Name: טכניקה פשוטה ויעילה להכנת השעיות תא אשכים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 33 s
Description: למד פרוטוקול מהיר וללא אנזימים להכנת השעיות תאי אשכים ממכרסמים תוך 15 דקות בלבד. השיטה שומרת על חיוניות התאים ועל שלמות מולקולות RNA לניתוח זרימה ולמחקרי ביטוי גנים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי CSIC (אני + D פרויקט C022) וPEDECIBA. המחברים מבקשים להודות לMariela Bollati ולנטינה Porro מיחידת הביולוגיה של התא (המכון פסטר דה מונטבידאו) לשיתוף הפעולה הנדיב שלהם בנוגע לסדרן תא MoFlo, וMerial-מונטווידאו לעדינות מספק את כל הדגימות שרקנו המשמשות בפרויקט זה. איור 1 שוחזר באישור ביומד המרכזי; איורים 2 ו -3, ולוח 1 באישורו של ס &#39;Karger AG, באזל, ואיורים 4 ו -5 היו לשכפל או מותאמים באישור של John Wiley &amp; Sons, Inc (זכויות יוצרים שבבעלות Wiley- בלקוול, 2011).

1. הכנת השעיות תא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב את הדגימה לשימוש בעקבות ההמלצות של הוועדות המיוחדות כגון IACUC (או שווה ערך באורוגוואי, הוועדה הלאומית לניסויים בבעלי החיים [CNEA]). במקרה שלנו, ממנת יתר של pentobarbital היה מנוהל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את האשכים בעקבות נהלים שאושרו סטנדרטיים ומניחים אותם בצלחת פטרי זכוכית 96 מ&quot;מ על קרח, המכיל 10 מ&quot;ל של DMEM קר כקרח בתוספת 10% נסיוב עגל עוברי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר albuginea Tunica ולחתוך את האשכים decapsulated לחתיכות מרובעות של 2 - 3 מ&quot;מ בכל צד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלקים אלה מעובדים מכן בMedimachine, מטחנה מכאנית אוטומטית שבו הרקמה מפוצלת בתוך יחידה חד פעמית המכילה מסך נירוסטה מחורר והרוטור מתכת. כדי לעשות זאת, מקום 1 מ&quot;ל של קר בתוספת DMEM ו4 - 5 החלקים הללו ביחידת 50 מיקרומטר חד פעמית, לעבור על disaggregator, ותהליך<html> 50 שניות לביצוע ההוראות הפשוטות מהיצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשחזר את ההשעיה תא וכתוצאה מיחידת disaggregation באמצעות 3 - 5 מ&quot;ל במזרק ללא מחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסנן דרך רשת ניילון מיקרומטר 50, ספגה בעבר עם 0.5 מ&quot;ל DMEM בתוספת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את ההשעיה שוב באמצעות רשת ספוגה 25 מיקרומטר ניילון, ומניח על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור בתא נויבאואר ולהתאים את הריכוז סלולרי ל1 - 2 x 10 7 תאים / מ&quot;ל עם DMEM בתוספת. לפחות 4 x 10 7 תאים / גרם חומר אשך בדרך כלל מתקבלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, להוסיף ל&quot;ד (2-naphthol-6 ,8-disulfonic חומצה, מלח dipotassium) לריכוז סופי של 0.2% על מנת למנוע הצטברויות תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונלי: לבדוק כדאיות תא של השעיות תא אשכים עם ערכת כדאיות זמינה מסחרי לתאים של בעלי חיים, בעקבות הוראות יצרן. </li></ol> 2. ניתוח תזרים cytometric ve_content &quot;&gt; השתמשנו cytometer זרימת FACSVantage בקטון דיקינסון-מצוידים בליזר יון ארגון קוהירנט מכוון לפלוט ב 488 ננומטר לניתוח תאים מוכתם בריכוזים גבוהים של יודיד propidium (PI). (הנושא של כניסה לצרכן מבולבל תאים תחת לחץ כבר התייחסו במקום אחר 9,10). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מכתים PI, להוסיף fluorochrome בריכוז סופי של 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​להשעית התא, ודגירה במשך 10 דקות ב 0 מעלות צלזיוס בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוח לייזר מוגדר 100 מגה ואט ולעבור סינון להקה 575/26 משמש לאיסוף הקרינה נפלטת-PI בfl2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנו מבצעים מדידות FC עם זרבובית 70 מיקרומטר. למיון אוכלוסיות spermatocyte, קבע מיון במצב רגיל-R או רגיל-C, באמצעות 3 טיפות ממוינות כמו מעטפה. שמרו על מדגם וצינורות איסוף ב3 - 4 מעלות צלזיוס באמצעות יחידת קירור. התאם ההפרש מדגם לנתח תאים בשיעור של 500 עד 1,500 לשנייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתוכנת CellQuest (BD) כדי לנתחאת הפרמטרים הבאים: פיזור קדימה (FSC-H); פיזור צד (SSC-H); הקרינה נפלטת כוללת או דופק אזור (fl2-), ומשך זמן של פליטת הקרינה או דופק ברוחב (fl2-W). </li></ol> לחלופין, יש לנו מועסקים צבע Hoechst החיוני 33342 לריכוז סופי של 5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​וטופחו במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בחושך. ניתוח תא בוצע באמצעות Cytometer MoFlo (DakoCytomation) המצוידים בהפעלת לייזר באורך גל עירור UV בMW 25 ובאמצעות זרבובית 70 מיקרומטר. מניפולציה של נתונים בוצעה עם תוכנת פסגת v4.3 (DakoCytomation).

