₁ F _O הכנת שלפוחיות ATPase וטכניקה לביצוע הקלטות מהדק תיקון של קרום שלפוחית ​​Submitochondrial

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד שלפוחיות F1 F אפס APAs ממוח החולדה לביצוע הקלטות מהדק תיקון. זה מושג על ידי הסרת המוח מחולדה והומוגניזציה שלו. השלב השני הוא לשבש אזורים סינפטיים על ידי הפעלת לחץ.

לאחר מכן, הסינפטוזום מונח בשכבות על שיפועי הפיאל. השלב האחרון הוא דגירה עם ספרות טואין ו-L כדי להשיג את השלפוחיות הסופיות להקלטת מהדק תיקון. פונקציה חשובה של המיטוכונדריה היא ייצור TP על ידי זרחון חמצוני.

האנזים האחראי לייצור TP הוא סינתאז A TP הממוקם בקרום הפנימי המיטוכונדריאלי. כדי לחקור את פונקציית הסינתאז A TP בפירוט, אנו מבודדים שלפוחיות תת-מיטוכונדריאליות מיוחדות שאנו מכנים SMVs. הם מכילים את האנזים A TP synthase בתצורה מבפנים החוצה.

לאחר מכן אנו מקליטים את ה-SMV האלה עם אלקטרודת מהדק תיקון, ואנו קובעים את הדליפה של הממברנה שלהם. זה אומר לנו על היעילות של ייצור TP על ידי המיטוכונדריה. מי שתדגים את ההליך הזה היום היא סילביה טי, פוסט-דוקטורנטית במעבדה שלי באוניברסיטת ייל.

בהליך זה, לאחר השגת ראש של חולדה על ידי עריפת ראש, חותכים את העור כדי לחשוף את הגולגולת, ואז פותחים את הגולגולת בעדינות על ידי חיתוך בעזרת מספריים או רונס. לאחר מכן, הסר את המוח, טחון את המוח ללא המוח הקטן סוף סוף בבידוד, חוצץ, ואז העביר אותו להומוגניזטור טפלון מזכוכית של חמישה מיליליטר הומוגניזציה עדינה של הרקמה 10 פעמים, כחמש דקות בסך הכל. לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימה ב-1, 500 פעמים G למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס בצנטריפוגה על שולחן.

שמור את הסופרנטנט עם מיטוכונדריה וסינפטוזום והשליך את הגלולה. ואז צנטריפוגה אותו שוב ב -16, 000 פעמים, G למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס בצנטריפוגה על ספסל. לאחר מכן, השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את החך ב-500 מיקרוליטר של מאגר בידוד משבשים את הסינפטוזום עם כלי שיבוש תאים על ידי הפעלת לחץ של 1,200 PSI למשך 10 דקות, ואחריו שכבת דקומפרסיה מהירה של אזורי הסינפה המופרעים על צינורות הצנטריפוגה עם שני ריכוזים שונים של פיאל שייצרו שתי שכבות.

לאחר מכן, הניחו את הצינורות ברוטור SW 50.1 ובצנטריפוגה בטמפרטורה של 126, 500 פעמים G למשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס. באולטרה-צנטריפוגה, החך הוא המיטוכונדריה המטוהרת. השכבה בין הצפיפויות השונות של פיאל היא הסינפטוזום הבלתי מופרע.

לאחר מכן, שטפו את הגלולה על ידי צנטריפוגה בבידוד. חוצץ ב 16, 000 פעמים G למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס בצנטריפוגה על ספסל. כעת Resus, השעו את המיטוכונדריה ב-200 מיקרוליטר של מאגר בידוד, בשילוב עם נפח שווה של 1% טואין.

מניחים אותו על קרח למשך 15 דקות. לאחר מכן, הוסף עוד בידוד, חיץ וצנטריפוגה ב 16, 000 פעמים G למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. חזור על הליך זה פעמיים, ולאחר מכן השהה מחדש את החך ב-200 מיקרוליטר של מאגר בידוד, והוסף שני מיקרוליטר של חזיית Lu 10%, PX, ערבב והניח על קרח למשך 15 דקות.

לאחר מכן, שכבו את התערובת בבידוד, חוצצים בצינורות הצנטריפוגה. הנח את הצינורות ברוטור SSW 50.1 וצנטריפוגה אותו ב -182, 000 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס למשך שעה. אחרי שעה.

שטפו את הפלטה הסופית על ידי צנטריפוגה במאגר בידוד ב -16, 000 פעמים G למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. מתקן אלקטרופיזיולוגיה טיפוסי כולל מגבר, מחשב PC המצויד בנתוני digi 1, 440, ממשק ממיר אנלוגי לדיגיטלי בשילוב עם מהדק P, מניפולטורים של תוכנה 10.0, מיקרוסקופ, שולחן בידוד רעידות וכלוב פאראדיי. ראשית, משוך פיפטה מצינור נימי זכוכית בורוס סיליקט בחולץ מיקרו פיפטה חום בוער.

ההתנגדות האופטימלית של הפיפטה צריכה להיות בין 80 ל -100 מגה אוהם. הוסף את השלפוחיות התת-מיטוכונדריאליות בתמיסה תוך-תאית פיזיולוגית. ואז מלאו פיפטה מהדק תיקון באותו תמיסה.

דמיין את השלפוחיות תחת ניגודיות פאזה. מיקרוסקופיה לאחר תיקון SMV בטמפרטורת החדר. רשום את הפעילות כאשר פוטנציאל הממברנה נשמר במתח שנע בין 100 מילי-וולט שלילי ל-100 מילי-וולט חיובי למשך 10 שניות בכל תקופה.

הנתונים שנרשמו מסוננים בחמישה קילו-הרץ באמצעות מעגלי המגבר ומנותחים באמצעות תוכנת clamp fit 10.0. איור זה מציג את כתם הליזאט שהוכן מציטוזול ומיטוכונדריה. הפאנל העליון מראה כתם חיסוני באמצעות נוגדן כנגד החלבון הציטוזולי GA dh.

הפאנל התחתון מראה כתם באמצעות נוגדן כנגד חלבון הממברנה הפנימית המיטוכונדריאלית. קוקס ארבע להלן שתי הקלטות מהדק תיקון מייצגות לפני ואחרי תוספת של מילימולר אחד ל-TP. פוטנציאל ההחזקה הוא חיובי 70 מילי-וולט. הקו המקווקו מייצג אפס פיקואמפים.

כל מעקב נרשם במשך 10 שניות ויש 10 שניות בין העקבות למוצג. להלן העקבות לדוגמה של שינויי עוצמת הקרינה של מחוון A CMA לאורך זמן בנוכחות SMVs ובהיעדר ונוכחות של TP. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד מיטוכונדריה, שלפוחית תת-מיטוכונדריה להכיל F1 FO 80 TP Synthes. יתר על כן, עליך להבין את הצורה I חותם עמיד עם אלקטרודה על קרום השלפוחית כדי לנתח את פעילות הערוץ של קומפלקס A TP Syntase.