טכניקה פשוטה ויעילה להכנת השעיות תא אשכים

בסרטון זה יוצג פרוטוקול פשוט ויעיל מאוד להשגת השעיה סלולרית של חומר בדיקה ממכרסמים תוך 15 דקות בלבד. השיטה יושמה לבדיקת בדיקה מעכברים, שרקנים עכברושים ומשתמשת במכשיר מטא מכונה כדי לפרק את הרקמה העטופה. לאחר סינון וצביעה, יון התא מוכן לזרימה.

ניתוח או מיון ציטו הומוגניות של אוכלוסיות תאים היא תנאי מוקדם לניתוח אירועים ביוכימיים ומולקולריים במהלך התמיינות GA זכרית. לפיכך, הטרוגניות של האשכים עם למעלה מ-30 סוגי תאים שונים מייצגת את אחת הבעיות העיקריות הנוגעות לחקר הבסיס המולקולרי של זרע מיונקים. מסיבה זו, נעשה שימוש בשיטות שונות להשגת העשרה לאוכלוסיות תאי אשכים מטוהרות, כולל איור PU וצנטריפוגלי.

השלב הראשון לכל שיטת הפרדת תאים הוא הכנת תרחיף סלולרי. עם זאת, הפרוטוקולים הנוכחיים בדרך כלל גוזלים זמן ועשויים לרמוז על אובדן של מולקולות קצרות מועד כגון RNA, דבר שאינו רצוי לניתוח ביטוי נסתר. היתרון העיקרי של הפרוטוקול המוצג כאן הוא שמבטל שלבים בין הקרבת בעלי חיים למחקרים מולקולריים ספציפיים לשלב הזרע, אך יחד עם זאת מבטיח איכות טובה וייצוג מעולה של סוג התא בתרחיפים התאיים.

מי שידגים את ההליך יהיו ד"ר אנה רודריגז, חוקרת במעבדת AL שפיתחה את השיטה וציטומטריית זרימה של פדריקו סן לופז שהיו אחראים על הניתוח הציטומטרי. ההליך דורש ציוד קטן, מערכת ה-meach עם אביזרי ה-medicon וה-fcon שלה. עם זאת, ניתן להחליף את אביזרי ה-fcon בצורה מושלמת על ידי ממברנות ניילון באותו גודל נקבוביות.

החומרים והריאגנטים הנדרשים היחידים האחרים הם ממרח זכוכית, שתי כלים, מספריים ומלקחיים, תא מעיים מעצבן של מזרק של שלושה עד חמישה מיליליטר, מדיום תרבית DMM בתוספת סרום שיעול עוברי 10% ו-NDA. אם מתוכננים יישומים במורד הזרם הכוללים מניפולציות RNA, יש לטפל בכל החומרים והפתרונות בהתאם לביצוע הפרוטוקול. הנח את האשך המנותח בכוס של 96 מילימטר לפי הנתונים המוצגים קרח המכיל 10 מיליליטר של קרח נוסף הנקרא dm.

הסר את ה-TAL Virginia, חתוך את אשך ה-decap לחתיכות מרובעות של שניים עד שלושה מילימטרים מכל צד. הניחו ארבעה עד חמישה מהחלקים הללו במדיקון חד פעמי ללא הפרדה גזעית יחד עם מיליליטר אחד של קוד בתוספת D ומעובד במערכת המטא מכונה למשך 50 שניות. כל יחידה רפואית מכילה מסך נירוסטה קבוע עם כמאה חורים משושים המוקפים בשישה מיקרו להבים.

הרקמה מובאת לכל חור על ידי רוטור מתכת בתוך תא הרפואה ומבטלת את ההפרדה על ידי מעבר מעל החורים המושחזים ודרך מסך המתכת בזמן שמשאבת מיקרו מתחת למסך מספקת נוזלים ושוטפת את הגופות. שחזר את התוצאה בתרחיף תאים מהמדיקון באמצעות מזרק של שלושה עד חמישה מילימטר ללא מחט. לאחר מכן יש להשרות בז בגודל 50 מיקרומטר או אותה רשת ניילון בארבעה גדלים עם מדיום של חצי מיליליטר ולסנן דרכו את המתלה.

חזור על השלב, אך בעזרת רשת ניילון של 25 מיקרומטר או יחידת בז שווה ערך והניח על קרח, קח ציטוט ALI של תרחיף התא כדי לספור בתא נוייר והתאם את ריכוז התאים לאחד עד פעמיים 10 לשבעת התאים למיליליטר במצע התרבית. לבסוף, הוסף NDA לריכוז סופי של 0.2% כדי למנוע שאיבת תאים וגם כדי למנוע סתימת שרירים במהלך מחקרי הזרימה הבאים. אם מיועדת להעריך את כדאיות התאים, ניתן לבצע זאת באמצעות ערכת כדאיות מתים חיים לתאי בעלי חיים בהתאם להוראות היצרן לפני ניתוח זרימה ציטומטרי, הוסף צבע פלואורסצנטי.

