Name: 1 F O הכנת שלפוחיות ATPase וטכניקה לביצוע הקלטות מהדק תיקון של קרום שלפוחית Submitochondrial (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: למדו לבודד שלפוחיות תת-מיטוכונדריאליות המכילות קומפלקסי F1FO ATPase ממוח עכברוש לצורך הקלטות patch clamp. שיטה זו מאפשרת חקר פעילות האנזים ומודולציה שלו בנוירונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. בידוד מוח מיטוכונדריאלי (מעובד מתוך בראון MR et al. 9) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב את העכברוש תוך שימוש בשיטות שאושרו על ידי הטיפול בבעלי החיים מוסדיים ועדת שימוש (IACUC). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את ראשו של בעל החיים על ידי עריפת ראש, לחתוך את העור ולחשוף את הגולגולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את הגולגולת בעדינות על ידי חיתוך עם מספריים או rongeur. הסר את המוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברר היטב את המוח בלי המוח הקטן במאגר הבידוד (ראה טבלת מס &#39;1) ולהעביר אותו ל5 מיליליטר זכוכית / טפלון homogenizer (ראה רשימת ציוד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize רקמות בעדינות 10 פעמים (אין בועות), כ 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה מדגם ב 1,500 × גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C בצנטריפוגה ספסל עליונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את supernatant (המיטוכונדריה וsynaptosomes) וזורקים את הכדור (חומר גרעיני ותא פסולת). צנטריפוגה ב 16,000 × גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C בצנטריפוגה ספסל עליונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשליךsupernatant מחדש להשעות גלולה ב 500 μl של הצפת בידוד. לשבש synaptosomes עם כלי שיבוש תא (ראה רשימת ציוד). החל לחץ של 1200 psi במשך 10 דקות, ואחרי לחץ מהיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שכבת תערובת על הדרגתיים Ficoll (ראה טבלה 2), המקום בSW-50.1 הרוטור צנטריפוגות ב 126,500 × גרם במשך 20 דקות ב 4 ° C בultracentrifuge (ראה רשימת ציוד). גלולה היא המיטוכונדריה מטוהרת, השכבה בין הצפיפויות של Ficoll השונים היא synaptosomes בלא הפרעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף גלולה ידי צנטריפוגה במאגר הבידוד ב16,000 × גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C בצנטריפוגה ספסל עליונה. </li></ol> 2. בידוד Submitochondrial שלפוחית ​​(SMV) (מעובד מתוך צ&#39;אן et al. 10) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-להשעות המיטוכונדריה במאגר 200 בידוד μl בשילוב עם נפח שווה של 1% digitonin ולאפשר לשבת על קרח במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף יותר בידוד Buffאה ו צנטריפוגות ב 16,000 × גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C בצנטריפוגה ספסל עליונה. לעשות את זה פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-להשעות גלולה ב 200 הצפת בידוד μl ולהוסיף 2 μl של 10% Lubrol PX (C12E9). לערבב ולאפשר לשבת על קרח במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תערובת שכבת בידוד על הצפת, מקום בSW-50.1 הרוטור צנטריפוגות ב 182,000 × גרם ב 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף סופי גלולה ידי צנטריפוגה בצנטריפוגה שולחן עליונה בבידוד במאגר 16,000 × גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C. </li></ol> 3. הקלטת אלקטרו <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסדת electrophysiology טיפוסית כוללת מגבר, מחשב PC מצויד בממשק ממיר Digidata 1440A אנלוגי לדיגיטלי בשיתוף עם pClamp10.0 תוכנה, מניפולטורים, מיקרוסקופ, שולחן בידוד רעידות, כלוב פאראדיי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות נימי התכה של זכוכית בורה מוכנסים לתוך Flaming / בראון Micropipette פולר דגם P-87. תכנית פיפטה-חולץ היא מותאמת לליצור pipettes עם התנגדויות בין 80 עד 100 MΩ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> SMVs ממוקמים בפתרון תאי פיסיולוגי (ATP הוא הוסיף בזמן המתאים במהלך ההקלטה) (לוח 3). pipettes צמד תיקון מלא עם אותו הפתרון (לא ה-ATP). הקלטות נעשות על ידי יצירת חותם גיגה אוהם על SMVs בטמפרטורת חדר. שלפוחית ​​הם דמיינו ידי מיקרוסקופ שלב בניגוד למיקרוסקופ הפוך ניקון או Zeiss. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוטנציאל הממברנה נשמר במתח הנע בין -100 mV ל+ 100 mV לתקופות של 10 שניות. הקלטות מסוננות ב5 קילוהרץ באמצעות מעגלי המגבר. רמת הרעש חשמלי או שאינם ספציפי התועה של הרשות הפלסטינית הן פחות מ 1 רצויה להקלטה מוצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנתונים מנותחים עם תוכנת Clampfit 10.0 למשל כדי לקבוע תדר ומשרעת של אירועי ערוץ אחד. תלות מתח נקבעה על ידי מתכנן מערכת יחסים מתח נוכחי. </li></ol>

