התימוס 21-27, שבו אנזימים שונים שמשו במהלך עיכול, כולל טריפסין, Collagenase וDispase. אפור et al. לעומת אלה אנזימים בprecedure 28, ודיווח ספיד משופרod עם עיכול מרובה צעד של קוקטיילים אנזים 29 שהפכו בשימוש נרחב 20,30. עם זאת, שיטה זו כרוכה בזמן הכנה ארוך וצעדים מורכבים עיכול ותוצאות במשתנה מספרים סלולריים ופרופורציות של Tecs הסופי אפילו באותו הדור העכברי 29,30. לפני מספר שנים, אנזים כיתה מחקר Liberase, מכיל מטוהר ביותר Collagenase ופרוטאז הניטרלי התחיל להיות בשימוש בניתוק רקמת התימוס 30. כאן, אנו מתארים פרוטוקול מבוסס עיכול Liberase, עם נהלי הפרדה מכאנית מותאמים, שמניב מספר גבוה של Tecs קיימא מרקמות בלוטת התימוס עכבר. . כדי להעשיר את תאי סטרומה ניתק, מחקרים קודמים השתמשו גם מפלי צפיפות או הפרדת חרוז מגנטית 21,29. עם זאת, שתי השיטות לגרום חמורות אבודות של אוכלוסיות מסוימות של תאי סטרומה הרתי, במיוחד האוכלוסייה של cTECs 29. חיסול ציטוטוקסיות וטכניקות צילום פנורמי <sעד&gt; 31,32 לי נרחב שימש במשך דלדול או הפרדה של לימפוציטים בתחום החיסוני 12,31. לאחר השוואה של טכניקות אלה, הקמנו את פרוטוקול צילום פנורמי הנוכחי להעשרה של Tecs. המצב העדין במהלך הליך ההעשרה מוביל למוות של תאים ופחות משוחד והתאוששות TEC מוגברת. ההשעיה תא התימוס המבודדת שתוארה בסעיף 3 יכולה להיות מיושמת ישירות לזרום ניתוח cytometric לזיהוי ואפיון של תת TEC ותאים דנדריטיים. סעיף 4 מתאר דרך פשוטה ושימושית לזיהוי תת TEC באמצעות זרימת פרמטרים מרובה cytometer. ניתן למצוא בניסויים שמבקשים להשיג cTECs מטוהר או mTECs, העשרת TEC ומיון תא הליכים בסעיף 5 ו -6.

<table><tbody><tr><td>נגד עכבר EpCAM</td><td>eBioscience</td><td>XX-5791-YY *</td> <td>Clone G8.8</td></tr><tr><td>Anti-mouse MHC II</td><td>eBioscience</td><td>XX-5321-YY *</td> <td>Clone M5 / 114.15.2</td></tr><tr><td>Anti-mouse Ly51</td><td>eBioscience</td><td>XX-5891-YY *</td> <td>Clone 6C3</td></tr><tr><td>UEA-1</td><td>Vector Laboratory</td><td>FL-1061</td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometer</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td>LSRFortessa</td><td></td></tr><tr><td>Flow ממיין תאים</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td>FACSAria</td><td></td></tr><tr><td>FACS tubes</td><td>BD Biosciences</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת ניתוח ציטומטריית זרימה</td><td>TreeStar - Flowjo</td><td>FlowJo v7/9</td><td></td></tr><tr><td>*XX משתנה לפי פלואורוכרום ו-YY משתנה לפי גודל הבקבוקון.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד, זיהוי, וטיהור של תאי murine הרתי אפיתל

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

התימוס הוא איבר חיוני להתפתחות לימפוציטים T. של תאי סטרומה הרתי, תאים הרתי אפיתל (Tecs) הם קריטיים במיוחד בשלבים שונים של התפתחות תא T: מחויבות T תא, סלקציה חיובית וסלקציה שלילית. עם זאת, הפונקציה של Tecs בבלוטת התימוס נשארה הבינה באופן חלקי. במאמר, אנו מספקים שיטה לבודד תת TEC מבלוטת התימוס עכבר טרי באמצעות שילוב של הפרעה מכאנית ועיכול אנזימטי. השיטה מאפשרת לתאי סטרומה הרתי וthymocytes להשתחרר ביעילות מתאי תאים וחיבורי מטריצת תאים תאיים וכדי ליצור השעיה תא בודד. שימוש בתאים המבודדים, cytometry זרימת פרמטרים המרובה יכול להיות מיושם על זיהוי ואפיון של Tecs ותאים דנדריטיים. בגלל Tecs הוא אוכלוסיית תאים נדירה בבלוטת התימוס, אנחנו גם לתאר דרך יעילה להעשרה ולטהר Tecs ידי כלה thymocytes, סוג התא הנפוץ ביותר בבלוטת התימוס. Folloאגף ההעשרה, זמן מיון התא יכול להיות ירידה כל כך אובדן של כדאיות תא ניתן למזער במהלך הטיהור של Tecs. תאים מטוהרים מתאימים לניתוחים במורד הזרם שונים כמו Real Time-PCR, כתם מערבי ופרופיל ביטוי גנים. הפרוטוקול יהיה לקדם את המחקר של פונקצית TEC וכמו גם את הפיתוח של במבחנה הכינון מחדש של תאי T.