בחירת הפלואורוכרום תהיה תלויה בלייזרים הזמינים. בהדגמה זו יוצג השימוש בצבעים שונים הקושרים מסמך ל-DNA. למרות שדיאטת פרופידיום יו היא הצבע הרגיל לתאים קבועים או מתים בריכוזים נמוכים, מצאנו שכאשר משתמשים בו בריכוזים גבוהים, ה-ROM נכנס לתאי אשך לא מקובעים בתרחיפים שהוכנו בשיטה המוצגת כאן.

זה כנראה נובע מהלחץ המכני המשתמע, אשר בשילוב עם האופי החושי של האפיתל הסמי-אלי עלול להוביל לשבירה של גשרים המחברים בין תא לתא עם מניפולציה מינימלית לצביעת פרופידיום יודיד 10 דקות לפני ניתוח הדגימה בתמיסה בריכוז סופי של 50 מיקרוגרם למיליליטר לתרחיף התא ודגירה של אפס מעלות צלזיוס בחושך לניתוח תאי כתמי פרופידיום מו. לצורך מיון נוסף, אנו משתמשים בציטומטר זרימת תצפית פקס המצויד בלייזר יוני טרגון קוהרנטי המכוון לפלוט ב-488 ננומטר. עוצמת הלייזר מוגדרת למאה מיליוואט והפלואורסצנציה הנפלטת מפרופידיום I נאספת בגלאי FL Two באמצעות מסנן 5 7 5 סלאש 26 פס.

השתמש בזרבובית של 70 מיקרומטר למדידות ציטומטריית זרימה ובתוכנת squa כדי לנתח את הפרמטרים הבאים. פיזור צד פיזור קדימה, סה"כ שטח הקרינה או הדופק הנפלט ומשך פליטת הפלואורסצנט או רוחב הדופק. התוצאות מוצגות בגרמים המייצגים את מספר האירועים בכל רמת פלואורסצנט ובתרשימים D המציגים פיזור צד לעומת שטח דופק פלואורסצנטי ושטח דופק פלואורסצנטי לעומת רוחבו.

כפולים אינם נכללים בניתוח באמצעות עלילות DO של שטח דופק פלואורסצנטי לעומת רוחבו למיון אוכלוסיות מונוציטים SM עם מצב מיון מוגדר של הפקס ב-R רגיל או C רגיל ומשתמשים בשלוש טיפות ממוינות כמעטפה. התאם את הפרש הדגימה לניתוח תאים בקצב של 500 עד 1500 לשנייה. שמור על צינורות דגימה ואיסוף שלוש עד ארבע מעלות צלזיוס באמצעות יחידת קירור.

לחלופין, ניתן לצבוע תאים בתרחיף בפלואורוכרומים אחרים. למשל, הצבע החיוני. ניתן להשתמש ב-HER 3 3 3 4 2 לריכוז סופי של חמישה מיקרוגרם למיליליטר ולדגור למשך 10 דקות לפחות ב-37 מעלות מוגן מאור עבור הירש.

3, 3, 3, 4, 2 דגימות כתמים. ניתוח התאים בוצע באמצעות ציטומטר זרימת MO המצויד בלייזר באורך גל עירור UV הפועל ב-25 מילי-וואט וזרבובית של 70 מיקרומטר. השתמש בתוכנת Summit 4.3 או דומה כדי לנתח את אותם פרמטרים שצוינו קודם לכן כאשר מתלי התאים מנותחים תחת ניגודיות פנים אופטיקה חיתוך מתלים איכותיים.

היתרונות העיקריים של פרוטוקול זה הם מלכתחילה תרחיפי תאי אשכים שהוכנו באמצעות המכונה הרבים ומקבלים רק 15 דקות כולל ניתוח קיסרי, חיתוך רקמות, ach, עיבוד מכונה וסינון זמן זה משתרע על כשמינית מהזמן שלוקח בדרך כלל פרוטוקולים אחרים. הקיצור של פרוטוקול זה יחד עם טיפול מינימלי מעורב יסביר את השימור הטוב של מקרומולקולות קצרות חיים, וזה קריטי כאשר נדרשת דגימה מייצגת של תרכובות הקיימות באוכלוסיית התאים המקורית. מכיוון שהמתאן כרוך בטיפול מינימלי, ניתן לשחזר אותו בקלות בטבלה זו.

האחוזים היחסיים של אוכלוסיות תאי האשכים השונות עבור שבעה ניסויים עצמאיים שבוצעו עם חולדות בוגרות ונותחו על ידי זרימה ציטומטרית מוצגים כדוגמה כדי להראות את יכולת השחזור של השיטה. בניגוד לרוב החלקיקים המשמשים כיום להכנת תרחיפי תאי אשכים, השיטה המוצגת כאן אינה כרוכה בפעולה אנזימטית. למרות שקולגנאז מטפטף ב-RNAs, שהם האנזימים הכלולים בדרך כלל תורמים להפרדה לא מספקת של הרקמה, הם יכולים להשפיע על שימור מקרומולקולות מעניינות.