<ol><li>Cheng, W. C., Berman, S. B., Ivanovska, I., Jonas, E. A., Lee, S. J., Chen, Y., Kaczmarek, L. K., Pineda, F., Hardwick, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+factors+with+dual+roles+in+death+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial factors with dual roles in death and survival.</a> Oncogene. 25, 4697-4705 (2006).</li>
<li>Duchen, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+and+calcium+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Mitochondria and calcium in health and disease.</a> Cell Calcium. 44, 1-5 (2008).</li>
<li>Lemasters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+mitochondrial+membrane+permeability+in+pathogenesis%2C+autophagy+and+control+of+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gastroenterol.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Modulation of mitochondrial membrane permeability in pathogenesis, autophagy and control of metabolism.</a> J. Gastroenterol. Hepatol. 22, Suppl 1. S31-S37 (2007).</li>
<li>Cox, G. B., Jans, D. A., Fimmel, A. L., Gibson, F., Hatch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothesis.+The+mechanism+of+ATP+synthase.+Conformational+change+by+rotation+of+the+beta-subunit%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Hypothesis. The mechanism of ATP synthase. Conformational change by rotation of the beta-subunit.</a> Biochim. Biophys. Acta. 768, 201-208 (1984).</li>
<li>Cox, G. B., Fimmel, A. L., Gibson, F., Hatch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+ATP+synthase%3A+a+reassessment+of+the+functions+of+the+b+and+a+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">The mechanism of ATP synthase: a reassessment of the functions of the b and a subunits.</a> Biochim. Biophys. Acta. 849, 62-69 (1986).</li>
<li>Cory, S., Huang, D. C., Adams, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Bcl-2+family%3A+roles+in+cell+survival+and+oncogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The Bcl-2 family: roles in cell survival and oncogenesis.</a> Oncogene. 22, 8590-8607 (2003).</li>
<li>Vander Heiden, M. G., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl-2+proteins%3A+regulators+of+apoptosis+or+of+mitochondrial+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Bcl-2 proteins: regulators of apoptosis or of mitochondrial homeostasis.</a> Nat. Cell Biol. 1, 209-216 (1999).</li>
<li>Alavian, K. N., Li, H., Collis, L., Bonanni, L., Zeng, L., Sacchetti, S., Lazrove, E., Nabili, P., Flaherty, B., Graham, M., Chen, Y., Messerli, S. M., Mariggio, M. A., Rahner, C., McNay, E., Shore, G. C., Smith, P. J. S., Hardwick, J. M., Jonas, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl-xL+regulates+metabolic+efficiency+of+neurons+through+interaction+with+the+mitochondrial+F1FO+ATP+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Bcl-xL regulates metabolic efficiency of neurons through interaction with the mitochondrial F1FO ATP synthase.</a> Nat. Cell Biol. 13 (10), 1224-1233 (2011).</li>
<li>Brown, M. R., Sullivan, P. G., Dorenbos, K. A., Modafferi, E. A., Geddes, J. W., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrogen+disruption+of+synaptoneurosomes%3A+an+alternative+method+to+isolate+brain+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Nitrogen disruption of synaptoneurosomes: an alternative method to isolate brain mitochondria.</a> Journal of Neuroscience Methods. 137, 299-303 (2004).</li>
<li>Chan, T. L., Greenawalt, J. W., Pedersen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+ultrastructural+properties+of+a+mitochondrial+inner+membrane+fraction+deficient+in+outer+membrane+and+matrix+activities%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Biochemical and ultrastructural properties of a mitochondrial inner membrane fraction deficient in outer membrane and matrix activities.</a> J. Cell Biol. 45 (2), 291-305 (1970).</li>
<li>Young, H. K. o, Delannoy, M., Hullihen, J., Chiu, W., Pedersen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+ATP+Synthasomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial ATP Synthasomes.</a> J. Biol. Chem. 278 (14), 12305-12309 (2003).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