<ol><li>Meistrich, M. L. Separation of spermatogenic cells and nuclei from rodent testes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMeistrich%2C+ML+%22Methods+of+Cell+Biology%22">Methods of Cell Biology</a>. Prescott, D. M. 15, Academic Press. New York. 15-54 (1977).</li>
<li>Lam, D. M. K., Furrer, R., Bruce, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+separation%2C+physical+characterization%2C+and+differentiation+kinetics+of+spermatogonial+cells+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">The separation, physical characterization, and differentiation kinetics of spermatogonial cells of the mouse.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 65, 192-199 (1970).</li>
<li>Romrell, L. J., Bellve, A. R., Fawcet, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+mouse+spermatogenic+cells+by+sedimentation+velocity%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity.</a> Dev. Biol. 19, 119-131 (1976).</li>
<li>Geisinger, A., Rodríguez-Casuriaga, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+for+gene+expression+studies+in+mammalian+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenet.+Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry for gene expression studies in mammalian spermatogenesis.</a> Cytogenet. Genome Res. 128, 46-56 (2010).</li>
<li>Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+purification+of+mouse+meiotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry purification of mouse meiotic cells.</a> J. Vis. Exp. (50), e2602(2011).</li>
<li>Meistrich, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+mouse+spermatogenic+cells+by+velocity+sedimentation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Separation of mouse spermatogenic cells by velocity sedimentation.</a> J. Cell Physiol. 80, 299-312 (1972).</li>
<li>Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+composition+of+fractions+of+mouse+testis+cells+following+velocity+sedimentation+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation.</a> Exp. Cell Res. 79, 213-227 (1973).</li>
<li>Malkov, M., Fisher, Y., Don, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+schedule+of+the+postnatal+rat+testis+determined+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Rep%22%5BJournal%5D)">Developmental schedule of the postnatal rat testis determined by flow cytometry.</a> Biol. Rep. 59, 84-92 (1998).</li>
<li>Rodríguez-Casuriaga, R., Geisinger, A., Santiñaque, F., López, B., Folle, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-purity+flow+sorting+of+early+meiocytes+based+on+DNA+analysis+of+guinea+pig+spermatogenic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">High-purity flow sorting of early meiocytes based on DNA analysis of guinea pig spermatogenic cells.</a> Cytometry A. 79, 625-634 (2011).</li>
<li>Davey, H. M., Hexley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+but+not+dead%3F+Membranes+of+stressed+Saccharomyces+cerevisiae+are+permeable+to+propidium+iodide%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Red but not dead? Membranes of stressed Saccharomyces cerevisiae are permeable to propidium iodide.</a> Environ. Microbiol. 13, 163-171 (2011).</li>
<li>Rodríguez-Casuriaga, R., Geisinger, A., López-Carro, B., Porro, V., Wettstein, R., Folle, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-fast+and+optimized+method+for+the+preparation+of+rodent+testicular+cells+for+flow+cytometric+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Proced.+Online%22%5BJournal%5D)">Ultra-fast and optimized method for the preparation of rodent testicular cells for flow cytometric analysis.</a> Biol. Proced. Online. 11, 184-195 (2009).</li>
<li>Spanò, M., Evenson, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+for+reproductive+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis for reproductive biology.</a> Biol Cell. 78, 53-62 (1993).</li>
</ol>

