1 F O הכנת שלפוחיות ATPase וטכניקה לביצוע הקלטות מהדק תיקון של קרום שלפוחית Submitochondrial
4 במאי 2013
שיטה לבודד את שלפוחית submitochondrial מועשרת במתחמי ה-ATP synthase F1FO ממוח חולדה מתוארת. שלפוחית אלה מאפשרים מחקר של הפעילות של F1FO ATPase המורכב והאפנון שלה תוך שימוש בטכניקה של הקלטת תיקון מהדק.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד שלפוחיות F1 F אפס APAs ממוח החולדה לביצוע הקלטות מהדק תיקון. זה מושג על ידי הסרת המוח מחולדה והומוגניזציה שלו. השלב השני הוא לשבש אזורים סינפטיים על ידי הפעלת לחץ.
לאחר מכן, הסינפטוזום מונח בשכבות על שיפועי הפיאל. השלב האחרון הוא דגירה עם ספרות טואין ו-L כדי להשיג את השלפוחיות הסופיות להקלטת מהדק תיקון. פונקציה חשובה של המיטוכונדריה היא ייצור TP על ידי זרחון חמצוני.
האנזים האחראי לייצור TP הוא סינתאז A TP הממוקם בקרום הפנימי המיטוכונדריאלי. כדי לחקור את פונקציית הסינתאז A TP בפירוט, אנו מבודדים שלפוחיות תת-מיטוכונדריאליות מיוחדות שאנו מכנים SMVs. הם מכילים את האנזים A TP synthase בתצורה מבפנים החוצה.
לאחר מכן אנו מקליטים את ה-SMV האלה עם אלקטרודת מהדק תיקון, ואנו קובעים את הדליפה של הממברנה שלהם. זה אומר לנו על היעילות של ייצור TP על ידי המיטוכונדריה. מי שתדגים את ההליך הזה היום היא סילביה טי, פוסט-דוקטורנטית במעבדה שלי באוניברסיטת ייל.
בהליך זה, לאחר השגת ראש של חולדה על ידי עריפת ראש, חותכים את העור כדי לחשוף את הגולגולת, ואז פותחים את הגולגולת בעדינות על ידי חיתוך בעזרת מספריים או רונס. לאחר מכן, הסר את המוח, טחון את המוח ללא המוח הקטן סוף סוף בבידוד, חוצץ, ואז העביר אותו להומוגניזטור טפלון מזכוכית של חמישה מיליליטר הומוגניזציה עדינה של הרקמה 10 פעמים, כחמש דקות בסך הכל. לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימה ב-1, 500 פעמים G למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס בצנטריפוגה על שולחן.
שמור את הסופרנטנט עם מיטוכונדריה וסינפטוזום והשליך את הגלולה. ואז צנטריפוגה אותו שוב ב -16, 000 פעמים, G למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס בצנטריפוגה על ספסל. לאחר מכן, השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את החך ב-500 מיקרוליטר של מאגר בידוד משבשים את הסינפטוזום עם כלי שיבוש תאים על ידי הפעלת לחץ של 1,200 PSI למשך 10 דקות, ואחריו שכבת דקומפרסיה מהירה של אזורי הסינפה המופרעים על צינורות הצנטריפוגה עם שני ריכוזים שונים של פיאל שייצרו שתי שכבות.
לאחר מכן, הניחו את הצינורות ברוטור SW 50.1 ובצנטריפוגה בטמפרטורה של 126, 500 פעמים G למשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס. באולטרה-צנטריפוגה, החך הוא המיטוכונדריה המטוהרת. השכבה בין הצפיפויות השונות של פיאל היא הסינפטוזום הבלתי מופרע.
לאחר מכן, שטפו את הגלולה על ידי צנטריפוגה בבידוד. חוצץ ב 16, 000 פעמים G למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס בצנטריפוגה על ספסל. כעת Resus, השעו את המיטוכונדריה ב-200 מיקרוליטר של מאגר בידוד, בשילוב עם נפח שווה של 1% טואין.
מניחים אותו על קרח למשך 15 דקות. לאחר מכן, הוסף עוד בידוד, חיץ וצנטריפוגה ב 16, 000 פעמים G למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. חזור על הליך זה פעמיים, ולאחר מכן השהה מחדש את החך ב-200 מיקרוליטר של מאגר בידוד, והוסף שני מיקרוליטר של חזיית Lu 10%, PX, ערבב והניח על קרח למשך 15 דקות.