השיטות שתוארו במסמך זה יאפשר את בידודה של המיטוכונדריה טהורה בסוף השלב 1 ושלפוחית ​​submitochondrial (SMVs) אחרי שלב 2 מהמוח כולו, ללא הבחנה של תא phenotypes.SMVspurified בשיטה זו בעצם נקיה מזיהום על ידי אברונים subcellular אחרים כפי שמוצג ב איור 1 והעבודה הקודמת שלנו (Alavian KN et al. 8) ולשמור על השלמות המבנית ותפקודית שלהם לפני ההקפאה. לאחר הקפאה והפשרה, מבודד המיטוכונדריה או SMVs משמשים להקלטות ומבחני ביוכימיים, אבל לא ללימודים בדרכי הנשימ...

<table><tbody><tr><td>דוחס רקמות Potter-Elvehjem עם עלי עם PTFE</td><td>Krackeler Scientific, Inc.</td><td>1-7725T-5</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה Eppendorf 5424 </td><td>Eppendorf</td><td>5424 000.410</td><td></td></tr><tr><td>כלי לפירוק תאים 4639</td><td>Parr Instrument Company</td><td>4639</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5415</td><td></td></tr><tr><td>מבחנות צנטריפוגה מפוליקרבונט</td><td>Beckman Coulter</td><td>P20314</td><td></td></tr><tr><td>רוטור SW-50.1 </td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אולטרה-צנטריפוגה L8-70M</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5628</td><td></td></tr><tr><td>Lubrol PX (C12E9) </td><td>Calbiochem</td><td>205534</td><td></td></tr><tr><td>Axopatch 200B </td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digidata 1440A </td><td>Molecular Device</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pClamp10.0</td><td>Molecular Device</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מניפולטור</td><td>Sutter Instrument</td><td></td><td></td></tr><tr><td>קפילרית זכוכית בורוסיליקט</td><td>World Precision Instruments</td><td>1308325</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר למשיכת מיקרו-פיפטות Flaming/Brown דגם P-87</td><td>Sutter Instrument</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

<sub&gt; 1</sub&gt; f<sub&gt; o</sub&gt; הכנת שלפוחיות atpase וטכניקה לביצוע הקלטות מהדק תיקון של קרום שלפוחית ​​submitochondrial

