Biochip Multi-אנליטי (MAB) על בסיס אלקטרודות יון-All-סלקטיבית של מצב מוצק (ASSISE) למחקר הפיזיולוגי
April 18th, 2013
אלקטרודות יון סלקטיבית כל מצב מוצק (ASSISEs) הבנויות ממתמר פולימר מוליך (CP) לספק כמה חודשים של חיים תפקודי בתקשורת נוזלית. כאן, אנו מתארים את תהליך הייצור וכיול של ASSISEs בפורמט מעבדה על שבב. ASSISE הוא הוכיח ששמר על פרופיל מדרון קרוב Nernstian לאחר אחסון ממושך בתקשורת הביולוגית מורכבת.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לתפעל אלקטרודה סלקטיבית של יונים במצב מוצק הן עבור קטיון והן עבור זיהוי יונים אלקטרו פילמור ראשון. שכבת מתמר פולימרי מוליך על האלקטרודות העובדות של מעטפת הספין MAB, שכבת ממברנה סלקטיבית של יונים ומצב את השבבים למשך הלילה כדי להפעיל את הממברנה הסלקטיבית של היונים. כעת בתא תא הזרימה, חבר את רפידות המגע לפתרון מדידת הסטטיסטיקה הפוטנציאלית של שלוש האלקטרודות BASSI לתוך החדר.
הסרת בועות לא רצויות, בסופו של דבר ניתן לבצע כיולים של שבב ה-MAB ליונים מעניינים ולתעד אות פלט מה-MAB בזמן אמת. בניגוד לטכנולוגיות בדיקה מסורתיות של מיקרו אלקטרודות ותיוג רדיו, כל האלקטרודות הסלקטיביות של יונים במצב מוצק אינן פולשניות וניתן להכפיל אותן למדידות בזמן אמת של פעילויות יונים ולדגמן מערכות ביולוגיות ופיזיולוגיות. לראשונה עלה לנו הרעיון לבצע את השיטה הזו תוך כדי השתתפות במחקר אסטרוביולוגיה שדורש מקום מוגבל לביצוע מדידות פיזיולוגיות.
ג'ון יום פארק, סטודנטית לתואר שני במתקן חישה פיזיולוגי של עלי בורבון, תסייע לי בהדגמה ליצירת התא האלקטרוכימי לפילמור אלקטרו. השתמש במעמד תא Bassi C3 ובסטטיסטיקת גלוון פוטנציאל אפסילון EC. מניחים את תמיסת הפילמור האלקטרוכימי בתא האלקטרוכימי, ואז מבעבעים חנקן למשך 20 דקות כדי להסיר חמצן מומס.
כעת הצמד אלקטרודה נגדית של גזה פלטינה לתא האלקטרוכימי במיקום האלקטרודה הנגדית. לאחר מכן הצמד את ה- MAB במיקום האלקטרודה העובדת או במיקום המרכזי של התא האלקטרוכימי כשהאלקטרודות העובדות פונות לגזה הפלטינה, כוונן את עומק ה- MAB כך שרק האלקטרודות העגולות ישקעו בתמיסת הפילמור האלקטרו. הימנעות ממגע תמיסה עם רפידות המגע החשמליות המרובעות.
לאחר מכן, הניחו אלקטרודה רוויה באסי במיקום אלקטרודת הייחוס של התא האלקטרוכימי. ודא שאלקטרודת הייחוס אינה נוגעת באלקטרודות העובדות והנגדיות. לאחר מכן, באמצעות פוטנציאל אפסילון EC, סטאט גל ואנוס מריץ גרם מחזורי יחיד מאפס עד 1.1 וולט עם קצב סריקה של 20 מילי-וולט לשנייה בסולם פלוס מינוס 100 מיקרו אמפו.
לחישת סידן, בצע תצהיר PDO של סידן גופרתי על בועת MAB, תמיסת e. בתוספת סידן גופרתי למשך 20 דקות. כדי לאפיין את משטחי ה-pdot, השתמש בטלמטריה מחזורית של מצומדי הפולימר המבוססים על pdot.
בשני מילי-מולרי אשלגן ציאניד מריצים גרמים מחזוריים בודדים מ-653 מילי-וולט שלילי ל-853 מילי-וולט עם קצבי סריקה משתנים במרכז פלוס מינוס 10 מיקרופר, ה-bio chipp המולטי-אנליטי על צ'אק ספינר הוואקום מפקיד את הממברנה של 100 מיקרוליטר על מרכז ה-MAB ומפעיל את המדידה. הסיבוב הבא ציפוי את הממברנה הסלקטיבית של היונים ב-1, 500 סל"ד למשך 30 שניות עם רמפה של חמש שניות למעלה ולמטה, שואב את ה-MAB המצופה בסיבוב למשך 30 דקות. לאחר מכן אופים את הצ'יפס בתנור של 70 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
התנה את ה-MAB למשך הלילה ב-10 נתרן ביקרבונט מיקרו-מולרי, וחמישה מילי-מולרי אשלגן כלורי במצע אצות. כעת הכנס את ה-MAB למחזיק שבב תא הזרימה המיקרופלואידי. הזרקו חמישה מיליליטר של תמיסת בדיקה עם ערך ה-pH הראשוני או הריכוז המתאים.
