בידוד, זיהוי, וטיהור של תאי Murine הרתי אפיתל

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד, לזהות ולטהר תאי אפיתל תימיים או טכנולוגיה. זה מושג על ידי תחילה אנזימטית, עיכול ושיבוש מכני של בלוטת התימוס כדי לפרק את הטכנולוגיה לתרחיף תא בודד. לאחר מכן, ניתן לנתח את הטכנולוגיה על ידי זרימה ציטומטרית או להעשיר אותה באמצעות אסטרטגיית פאנינג.

בסופו של דבר, ניתן לטהר תת-קבוצות אפיתל תימיות על ידי מיון תאים מופעל פלואורסצנטי. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח רבות בתחום התפתחות תאי T, כגון, כיצד תאי אפיתל תימי מקדמים ברירה תימית? מה גורם לתפקוד לקוי של בלוטת התימוס בבעלי חיים מזדקנים וכיצד נוכל להשיג בנייה מחדש של תאי T במבחנה?

היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם התאוששות גבוהה של תאי גרמה אמיים משתנים, העשרה בלתי משוחדת של תאי האפיתל האמיים והטוהר הגבוה שניתן להשיג בסופו של דבר על ידי מיון תאים. כדי לבודד תאי סטרומה של בלוטת התימוס, זהו תחילה את בלוטת התימוס, שנמצאת ממש מתחת לצלעות ונראית כמו שתי אונות לבנות דקות מעל הלב. לאחר מכן נתקו את רקמת החיבור המקיפה את בלוטת התימוס והשתמשו במלקחיים משוננים מעוקלים כדי למשוך בעדינות ולהסיר את אונות התימוס.

מניחים את האונות בצלחת שש בארות המכילה חמישה מיליליטר מדיום וחותכים את כל השומן ורקמת החיבור שמסביב. לאחר מכן העבירו את האונות הקצוצות לבאר חדשה המכילה חמישה מיליליטר של תמיסת אנזים טרייה שהוכנה והשתמשו במספריים עדינים כדי לבצע חתכים קטנים ברקמה. מניחים את הצלחת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס.

לאחר 20 דקות, פיפטה בעדינות את הרקמה למעלה ולמטה מספר פעמים עם פיפטה של חמישה מיליליטר כדי לפרק את התרחיץ לתרחיף תא בודד. אסוף את החלק הסופרנטנטי בשפופרת של 50 מיליליטר המכילה 10 מיליליטר של חיץ עשיר באלבומין קר על קרח כדי לנטרל את האנזימים. לאחר מכן הוסף 2.5 מיליליטר תמיסת אנזים לרקמה שנותרה.

דגרו את הצלחת למשך 15 דקות. לאחר מכן, ערבבו בעדינות את הרקמה בעזרת מזרק של שלושה מיליליטר המצויד במחט של 18 גנים כדי לפרק את כל האגרגטים. לאחר מכן העבירו את לצינור האיסוף.

לאחר מכן הוסף 2.5 מיליליטר תמיסת אנזים לרקמה שנותרה. דגרו את הצלחת למשך 15 דקות. לאחר הדגירה השלישית, חזור על התסיסה המכנית בעזרת מחט 20 5G.

לאחר הדגירה של הרקמה במשך חמש עד 10 דקות אחרונות, העבירו את הסופרנטנט לצינור האיסוף לצנטריפוגה כדי לזהות את הטכנולוגיה המשוחזרת על ידי זרימה ציטומטרית לאחר הליכי צביעת נוגדנים סטנדרטיים, הפעל את הדגימות על ציטומטר זרימה רב-פרמטרי ונתח את הנתונים באמצעות תוכנת ניתוח הפקס המתאימה כדי להעשיר את הטכנולוגיה עוד יותר בשיטת הפאנינג. ראשית, דגרו על התאים עם הנוגדן המתאים להעשרה. לאחר מכן, הוסף את מתלה התא לצלחת פאנינג מקודדת מראש ולאחר מכן סובב את הצלחת ודגירה בטמפרטורת החדר.

לאחר 30 דקות, סובבו את הצלחת במרץ ולאחר מכן העבירו את הסופרנטנט לצינור חרוטי. שוטפים את הצלחת פעמיים עם טריים, בינוניים, מאגדים את השטיפות בצינור האיסוף. לאחר מכן, לאחר סיבוב התאים, השעו מחדש את הגלולה בחמישה מיליליטר של טרי ובינוני והעבירו את תרחיף התאים לצלחת פאנינג חדשה, ואספו את התאים לאחר סיבוב ודגירה כפי שהודגם זה עתה כדי לטהר עוד יותר את הטכנולוגיה המועשרת לתת-קבוצות התאים התימיים שלהם.

לאחר התיוג עם הנוגדנים המתאימים, מיין את הטכנולוגיה דרך זרבובית של 100 מיקרומטר על ידי מיון תאים מופעל פלואורסצנטי, ואוסף את התאים בנפח של 30% לנפח FBS במדיום. באסטרטגיית שער מייצגת זו לזיהוי טכנולוגיה על ידי ציטומטריית זרימה ניתן לראות את הביטוי של epca, אך לא CD 45 על ידי הטכנולוגיה. לפיכך, ניתן לגדר את הטכנולוגיה על פי טכנולוגיית הביטוי ep, camm ו-CD 45 שלהם מורכבת מתת-קבוצות אפיתל תימיות קליפת המוח או CEC ומדולרי או mtech.

ניתן להבחין בין תת-קבוצות אלה על ידי הנוגדן החי 51, המזהה פפטידאז אמינו גלוטמיל G המתבטא על ידי ctec והלקטין UEA אחד, שנקשר ל-mtech גם ctech וגם Mtech מבטאים MHC Class 2 על פני השטח שלהם. למרות שניתן לסווג את mtech לאוכלוסיות נמוכות וגבוהות mtech, בהתאם לרמת ביטוי MHC 2 שלהם, ניתן לשחזר בערך פי שמונה יותר טכנולוגיה באמצעות פרוטוקול מבוסס אנזים liase שהודגם זה עתה בהשוואה לפרוטוקול עם קולגנאז ושטח דיסק עם בערך פי 10 עד החמישי, המסוגל להתאושש מבלוטת התימוס של עכבר אחד בלבד כדי להפחית את זמן המיון ולהגדיל את הכדאיות של תאי סטרומה משוחזרים. ניתן להשתמש בפאנינג כפי שהודגם זה עתה כדי לדלל את אתרי התימוציטים בהשוואה לתאי תימוס מוכנים שלמים.

שיעור הטכנולוגיה עולה מפחות מ-0.5% ליותר מ-15% באוכלוסיית התאים הפוסט-מועשרים. לאחר הגלילה, הפרופורציות של תת-הקבוצות הטכניות אינן משתנות, מה שמרמז על כך שאף תת-קבוצה לא הולכת לאיבוד באופן סלקטיבי במהלך הגלילה. בהשוואה לדגימת ההעשרה המוקדמת, שיעור ההתאוששות של הטכנולוגיה הוא כ-85%לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להעשיר תאי נבט נושאיים מיותר מאשר על ידי פאניקה, כמו גם כיצד לזהות ולטהר יותר תאי אפיתל נושאיים על ידי ציטומטריית זרימה.