השיטה האופטימלית המתוארת כאן מאפשרת הכנה של השעיות תא מרקמת אשך מכרסם בדרך מהירה ולשעתק מאוד, הימנעות מטיפול אנזים וחומר ניקוי ושמירה על שלמות תא טובה ופרופורציות סוג. קיצורו של הנוהל (תוחלת 15 דקות כוללת נתיחת אשך, חיתוך רקמות, ועיבוד), הטיפול מינימאלי המעורבים, והיעדר טיפולים אנזימטיים הוא כמה מהיתרונות העיקריים. כל אלה יכולים להסביר את השימור הטוב של מקרומולקולות חיים קצרות, שהוא קריטי כאשר נדרש מדגם מייצג של תרכובות הנמצאות באוכלוסיית התא המקורית. <p class="jove_content" s...

<table><tbody><tr><td>מערכת מדימכונת</td><td>BD</td><td>340587</td><td></td></tr><tr><td>יחידת Medicon (50 &mu; m)</td> <td>יחידת BD</td><td>340591</td><td></td></tr><tr><td>Filcon (50 &mu; m)</td><td>BD</td><td>340603</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>430-2100</td><td></td></tr><tr><td>סרום עגל עוברי</td><td>PAA</td><td>A11-151</td><td></td></tr><tr><td>NDA</td><td>Chemos BmbH</td><td>277081</td><td></td></tr><tr><td>H&#8211; chst 33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14533</td><td>תמיסת מלאי 5 מ"ג/מ"ל; משמש בריכוז סופי של 5 &mu; גרם/מ"ל</td></tr><tr><td>תמיסת ציר Propidium iodide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>287075</td> 1 <td>מ"ג/מ"ל; בשימוש בריכוז סופי של 50 &mu; גרם/מ"ל</td></tr></tbody></table>

טכניקה פשוטה ויעילה להכנת השעיות תא אשכים

Simple and Efficient Technique for the Preparation of Testicular Cell Suspensions

אשכים יונקים הם איברים מורכבים מאוד המכילים יותר מ -30 סוגי תאים שונים, כוללים תאים הסומטיים אשכים ושלבים של תאי germline שונים. ההטרוגניות הזאת היא חסרון מהותי הנוגע למחקר מהבסיסים של spermatogenesis יונקים, כפי שאוכלוסיות תאים טהורות או מועשרת בשלבים מסוימים של התפתחות זרע יש צורך ברוב הניתוחים מולקולריים 1. אסטרטגיות שונות כגון 2,3 Staput, elutriation צנטריפוגלי 1, וcytometry הזרימה (FC) 4,5 להיות מועסקת להשיג אוכלוסיות תאי אשכים מועשרים או מטוהרים על מנת לאפשר ביטוי במחקרי גן דיפרנציאלי. נדרש כי תאים בתרחיף עבור רוב ההעשרה / טיהור גישות. באופן אידיאלי, את ההשעיה התא תהיה נציג של הרקמה המקורית, יש שיעור גבוה של תאי קיימא וכמה multinucleates - שנוטים להיווצר בגללטבע סינסיציאלי של האפיתל seminiferous 6,7 - וגושי תאי חוסר 1. דיווחים קודמים שמעידים כי השעיות תא אשכים שהוכנו על ידי שיטה מכאנית באופן בלעדי בכבדות בקלות רבה יותר מאשר אלה trypsinized 1. מצד השני, טיפולים אנזימטיים עם RNases ו / או אנזימי ריסוק כמו טריפסין וcollagenase להוביל לפירוק מולקולות ספציפי, אשר אינו רצוי עבור יישומים במורד הזרם מסוימים. התהליך האידיאלי צריך להיות קצר ככל האפשר, וכרוך במניפולציה מינימאלית, כדי להשיג שימור טוב של מולקולות של עניין, כגון mRNAs. פרוטוקולים הנוכחיים להכנת תאים מרקמות מוצקות מתלים הם בדרך כלל זמן רב, מאוד תלויים במפעיל, ועלולים לפגוע באופן סלקטיבי תאים מסוגים מסוימים 1,8. הפרוטוקול המובא כאן משלב את היתרונות של disaggregation מכאני לשעתקו מאוד וקצר מאוד עםbsence האנזימטית של טיפול, מה שמוביל להשעיות תא באיכות טובות, שניתן להשתמש בם לניתוח תזרים cytometric ומיון 4, ומחקרי ביטוי גנים נסתרים 9.