הסר את כל הבועות ממחזיק שבב תא הזרימה והנח את מחזיק שבב תא הזרימה על מתקן החשמל של תא הזרימה. לאחר מכן, פתח את תוכנת EC epsilon והיכנס למצב פוטנציאל מעגל פתוח. הגדר את הזמן ל-300 דקות, סולם המתח לפלוס מינוס וולט, תדר הניתוק ל-10 קילו-הרץ ורשום גם את הערך כל שתי שניות.
תן ל-MAB להתייצב לפני שתמשיך בתהליך הכיול. לאחר מכן שטוף את תא הזרימה בתמיסת בדיקה והזריק את הריכוז הבא לכיול. ודא שאסור לבועות להיכנס לתא הזרימה.
חזור על מדידות עבור הדגימות הנותרות של עקומת הכיול לאחר הריצה האחרונה. הסר את ה-MAB וייבש אותו באוויר חנקן. הנח את ה-MAB בחזרה לתמיסת ריכוך טרייה עד הבא.
השתמש לכיול של MAB וסידן כלורי מצב ה-MAB עם מצומד פולימר מוליך סידן גופרתי pdot וממברנה סלקטיבית של סידן בן לילה ב-0.1 סידן כלורי מולרי ו-10 נתרן חנקתי מיקרו-מולרי. לאחר מכן החלף את תמיסות בדיקת ה- pH או הקרבונט בריכוז ראשוני של 0.01 מילימולרי סידן כלורי. חזור על הפעולה עבור ריכוזי תמיסת הבדיקה האחרים.
נתונים אלה מראים וולטה מחזורית של PSS pdot וזרם השיא הקתרטי המקביל לו לעומת קצב הסריקה. הניתוח הסוביקי של רנדל קובע שטח פנים אפקטיבי של 4.4 כפול 10 לסנטימטר ה-11 השלילי בריבוע עבור המגע המוצק ללא ממברנה סלקטיבית יונים. כמבחן של כל יכולת ה-ISE במצב מוצק לרכוש מדידות בסביבת תרבית התאים בפועל.
ISEs כוילו במדיה של Lgal עם pH שנע בין ארבעה לתשע לאחר 20 יום אחסון במדיום ה-lgal. כאן PDO PSS כויל בתמיסת קרבונט עם טווח ריכוזים של 0.01 מילי-מולרית עד מילי-מולרית אחת הן במדיום הביולוגי של ה-lgal והן במדיום הביולוגי של ה-lgal ב-pH 8.5. שימו לב לשינוי בריכוז עם הורדת המדרון עם התמיסה המבודדת.
האלקטרודה הסלקטיבית הקרבונטית תלויה ב-pH ועלייה במתח מתאמת לעלייה במיני הקרבונט. מכיוון שהמדידות נעשות ב-pH 7.8, רוב המינים הם בצורת ביקרבונט, מדידות ריכוז קרבונט עם מודל ביולוגי כלורלה וולגריס בתנאי אור וחושך סביבתיים מראות שינוי של 30 מילי-וולט, בקרה עם אמצעי אצות בלבד אינה מראה תגובה המעידה על ביו-צ'יפ פונקציונלי. MAB ISEs אלה מבוססים על PPSS בתמיסת סידן כלורי עם ריכוז הולך וגדל, פרופיל שיפוע קרוב לניאן לקטיון דו-ערכי ב-30 מילי-וולט לעשור.
שינוי בריכוז הסידן ישמש למדידת רמות זרם הסידן בשרך נובט. לגישה זו יש תועלת בביולוגיה, חקלאות ורפואה לחקר המנגנונים הביו-מולקולריים הכוללים הובלת יונים ואלקטרופיזיולוגיה ואיתות של תאים ומערכות צמחים ובעלי חיים.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה
מאמר זה מפרט את ייצור וכיול של אלקטרודות יונים סלקטיביות מסוג all-solid-state (ASSISEs) באמצעות מתמר פולימר מוליך. הוכח ש-ASSISEs שומרים על פרופיל שיפוע כמעט-נרנסטיאני לאחר אחסון ממושך במדיום ביולוגי מורכב, מה שמוכיח את הפוטנציאל שלהם לשימוש לטווח ארוך בסביבות נוזליות.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- אלקטרוכימיה
- ביוטכנולוגיה
- טכנולוגיית חיישנים
רקע
- אלקטרודות יונים סלקטיביות מסוג all-solid-state (ASSISEs) מציעות יתרונות על פני אלקטרודות מסורתיות.
- הן בנויות באמצעות פולימרים מוליכים, מה שמשפר את הפונקציונליות שלהן.
- אלקטרודות אלו יכולות לשמש למדידות בזמן אמת במערכות ביולוגיות.