היעדר טיפולים אנזימטיים לא רק מעדיף שימור RNA וחלבון, אלא גם הופך את הפרוטוקול לזול יותר. למרות שדווח בעבר כי תרחיפי תאים שהוכנו מכנית התגבשו בקלות רבה יותר מאשר תרחיפי תאים שעברו טריפס, מצאנו כי פרוטוקול זה מוביל לתרחיפי תאים מופרדים היטב בהיעדר פעולה אנזימטית me. הכללת NDA הוכחה כמועילה מאוד במניעת היווצרות תאים.

האיכות הטובה של המתלים ניכרת גם כאשר הדגימות עוברות ניתוח ציטומטרי כפי שנשפט על ידי פסולת התאים המינימלית שנצפתה. על פי מידע שפורסם, כ -13% מהזרעים העגולים נמצאים כמולטי-גרעינים או כאשר תרחיפי תאים מוכנים בשיטה מכנית בלעדית או בנוכחות טריפסין. עם זאת, מתלים רבים שהוכנו במכונה הופכים את הרב-גרעינים לנדירים מאוד, ככל הנראה בגלל הפחתת הסתבכות, שכן נאמר כי רב-גרעינים מיוצרים בעיקר כתוצאה ממניפולציה של רקמות.

דוגמה לתרחיף תאים רבים שהוכנו במכונה מאשך חולדה נצפית בתמונה זו. כפי שניתן לראות. ציטופלזמות נשמרות היטב, האחוזים היחסיים של אוכלוסיות תאי C, שניים, C וארבעה C בתרחיפי אשכים רבים שהוכנו במכונה עבור מכרסמים שונים, הרכיבו מחדש את אלה של PEs שלמים.

זה תומך בהנחה שהשיטה המתוארת כאן אינה פוגעת באופן סלקטיבי בסוג תא ספציפי כלשהו. באופן מפתיע, ייצוג סוג התא במתלים רבים שהוכנו במכונה נשמר הרבה יותר טוב מאשר בשיטות הכנת הטפטוף הקלאסיות. כפי שניתן לראות, גרפיקת ציטו המתקבלת עבור מתלי תאי אשכים מעובדים במיין אינה דוחה באופן משמעותי מאלה שדווחו בעבר.

למעשה, ההיסטוגרמות ועלילות הנקודות שהתקבלו מציגות את שלוש אוכלוסיות תאי האשכים האופייניות לארבע C עד C ו-C בהתבסס על תכולת ה-DNA כמו גם אוכלוסיית ה-subha לכאורה, המייצגת את הזרעונים הפלואידים המרוכזים ביותר. פרופילים אלה נצפו עבור תרחיפי כתמי יודיד מתמשכים או פרופידיום יודיד בהתאמה, וזה מייצג גם דגימות בוגרות וגם צעירות. מיון של תאים מיטוגניים של ספר הושג בהצלחה עם טוהר של למעלה מ-98%, בין אם עבור אוכלוסיות אשכים נבחרות על סמך תכולת DNA או אפילו עבור תת-אוכלוסיות עם אותו תכולת DNA, אך רמת עיבוי כרומטין שונה כגון שיניים שינה ומיוציטים שיניים.

כפי שיכולנו לראות בתרחיפי ניסוי שרקנים, מכיוון שהפרוטוקול אינו כולל טיפול ב-RNA, אוכלוסיות ממוינות מספקות איכות RNA טובה ומאפשרות מחקרי ביטוי גנים דיפרנציאליים גם עבור אוכלוסיות מוכתמות בפרופידיום יודיד. במובן זה, ראוי להזכיר שבניגוד לצבעים אחרים, כתמי יודיד פרופידיום, DNA כמו גם RNA דו-גדילי, אולם בגרפיקה זו של ניתוח מתלה אשכים של שרקנים, הפרופילים הדומים המתקבלים באמצעות יודיד פרופידיום במקביל לכתום מחזור תוסס. זהו צבע חיוני ספציפי ל- DNA המראה כי צביעת RNA אינה משפיעה באופן משמעותי על דפוסי ההיסטוגרמה הציטומטרית.

רשימה זו מסכמת את היתרונות העיקריים של פרוטוקול האחוזים. השיטה האופטימלית המתוארת כאן מאפשרת להאיץ את הכנת תרחיפי תאי האשכים המתאימים לניתוח ציטומטרי של שלבי זרע שונים ממכרסמים תוך 15 דקות בלבד, כולל דיסקציה של האשכים, חיתוך רקמות ועיבוד באמצעות מערכת מכונת ME. הקיצור, איכות השחזור הגבוהה יותר ופרופורציות סוג התא בתרחיפי התאים הופכים אותו לחלופה טובה לטכניקות הכנה עצמית אחרות, מייגעות יותר וגוזלות זמן הנמצאות בשימוש כיום.

יתר על כן, מכיוון ששיטה זו כרוכה במעט מאוד מניפולציה ונמנעת מאנזימים וחומרי ניקוי, זוהי בחירה אידיאלית ליישום עדין במורד הזרם כגון מחקרי ביטוי גנים.