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

המיטוכונדריה הוא מעורב בפונקציות רבות תאיות חשובות, כולל חילוף חומרים, הישרדות 1, פיתוח ו, סידן איתות 2. שניים מתפקידיו החשובים ביותר המיטוכונדריה קשורים לייצור יעיל של ה-ATP, מטבע האנרגיה של התא, על ידי זרחון חמצוני, והגישור של אותות למוות תאים מתוכנת 3. האנזים האחראי בעיקר לייצור של ה-ATP הוא synthase F1FO-ATP, המכונה גם ה-ATP synthase 4-5. בשנים האחרונות, את תפקידו של המיטוכונדריה במוות של תאים אפופטוטיים ונימקים קיבלה תשומת לב רבה. במוות של תאים אפופטוטיים, Bcl-2 חלבונים משפחתיים כגון Bax להזין את הקרום החיצוני של המיטוכונדריה, oligomerize וpermeabilize קרום החיצוני, משחררים גורמים פרו אפופטוטיים ל6 cytosol. במוות של תאי נמקי קלאסי, כגון זה המיוצר על ידי איסכמיה או הפעלת יתר רעילה בתאי עצב, largהדואר, גידול מוסדר היטב בסידן מטריצה ​​תורם לפתיחה נקבובית קרום פנימי, נקבובית מעבר חדירות המיטוכונדריה או MPTP. זה depolarizes הקרום הפנימי וגורם למשמרות אוסמוטי, תורם לקרע חיצוני קרום, שחרור של גורמים פרו אפופטוטיים, ובעיות בתפקוד מטבולי. חלבונים רבים, כולל Bcl-XL 7 אינטראקציה עם ה-ATP synthase F1FO, ויסות תפקודו. Bcl-XL אינטראקציה ישירות עם מקטע הבטא של ה-ATP synthase F1FO, ואינטראקציה זו מקטינה מוליכות דליפה בתוך F1FOATPasecomplex, הגדלת התחבורה הנקי של H + על ידי F1FO במהלך F1FO פעילות ATPase 8 ויעילות ובכך להגדיל המיטוכונדריה. כדי לחקור את הפעילות והאפנון של ה-ATP synthase, אנחנו מבודדים משלפוחית ​​submitochondrial מכרסם במוח (SMVs) המכיל F1FO ATPase. את SMVs לשמר את השלמות המבנית ותפקודית של ATPase F1FO כפי שמוצג בAlavian et al. כאן, אנו מתארים שיטהשאנחנו השתמשנו בהצלחה לבידודה של SMVs ממוח חולדה ואנו להתוות את טכניקת מהדק התיקון לניתוח פעילות ערוץ (מוליכות דליפת יון) של SMVs.

הצעד הראשון של הפרוטוקול שלנו מאפשר לבידוד של מטוהרים המיטוכונדריה, כפי שמוצג על ידי כתם מערבי באיור 1. באיור 2 מוצג דוגמה להקלטת תיקון שלפוחית ​​submitochondrial מוח נגזרת. שימוש בתצורת התיקון מבפנים החוצה אנחנו מדגימים פעילות מווסתת על ידי ערוץ ה-ATP. השליטה (CTL) הקלטה (משמאל) מראה פעילות ערוץ רבת מוליכות עם מוליכות שיא של 600 נ&quot;ב בממוצע. שירד מייד עם תוספת של 1 מ&quot;מ ה-ATP לאמבטיה. ההשפעה הכוללת של ה-ATP היא להפחית את המוליכות של טלאי SMVs באופן ריכוז ...

שיטה לבודד את שלפוחית ​​submitochondrial מועשרת במתחמי ה-ATP synthase F1FO ממוח חולדה מתוארת. שלפוחית ​​אלה מאפשרים מחקר של הפעילות של F1FO ATPase המורכב והאפנון שלה תוך שימוש בטכניקה של הקלטת תיקון מהדק.

<sub&gt; 1</sub&gt; F<sub&gt; O</sub&gt; הכנת שלפוחיות ATPase וטכניקה לביצוע הקלטות מהדק תיקון של קרום שלפוחית ​​Submitochondrial