לאחר מכן, שכבו את התערובת בבידוד, חוצצים בצינורות הצנטריפוגה. הנח את הצינורות ברוטור SSW 50.1 וצנטריפוגה אותו ב -182, 000 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס למשך שעה. אחרי שעה.
שטפו את הפלטה הסופית על ידי צנטריפוגה במאגר בידוד ב -16, 000 פעמים G למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. מתקן אלקטרופיזיולוגיה טיפוסי כולל מגבר, מחשב PC המצויד בנתוני digi 1, 440, ממשק ממיר אנלוגי לדיגיטלי בשילוב עם מהדק P, מניפולטורים של תוכנה 10.0, מיקרוסקופ, שולחן בידוד רעידות וכלוב פאראדיי. ראשית, משוך פיפטה מצינור נימי זכוכית בורוס סיליקט בחולץ מיקרו פיפטה חום בוער.
ההתנגדות האופטימלית של הפיפטה צריכה להיות בין 80 ל -100 מגה אוהם. הוסף את השלפוחיות התת-מיטוכונדריאליות בתמיסה תוך-תאית פיזיולוגית. ואז מלאו פיפטה מהדק תיקון באותו תמיסה.
דמיין את השלפוחיות תחת ניגודיות פאזה. מיקרוסקופיה לאחר תיקון SMV בטמפרטורת החדר. רשום את הפעילות כאשר פוטנציאל הממברנה נשמר במתח שנע בין 100 מילי-וולט שלילי ל-100 מילי-וולט חיובי למשך 10 שניות בכל תקופה.
הנתונים שנרשמו מסוננים בחמישה קילו-הרץ באמצעות מעגלי המגבר ומנותחים באמצעות תוכנת clamp fit 10.0. איור זה מציג את כתם הליזאט שהוכן מציטוזול ומיטוכונדריה. הפאנל העליון מראה כתם חיסוני באמצעות נוגדן כנגד החלבון הציטוזולי GA dh.
הפאנל התחתון מראה כתם באמצעות נוגדן כנגד חלבון הממברנה הפנימית המיטוכונדריאלית. קוקס ארבע להלן שתי הקלטות מהדק תיקון מייצגות לפני ואחרי תוספת של מילימולר אחד ל-TP. פוטנציאל ההחזקה הוא חיובי 70 מילי-וולט. הקו המקווקו מייצג אפס פיקואמפים.
כל מעקב נרשם במשך 10 שניות ויש 10 שניות בין העקבות למוצג. להלן העקבות לדוגמה של שינויי עוצמת הקרינה של מחוון A CMA לאורך זמן בנוכחות SMVs ובהיעדר ונוכחות של TP. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד מיטוכונדריה, שלפוחית תת-מיטוכונדריה להכיל F1 FO 80 TP Synthes. יתר על כן, עליך להבין את הצורה I חותם עמיד עם אלקטרודה על קרום השלפוחית כדי לנתח את פעילות הערוץ של קומפלקס A TP Syntase.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר שיטה לבידוד של שלפוחיות סוב-מיטוכונדריאליות המועשרות בקומפלקסים של F1FO ATP synthase ממוח של חולדה. שלפוחיות אלה מקלות על חקר הפעילות של קומפלקס F1FO ATPase והוויסות שלו באמצעות הקלטת patch clamp.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- אלקטרופיזיולוגיה
רקע
- המיטוכונדריה ממלאות תפקיד מכריע בייצור ATP באמצעות חמצון זרימתי (oxidative phosphorylation).
- F1FO ATP synthase חיוני עבור סינתזת ATP בתאים.
- Patch clamp recording היא טכניקה המשמשת לחקר תעלות יונים ופוטנציאלי ממבנה.
- בידוד וסיקולות מאפשר ניתוח מפורט של תפקוד המיטוכונדריה.
מטרת המחקר
- לבידוד קומפלקסים של F1FO ATP synthase ממיטוכונדריה של מוח חולדה.
- לאפשר את חקר המודולציה של פעילות ה-ATPase.
- להשתמש בטכניקות patch clamp לצורך אנליזה פונקציונלית.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הומוגניזציה של רקמת מוח של חולדה.
- פירוק של אזורי סינפסה באמצעות הפעלת לחץ.
- שכיבת סינפטוזומים על מדרגות ריכוזים בבקבוק (phial gradients).
- אינקובציה עם digitonin להשגת שלפוחיות סופיות.
תוצאות עיקריות
- בידוד מוצלח של שלפוחיות סוב-מיטוכונדריאליות.
- הדגמה של פעילות F1FO ATPase באמצעות הקלטות patch clamp.