שימוש בפרוטוקול זה, איבר התימוס הוסר מעכבר בוגר (סעיף 2) והשעית תא הרתי הוכן כפי שתואר בסעיף 3 ההשעיה התא שהושגה כללה thymocytes, תאי סטרומה שמקורם hematopoietic ותאי סטרומה שאינו hematopoietic. CD45 הוא הפאן סמן hematopoietic הביע בשני thymocytes ותאי סטרומה hematopoietic כגון מקרופאגים ותאים דנדריטיים. בניגוד לכך, Tecs אינו ממוצא hematopoietic ואינו מבטא CD45 15. מכתים תא וניתוח התזרים cytometric בוצעו כפי שתוארו בסעיף 4. <p class="jove_content" style=";text-align...

כאן אנו מתארים שיטה יעילה לבידוד, זיהוי, וטיהור של תאי אפיתל עכבר הרתי (Tecs). הפרוטוקול יכול להיות מנוצל ללימודים של פונקצית התימוס להתפתחות נורמלית T תא, תפקוד לקוי של בלוטת התימוס, וכינון מחדש של תאי T.

בידוד, זיהוי, וטיהור של תאי Murine הרתי אפיתל

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד, לזהות ולטהר תאי אפיתל תימיים או טכנולוגיה. זה מושג על ידי תחילה אנזימטית, עיכול ושיבוש מכני של בלוטת התימוס כדי לפרק את הטכנולוגיה לתרחיף תא בודד. לאחר מכן, ניתן לנתח את הטכנולוגיה על ידי זרימה ציטומטרית או להעשיר אותה באמצעות אסטרטגיית פאנינג.בסופו של דבר, ניתן לטהר תת-קבוצות אפיתל תימיות על ידי מיון תאים מופעל פלואורסצנטי. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח רבות בתחום התפתחות תאי T, כגון, כיצד תאי אפיתל תימי מקדמים ברירה תימית? מה גורם לתפקוד לקוי של בלוטת התימוס בבעלי חיים מזדקנים וכיצד נוכל להשיג בנייה מחדש של תאי T במבחנה?היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם התאוששות גבוהה של תאי גרמה אמיים משתנים, העשרה בלתי משוחדת של תאי האפיתל האמיים והטוהר הגבוה שניתן להשיג בסופו של דבר על ידי מיון תאים. כדי לבודד תאי סטרומה של בלוטת התימוס, זהו תחילה את בלוטת התימוס, שנמצאת ממש מתחת לצלעות ונראית כמו שתי אונות לבנות דקות מעל הלב. לאחר מכן נתקו את רקמת החיבור המקיפה את בלוטת התימוס והשתמשו במלקחיים משוננים מעוקלים כדי למשוך בעדינות ולהסיר את אונות התימוס.מניחים את האונות בצלחת שש בארות המכילה חמישה מיליליטר מדיום וחותכים את כל השומן ורקמת החיבור שמסביב. לאחר מכן העבירו את האונות הקצוצות לבאר חדשה המכילה חמישה מיליליטר של תמיסת אנזים טרייה שהוכנה והשתמשו

isolation-identification-purification-murine-thymic-epithelial

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

בידוד של לימפוציטים באמצעות MACS Miltenyi ערכת מהווה דרך אמינה לטהר תאים שלמים homogenates רקמת הלימפה. תאים מטוהרים באמצעות מערכת Miltenyi הם בדרך כלל ≥ 96% טהור. הנה, אנחנו מדגימים את הצעדים שננקטו כדי לבודד תאים מסוג CD4 + T, אחת ערכות רבים המוצעים על ידי Miltenyi.