מיטוכונדריה מעורבות בתפקודי תא חשובים רבים, הכוללים מטבוליזם, הישרדות1, התפתחות ואיתות סידסן2. שתיים מה...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבודד שלפוחיות APAs מסוג F1 F zero ממוח של חולדה לצורך ביצוע הקלטות patch clamp. פעולה זו משיגה תחילה על ידי הוצאת המוח מהחולדה והומוגניזציה שלו. השלב השני הוא פירוק אזורים סינפטיים באמצעות הפעלת לחץ.בשלב הבא, מניחים את הסינפטוזומים בשכבות על גבי מדרגי הפייאלים. השלב האחרון הוא דגירה עם digitonin ו-L כדי להפיק את הוזיקולות הסופיות להקלטת patch clamp. תפקוד חשוב של מיטוכונדריה הוא ייצור ATP באמצעות פוספורילציה חמצונית.האנזים האחראי לייצור ATP הוא ה-ATP synthase הממוקם בממברנה הפנימית של המיטוכונדריה. כדי ללמוד את תפקוד ה-ATP synthase בפירוט, אנו מבודדים שלפוחיות תת-מיטוכונדריאליות מיוחדות שאותן אנו מכנים SMVs. אלו מכילות את אנזים ה-ATP synthase בתצורה הפוכה (inside out).לאחר מכן אנו מקליטים SMVs אלו באמצעות אלקטרודת patch clamp, וקובעים את רמת הדליפות של הממברנה שלהם. נתון זה מלמד אותנו על היעילות של ייצור TP על ידי המיטוכונדריה. את הפרוצדורה הזו תדגים היום Sylvia ti, פוסט-דוקטורנטית במעבדה שלי באוניברסיטת Yale.בפרוצדורה זו, לאחר קבלת ראש של חולדה באמצעות עקיפת ראש, חתכו את העור כדי לחשוף את הגולגולת, ולאחר מכן פתחו את הגולגולת בעדינות על ידי חיתוכה בעזרת מספריים או מספרי Rons. לאחר מכן, הוציאו את המוח, קצצו את המוח ללא המוזחור, ובסופו של דבר בבידוד בבופר, ואז העבירו אותו להומוגניזטור זכוכית עם טפלון בנפח 5 mL. הומוגניזרו בעדינות את הרקמה 10 פעמים, במשך כ-5 דקות בסך הכל. לאחר מכן, סובבו את הדגימה בצנטריפוגה שולחנית ב-1,500 ×g למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 °C.שמרו את העילוי המכיל מיטוכונדריה וסינפטוזומים והשליכו את המשקע. לאחר מכן, סובבו אותו שוב בצנטריפוגת שולחן ב-16,000 ×g למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 °C. כעת, השליכו את העילוי ותלו את המשקע ב-500 µL של בופר בידוד. פצלו את הסינפטוזומים באמצעות מכשיר לפיצול תאים על ידי הפעלת לחץ של 1,200 PSI למשך 10 דקות, ולאחריו דה-קומפרסיה מהירה. העבירו את הסינפטוזומים המפוצלים למבחנות צנטריפוגה עם שני ריכוזים שונים של FiCoN, אשר ייצרו שני שכבות.כעת מקם את המבחנות ברוטור SW 50.1 וסבב במערך צנטריפוגה במהירות של 126,500 ×g למשך 20 דקות בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס. בעוצמה של אולטרה-צנטריפוגה, המשקע הוא המיטוכונדריה המטוהרת. השכבה שבין הצפיפויות השונות במבחנה היא הסינפטוזום שאינו מפורק.לאחר מכן, שטפו את המשקע על ידי צנטריפוגה בבופר בידוד במהירות של 16,000 ×g למשך 10 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס בצנטריפוגה שולחנית. כעת, השעו את המיטוכונדריה ב-200 µL של בופר בידוד, בשילוב עם נפח שווה של 1% digitonin.הנח את הדגימה על קרח למשך 15 דקות. לאחר מכן, הוסף תמיסת בידוד (isolation buffer) נוספת וסבב במרכזפוגה ב-16,000 ×g למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 °C. חזור על הליך זה פעמיים, לאחר מכן השהה מחדש את המשקע (pellet) ב-200 µL של תמיסת בידוד, והוסף 2 µL של 10% Lu bra, PX, ערבב והנח על קרח למשך 15 דקות.לאחר מכן, העבירו את התערובת לשכבות של בידוד במערך של בופר בתוך מבחנות צנטריפוגה. הניחו את המבחנות ברוטור SSW 50.1 ובצעו צנטריפוגה במהירות של 182,000 ×g בטמפרטורה של 4°C למשך שעה אחת. לאחר שעה.שטפו את המשקע הסופי באמצעות סבב במערך צנטריפוגה בתמיסת בידוד במהירות של 16,000 ×g למשך 10 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. מערך אלקטרופיזיולוגיה טיפוסי כולל מגבר, מחשב PC המצויד ב-digi data 1, 440, ממשק ממיר אנלוגי לדיגיטלי בשילוב עם תוכנת P clamp, 10.0, מניפולטורים, מיקרוסקופ, שולחן בידוד רעידות וכלוב פאראדיי. ראשית, משכו פיפט מתוך צינור קפילרי מזכוכית בורוסיליקאט באמצעות מושך מיקרו-פיפטים בלהבה של Flaming Brown.ההתנגדות האופטימלית של הפ pipette צריכה להיות בין 80 ל-100 mega ohm. הוסף את השקיקים הסוב-מיטוכונדריאליים בתמיסה פסיולוגית תוך-תאית. לאחר מכן, מלא pipette של patch clamp באותה התמיסה.בצעו הדמיה של הוסיקולות תחת מיקרוסקופיית ניגודיות פאזה לאחר ביצוע פאץ' ל-SMVs בטמפרטורת החדר. רשמו את הפעילות כאשר פוטנציאל הממברנה נשמר במתח הנע בין 100- millivolts ל-100+ millivolts למשך 10 שניות בכל תקופה.הנתונים שהוקלטו סוננו בתדר של five kilohertz באמצעות מעגלי המגבר ונותחו באמצעות תוכנת clamp fit 10.0. איור זה מציג את הבלוט (blot) של ליזאט שהוכן מציטוזול וממיטוכונדריה. הפאנל העליון מציג אימונו-בלוט המשתמש בנוגדן נגד החלבון הציטוזולי GA dh.הפאנל התחתון מציג Blot באמצעות נוגדן נגד החלבון של הממברנה הפנימית של המיטוכונדריה, Cox four. כאן מוצגות שתי הקלטות patch clamp מייצגות לפני ואחרי הוספה של 1 mM ATP. פוטנציאל ההחזקה הוא 70+ mV. הקו המקווקו מייצג 0 pA.כל עקבה נרשמת למשך 10 שניות, וישנם 10 שניות בין העקבות המוצגות. להלן דוגמאות לעקבות של שינויים בעוצמת הפלואורסצנציה של אינדיקטור CMA לאורך זמן בנוכחות SMVs, וכן בהיעדר ובנוכחות של TP. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להגיע להבנה טובה של אופן בידוד מיטוכונדריה, ושליפת שלפוחיות תת-מיטוכונדריאליות המכילות F1 FO 80 TP Synthes. יתרה מכך, עליכם להבין כיצד ליצור חסימה עמידה באמצעות אלקטרודה על ממברנת השלפוחיות כדי לנתח את פעילות התעלה של קומפלקס A TP Syntase.