דוגמה של השעיה תא היטב פירוט רחב מאשכי עכברים שהוכנו עם הפרוטוקול המתואר כאן מוצגת באיור 1. בהשוואה לטיפולים אנזימטיות 6,8 ולשיטות שתוארו לעיל disaggregation מכאניים 2, אחד המוצג כאן הוא הרבה יותר מהר, כרוך בפחות טיפול, הוא לשחזור בקלות (לא מפעיל תלוי), והופך את פסולת תא נדירה (במיוחד בהשוואה למכונות אחרות שיטות) ומעט מאוד multinucleates (שכבר תאר בצורה כתוצאה של מניפולציה ר...

פרוטוקול חדש להכנה מכאנית של השעיות אשכים סלולריים מחומר מכרסם, הימנעות אנזימים וחומרי ניקוי, מתואר. השיטה היא מאוד פשוטה, מהירה, לשחזור, והופכת השעיות תא באיכות טובות, אשר מתאימות למיון זרימה ומיצוי RNA.

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline ...

בסרטון זה יוצג פרוטוקול פשוט ויעיל מאוד להשגת תרחיף תאים מחומר בדיקה ממכרסמים תוך 15 דקות בלבד. השיטה יושמה על דגימות מעכברים, חולדות וחזירי ים, והיא משתמשת במכשיר מטא-משינה (meta machine) כדי לפרק את הרקמה העטופה. לאחר סינון וצביעה, תרחיף התאים מוכן לבדיקה בזרם זרימה (flow cytometry).ניתוח ציטומטרי או מיון: הומוגניות של אוכלוסיות תאים היא תנאי מקדים לניתוח אירועים ביוכימיים ומולקולריים במהלך התמיינות GA זכרית. לפיכך, ההטרוגניות האשכולית, הכוללת למעלה מ-30 סוגי תאים שונים, מהווה אחת מהבעיות המרכזיות במחקר של הבסיס המולקולרי של ספרמטוגנזה ביונקים. מסיבה זו, נעשה שימוש בשיטות שונות כדי להשיג אוכלוסיות תאים אשכוליות מועשרות או מטוהרות, כולל PU והפרדה צנטריפוגלית.השלב הראשון בכל שיטה להפרדת תאים הוא הכנת סספנסיה תאית. עם זאת, פרוטוקולים נוכחיים הם בדרך כלל גוזלי זמן ועשויים להוביל לאובדן של מולקולות בעלות זמן מחצית קצר, כגון RNAs, דבר שאינו רצוי עבור ניתוחי ביטוי מאוחרים יותר. היתרון המרכזי של הפרוטוקול המוצג כאן הוא ביטול של שלבים בין הקרבת בעל החיים לבין מחקרים מולקולריים ספציפיים לשלבי זרע, ובעודו מבטיח איכות טובה וייצוג מצוין של סוגי התאים בסספנסיות התאיות.את הפרוצדורה תדגים ד"ר Ana Rodriguez, חוקרת ב-AL Laboratory שפיתחה את השיטה, יחד עם Federico San Lopez, מומחה לציטומטריה של הזרימה שהיה אחראי על הניתוח הציטומטרי. הפרוצדורה דורשת ציוד קטן, מערכת meach, עם אביזרי ה-medicon וה-fcon שלה. עם זאת, ניתן להחליף את אביזרי ה-fcon בממברנות ניילון בעלות גודל נקבוביות זהה.החומרים והריאגנטים הנוספים הדרושים הם לוחית זכוכית למריחה, שתי צלחות, מספריים ופינצטה, מזרק של 3 עד 5 מיליליטר, תא מעי, מצע גידול DMEM המועשר ב-10% fetal calf serum ו-NDA. במידה ומתוכננים יישומים המשכיים הכוללים מניפולציות של RNA, יש להתייחס לכל החומרים והתמיסות בהתאם לביצוע הפרוטוקול. העבר את האשך המנותח לכלי זכוכית של 96 מילימטר המונח על קרח ומכיל 10 מיליליטר של DMEM מועשר ומקורר.