- אחסון ממושך במדיום מורכב הוא גורם קריטי ליישומים מעשיים.
מטרת המחקר
- לפתח שיטה אמינה לייצור ASSISEs.
- לכייל את האלקטרודות לגילוי יונים מדויק.
- להדגים את אורך החיים והיציבות של ASSISEs בסביבות ביולוגיות.
שיטות ששימשו
- אלקטרו-פולימריזציה של שכבת מתמר פולימר מוליך.
- ציפוי ספין של שכבת קרום סלקטיבית ליונים.
- מיזוג של ביו-צ'יפים להפעלת הקרום הסלקטיבי ליונים.
- כיול האלקטרודות בתא זרימה עם הקלטת אותות בזמן אמת.
תוצאות עיקריות
- ASSISEs שמרו על פרופיל שיפוע כמעט-נרנסטיאני לאחר האחסון.
- הוכחו מדידות בזמן אמת של פעילות יונים.
- השיטה מאפשרת מולטיפלקסינג של מדידות.
- האופי הלא פולשני של ASSISEs מודגש כיתרון משמעותי.
מסקנות
- ASSISEs מראים הבטחה לשימוש לטווח ארוך ביישומים ביולוגיים שונים.
- שיטת הייצור יעילה וניתנת לשחזור.
- יישומים עתידיים עשויים לכלול אסטרוביולוגיה ותחומים אחרים הדורשים מערכות מדידה קומפקטיות.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
The multi-analyte biochip (MAB) enables real-time, multiplexed ion sensing in complex biological media, addressing a critical need for stable, long-term monitoring in discovery-stage physiological research. Its all-solid-state design using PEDOT transducer layers supports extended storage stability, reducing assay drift and improving data reliability for target validation workflows. This capability enhances predictive confidence in early discovery by providing quantitative, reproducible ion activity readouts that inform mechanistic de-risking of ion transport pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of ion flux dynamics in live biological systems to validate therapeutic targets involved in calcium, proton, or carbonate signaling.
- Operational Value: Supports hypothesis testing through real-time, non-invasive monitoring of ion activities without perturbing cellular physiology.
- Predictive Value: Provides near-Nernstian response after extended storage, increasing confidence in longitudinal data for pathway de-risking.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates stable, quantifiable potentiometric outputs for H+, Ca2+, and CO32- ions, enabling standardized screening conditions.
- Reproducibility: Demonstrates consistent calibration curves across biological media, supporting assay transferability between discovery and preclinical teams.
- Multiplexing Capacity: Integrates nine working electrodes on a single chip, allowing parallel ion profiling to accelerate lead identification efforts.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Enables physiological measurements in model systems like Chlorella vulgaris, supporting translational biomarker alignment for ion-related pathways.
- Preclinical Continuity: Maintains functional stability in algal medium for up to one month, facilitating longitudinal studies across discovery stages.
- Risk-Adjusted Advancement: Delivers reliable ion activity trends that inform go/no-go decisions based on electrophysiological readouts.
Pipeline & Workflow Integration
The MAB fits within the discovery continuum from early target validation through preclinical profiling by delivering quantitative ion activity data that supports hypothesis-driven screening and mechanistic follow-up.
- Discovery Biology: Supports functional validation of ion channels and transporters via real-time monitoring of H+, Ca2+, and CO32- fluxes in live cells.
- Screening: Enables reproducible, multiplexed ion sensing in microfluidic formats, improving throughput and data consistency in compound effect profiling.
- Analytics: Delivers potentiometric readouts with near-Nernstian slopes, allowing accurate comparison of ion activities across experimental conditions.
- Translational Research: Connects discovery-phase ion measurements to preclinical validation through stable performance in biological media.
- Enterprise Reuse: Designed for batch fabrication and conditioning, positioning the MAB as a reusable platform across multiple projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in ion signaling pathways through direct, label-free measurement of physiological ion activities.
- Operational Value: Eliminates need for frequent recalibration due to extended storage stability, improving workflow efficiency.
- Strategic Value: Increases confidence in early-stage data, supporting better go/no-go decisions and reducing late-stage biological failure risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on reliable ion flux profiles in disease-relevant systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electrochemistry and microfluidic interface design for proper electrode functionalization and signal acquisition.
- Depends on potentiostat or equivalent instrumentation capable of open-circuit potential measurement and real-time recording.
- Necessitates standardization of conditioning protocols (e.g., overnight incubation in bicarbonate/chloride media) across teams to ensure sensor reproducibility.
- Adaptation to mammalian cell systems may require optimization of ionic strength and biocompatibility of microfluidic materials.
- Practical limitation: Ion-selective membrane stability can be affected by prolonged exposure to surfactants or proteins, necessitating careful sample preparation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:25
Electropolymerization of PEDOT-based Conductive Polymer
3:20
Application of Ion-selective Membrane
3:53
Calibration of PEDOT-PSS Conductive Polymer Conjugate with pH and Carbonate (CO32-) Ion-selective Membrane
5:46
Results: Physiological Research Applications
7:42
Conclusion