- תובנות לגבי המודולציה של קומפלקסים של ATP synthase.
- יישומים פוטנציאליים בחקר תפקוד מיטוכונדריאלי.
מסקנות
- השיטה מספקת דרך מהימנה לחקר ה-ATP synthase המיטוכונדריאלי.
- הקלטות patch clamp יכולות לחשוף תכונות תפקודיות חשובות.
- גישה זו עשויה לשפר את ההבנה של תפקידי המיטוכונדריה בנוירונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ניתוח patch clamp ישיר של ממברנות של שלפוחיות סוב-מיטוכונדריאליות המכילות F1FO ATPase מאפשר בחינה מדויקת של פעילות תעלות יונים מיטוכונדריאליות ותפקוד ATP synthase. תהליך עבודה זה תומך בהסרת סיכונים מכניסטיים ובתיקוף מטרות עבור ביואנרגטיקה מיטוכונדריאלית, ובכך מסייע בקבלת החלטות בשלבים מוקדמים של תיקי מחקר במחקרים על מחלות מטבוליות וניוודה-גנרטיביות. מדידות כמותיות של מוליכות הממברנה מספקות ביטחון ניבוי עבור סריקות המשך ומחקרי תרגום קליני.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר מדידה ישירה של פעילות תעלת F1FO ATPase לצורך תיקוף פונקציונלי של המטרה.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי כימות מוליכות דליפת יונים ויעילות מיטוכונדריאלית.
- מקל על בדיקת השערות לגבי אינטראקציות חלבוניות המשפיעות על תפקוד ה-ATP synthase.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק מערכת וסיקולות שעברה תיקוף עבור בדיקות patch clamp הדירות של תעלות מיטוכונדריאליות.
- מספק פלטים אלקטרופיזיולוגיים כמותיים המתאימים לסריקת תרכובות ולמחקרים השוואתיים.
- מאפשר סטנדרטיזציה של תנאי הבדיקה לצורך הדירות בין מחקרים ובין צוותים שונים.
מחקר תרגומי ו-Preclinical
- מתואם עם מודלים רלוונטיים למחלות של תפקוד לקוי של מיטוכונדריה בניורודגנרציה ובהפרעות מטבוליות.
- תומך ברצף שבין גילוי מנגנוני לתיקוף פרה-קליני של יעדים מיטוכונדריאליים.
- מספק בסיס להחלטות קידום מותאמות סיכון, המבוססות על מדדי תפקוד כמותיים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
שיטה זו משתלבת ברצף הגילוי, החל ממחקרי מנגנון מוקדמים ועד לתיקוף במודלים פרה-קליניים, ומספקת פלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר לחקירת מטרות מיטוכונדריאליות.
- ביולוגיה של גילוי: מכמת את הפעילות של ATP synthase ואת מוליכות הדליפה כדי להבהיר מנגנונים של מסלולים מיטוכונדריאליים.
- סריקה: מספק מערכת חסונה להערכה של מודולטורים של תעלות יונים מיטוכונדריאליות.
- אנליטיקה: מייצר נתונים אלקטרופיזיולוגיים ברמת דיוק גבוהה להשוואה סטטיסטית של תנאי ניסוי.
- מחקר תרגומי: מקשר בין ממצאים מנגנוניים לנקודות קצה תפקודיות הרלוונטיות למחלה במודלים פרה-קליניים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס זרימת עבודה סטנדרטית להכנת וזיקולות ולהקלטה ליישום רחב במו"פ.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף מטרות מיטוכונדריאליות ובצמצום סיכונים פונקציונליים.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והיכולת להרחבה של בדיקות אלקטרופיזיולוגיות בין צוותים שונים.
- ערך אסטרטגי: משפר את איכות קבלת ההחלטות לגבי המשך התהליך (go/no-go) באמצעות אספקת נתונים כמותיים ומבוססי מנגנון.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעודוף מטרות מיטוכונדריאליות לקידום, בהתאמה לרמת הסיכון.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בבידוד מיטוכונדריה ובאלקטרופיזיולוגיה בשיטת patch clamp.
- מחייב גישה לציוד ייעודי, כולל אולטרה-צנטריפוגות ומערכות אלקטרופיזיולוגיה.
- מצריך סטנדרטיזציה קפדנית בין צוותים להכנת וזיקולות ולפרוטוקולי הקלטה.
- עשוי להדרוש התאמה למקורות רקמה שונים או למודלים של מחלות.
- תלוי בשמירה על שלמות הוזיקולות ועל אוריינטציה פונקציונלית של חלבונים לצורך קבלת נתונים מהימנים.