f1fo-atpase-vesicle-preparation-technique-for-performing-patch-clamp

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

זה נועד כהקדמה תיקון הקלטה מהדק מ ביציות Xenopus laevis. היא משתרעת על הסרת vitelline קרום, היווצרות חותם gigaohm (gigaseal), ואת ההמרה אופציונלי של תיקון כדי טופולוגיה מחוץ הקצוב.

הצמד תיקון הקלטה של ​​תעלות יונים מתבטא ביציות Xenopus

יונית הנוכחי של BK ערוצי נרשם באמצעות מהדק טכניקות תיקון. ערוצי BK באים לידי...

הצמד תיקון וטכניקות זלוף עבור לימוד תעלות יונים מתבטא Xenopus ביציות

פרוטוקול זה מתאר טכניקה הנקראת אלקטרופיזיולוגיה של מהדק טלאי שלם, שהיא שיטה לחקר תכונות חשמליות של נוירוני מאוטנר ותאים רטיקולוספינליים אחרים בעוברים של דגי זברה.

אלקטרופיזיולוגיה של מהדק טלאי תאי שלם: שיטה לחקר תכונות חשמליות של נוירונים

פיתחנו הכנת מוח השדרה שלמה כבל כדי להקליט ולעקוב אחר פעילות חשמלית באמצעות הקלטת מהדק תיקון מתאי העצב ותאי מאוטנר reticulospinal אחרים בעוברי דג הזברה. לפיכך, אנו מסוגלים להקליט זרמים מעוררים ומעכבים הסינפטי, פעילות ערוץ מתח מגודרת ופוטנציאל פעולה מתא העצב מרכזי בעובר מתפתחת.