בידוד של תאים מסוג CD4 + T מ בלוטות לימפה עכבר באמצעות טיהור Miltenyi MACS

פרוטוקול זה מפרט שיטה לבודד תאי המציגים אנטיגנים מבלוטת התימוס אנושית דרך שלבים שונים של עיכול אנזימטי של הרקמה ואחריו צנטריפוגה צפיפות של ההשעיה התא בודדת ומיון לבסוף מגנטי ו / או FACS של אוכלוסיות התאים של עניין.

בידוד של תאי מיאלואידית דנדריטים ותאי האפיתל מקורנית האדם

חקר תאי אפיתל תימיים מדולריים במבחנה לא הצליח ברובו, מכיוון שמערכות התרבית הדו-ממדיות הנוכחיות אינן מחקות את תרחיש in vivo. מערכת התרבית התלת-ממדית המתוארת כאן - מודל תרבית אורגנוטיפית של עור שונה - הוכיחה את עצמה כעדיפה בסיכום התפשטות mTEC, התמיינות ותחזוקה של ביטוי גנים מופקר.

דגם 3D Organotypic משותף תרבות תמיכה למניעת הפצת נשק מדולרי הרתי אפיתל תאים, התמיינות וביטוי גנים מופקר

דוח זה מספק תיאור מפורט של השתלת תימי עכברים מעכברים בגילאים שונים מתחת לקפסולת הכליה של מושתלי עכברים חסרי חיסון. מטרת גישה זו היא למדל התפתחות תאי T ואירועי ברירה תימית in vivo.

בידוד והשתלה של שתלי הרתי Murine בני שונים.

מאמר זה מתאר מתודולוגיה in vivo ו-in vitro לאפיון אבות התיישבות תימית על ידי ניתוח הקינטיקה של הדור, הפנוטיפ והמספרים של צאצאי תאי ה-T שלהם.

אפיון של הרתי יישוב אבות בעובר העכבר באמצעות<em&gt; In vivo</em&gt; ו<em&gt; במבחנה</em&gt; מבחני

תת-קבוצות תאים דנדריטיות נפרדות קיימות כאוכלוסיות נדירות באיברי לימפה, ולכן הן מאתגרות לבידוד במספרים ובטוהר מספיקים לניסויים אימונולוגיים. כאן אנו מתארים שיטת יעילות גבוהה ותפוקה גבוהה לבידוד של כל תת-הקבוצות העיקריות הידועות כיום של תאים דנדריטיים של טחול עכבר.

שיטת תשואה יעילה גבוהה עבור בידוד של תת תא העכבר דנדריטים

לימפוציטים הם השחקנים העיקריים בתגובות חיסוניות נרכשות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול טיהור לימפוציטים כדי לקבוע את הפונקציות הפיזיולוגיות של המולקולות הרצויות בהפעלת לימפוציטים במבחנה וב-vivo. הליכי הניסוי המתוארים מתאימים להשוואת יכולות תפקודיות בין לימפוציטים בקרה ללימפוציטים מהונדסים גנטית.

בידוד ההפעלה של Murine לימפוציטים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד mesenchyme המעי murine, כולל telocytes. אלה יכולים לשמש למספר יישומים, כגון תרבות משותפת עם עכבר או אורגנואידים שמקורם בבני אדם, כדי לתמוך בצמיחה ולשקף טוב יותר את המצב ברקמה המקורית.

בידוד של מזנכימה במעי מורין וכתוצאה מכך תשואה גבוהה של טלוציטים

מאמר זה מתאר שיטה לבידוד מבוסס חרוזים מגנטיים של תאי אנדותל מורין מנימי לימפה עוריים. תאי האנדותל הלימפטיים המבודדים יכולים לשמש לניסויים במבחנה במורד הזרם ולניתוח ביטוי חלבונים.

Murine Dermal Lymphatic Endothelial Cell Isolation

כאן אנו מציגים פרוטוקולים המאפשרים בידוד של תאי סטרומה מעצם מורין, מח עצם, בלוטת התימוס ורקמה תימית אנושית התואמת למולטיומיקה של תא יחיד.

בידוד תאי סטרומה מאיברים המטופויטיים

למדו לבודד ולטהר תאי אפיתל תימוס ממקור מורי באמצעות עיכול אנזימטי, ציטומטריית זרימה ומיון תאים פלואורסצנטי. שיטה זו מאפשרת חקר פיתוח תאי T ותפקוד התימוס ביולוגיה של התא והאימונולוגיה.

בידוד, זיהוי, וטיהור של תאי Murine הרתי אפיתל

גלה סרטונים נוספים