תיקון הקלטות קלאמפ מתאים עוברי דג הזברה מאוטנר

כדי להשלים את השיטות נפוצות ללמוד TRPV4 של שתי שיטות מתוארות: mechanosensitivity ניתן ללמוד על ידי 2 luminometry +-aequorin Ca בשמרים מהונדסים על אתגר היפו אוסמוטי. כמו כן, ניתן לבדוק בTRPV4-RNA מוזרק ביציות Xenopus ידי מהדק כל תא שתי אלקטרודות מתח או צמד תיקון בתאים או במצב נכרת.

Luminometric ושמרים Xenopus ביצית בחינות אלקטרו של Mechanosensitivity המולקולרי של TRPV4

הכינון מחדש של החלבון הטרנסממברני, KvAP, לתוך שלפוחית ​​unilamellar ענקית (GUVs) הוא הוכיח לשתי שיטות התייבשות-החזרת נוזלים - electroformation, ונפיחות בסיוע ג '. בשני השיטות, שלפוחית ​​unilamellar קטנה המכילה החלבון הם התמזגו יחד כדי ליצור GUVs כי אז יכול להיות שנחקר על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי ואלקטרופיזיולוגיה תיקון מהדק.

כינונה מחדש של חלבון טראנסממברנלי, יון ערוץ מתח מגודרת, KvAP, לענק Unilamellar שלפוחית ​​למיקרוסקופי וצמד תיקון ללימודים

מאמר שיטה זה מפרט את השלבים העיקריים במדידת דליפת H+ על פני הממברנה המיטוכונדריאלית הפנימית באמצעות טכניקת הידוק טלאי, גישה חדשה לחקר היכולת התרמוגנית של המיטוכונדריה.

השימוש בטכניקת המהדק טלאי כדי לחקור את היכולת התרמוגנית של המיטוכונדריה

למרות ההתקדמות האחרונה, חלבונים מיטוכונדריאליים שמרים רבים עדיין נשארים עם הפונקציות שלהם לא ידוע לחלוטין. פרוטוקול זה מספק שיטה פשוטה ואמינה כדי לקבוע את לוקליזציה submitochondrial של חלבונים, אשר היה בסיסי עבור הפיהור של הפונקציות המולקולריות שלהם.

הערכה של לוקליזציה של חלבון Submitochondrial ב ניצנים שמרים Saccharomyces cerevisiae

שיטה זו מנצלת את התרומה של נקבובית המעבר לחדירות המיטוכונדרית לדליפת פרוטונים בהולכה נמוכה כדי לקבוע את סף המתח לפתיחת נקבוביות בעכברי תסמונת X שבירים בילודים עם תכולת קו-אנזים Q מיטוכונדריאלית מוגברת של קרדיומיוציטים בהשוואה לבקרת wildtype.

הערכה של הסתברות פתוחה של נקבוביית מעבר החדירות המיטוכונדרית בהגדרה של עודף קו-אנזים Q

אתרי מגע מיטוכונדריאליים הם קומפלקסים חלבוניים המקיימים אינטראקציה עם חלבוני הממברנה הפנימית והחיצונית של המיטוכונדריה. אתרים אלה חיוניים לתקשורת בין קרומי המיטוכונדריה, ולכן בין הציטוזול לבין המטריצה המיטוכונדריאלית. במאמר זה אנו מתארים שיטה לזיהוי מועמדים המתאימים לסוג מסוים זה של חלבונים.

שיטה משופרת לבידוד אתרי מגע מיטוכונדריאליים

פרוטוקול זה מפרט שיטה למדידה ישירה של פעילות תעלות יונים על שלפוחיות תוך תאיות באמצעות מערכת מהדק טלאי אנדוליזוזומלי ידנית. אנו מדגימים את השיטה הכוללת הגדלת אנדוליזוזומים ובידוד ידני של שלפוחיות אלה. גישה זו מבטיחה שחוקרים יוכלו לשכפל וליישם במדויק את ההליך.

טכניקות Patch-Clamp לניתוח שלפוחית אנדוליזוזומלית בודדת

למדו לבודד שלפוחיות תת-מיטוכונדריאליות המכילות קומפלקסי F1FO ATPase ממוח עכברוש לצורך הקלטות patch clamp. שיטה זו מאפשרת חקר פעילות האנזים ומודולציה שלו בנוירונים.

גלה סרטונים נוספים