הסר את ה-TAL Virginia, וחתוך את האשך ללא הראש לחתיכות ריבועיות של שני עד שלושה מילימטרים בכל צד. הנח ארבעה עד חמישה מחלקים אלו בתוך medicon חד-פעמי המופרד, יחד עם מיליליטר אחד של code מועשר ב-D, ועבד במערכת meta machine למשך 50 שניות. כל יחידה רפואית מכילה מסנן פלדת אל חלון קבוע עם כמאה חורים משושים המוקפים בשישה מיקרו-להבים.הרקמה מובאת לכל חור על ידי רוטור מתכת בתוך תא המדיקון (medicon) ומפורקת על ידי מעבר מעל החורים המשחזים ובדרך דרך מסנן המתכת, בעוד שמיקרו-משאבה מתחת למסנן מספקת נוזל ושוטפת את הקליפות. אספו את התוצאה בתרחף תאים מהמדיקון באמצעות מזרק של שלושה עד חמישה מילימטרים ללא מחט. לאחר מכן, השרו רשת ניילון במיקרון 50 של פלקון (falcon) או רשת ניילון דומה בגודל של ארבעה מיקרון בחצי מיליליטר מצע, וסננו דרכה את התרחף.חזור על השלב, אך השתמש ברשת ניילון של 25 µm או ביחידת falcon שקולה והנח על קרח, קח דגימת ALI של תרחיף התאים לספירה בתוך תא נויר (noyer chamber) וכוונן את ריכוז התאים למספר של 1 עד 2 כפול 10⁷ תאים ל-mL במצע תרבית. לבסוף, הוסף NDA לריכוז סופי של 0.2% כדי למנוע התקבצות תאים וכן כדי למנוע סתימות של המכשיר במהלך בדיקות זרימה עוקבות. במידה וישנה כוונה להעריך את חיוניות התאים, ניתן לבצע זאת באמצעות ערכת בדיקת חיוניות (live dead viability kit) לתאי בעלי חיים לפי הוראות היצרן; לפני הניתוח בציטומטריה של זרימה, הוסף צבע פלואורסצנטי.בחירת הפלואורוכרום תלויה בלייזרים הזמינים. בהדגמה זו, יוצג השימוש בצבעים שונים הנקשרים ל-DNA. למרות ש-propidium iodide הוא הצבע המקובל לתאים מקובעים או מתים בריכוזים נמוכים, מצאנו כי כאשר הוא משמש בריכוזים גבוהים, ה-PI חודר לתאים טסטוסטרונליים שאינם מקובעים בסוסיפנסיות שהוכנו בשיטה המוצגת כאן.סביר להניח שהדבר נובע מהמאמץ המכני הכרוך בכך, אשר בשילוב עם אופיו התחושתי של אפיתליון הזרע עלול להוביל לשבירה של גשרי החיבור בין התאים במינימום מניפולציה. לצביעה ב-propidium iodide, 10 דקות לפני ניתוח הדגימה, הוסיפו לתליה התאים את התמיסה בריכוז סופי של 50 µg/mL והדגירו ב-0 °C בחושך. לניתוח צביעת propidium iodide. למיון נוסף, השתמשנו בציטומטר זרימה מסוג FACS Vantage המצויד בלייזר ארגון (argon) קוהרהנט המכוון לפליטה ב-488 nm. עוצמת הלייזר נקבעה ל-100 mW, והפלואורסצנציה הנפלטת מה-propidium iodide נאספה על ידי גלאי FL2 באמצעות פילטר band pass של 575/26 nm.השתמשו בנחיר (nozzle) של 70 µm למדידות בציטומטריה של זרימה ובתוכנת squa כדי לנתח את הפרמטרים הבאים: פיזור קדמי (Forward scatter), פיזור צדי (side scatter), פלואורסצנציה פולטת כוללת או שטח פולס (pulse area), ומשך הפליטות הפלואורסצנטיות או רוחב פולס (pulse width). התוצאות מוצגות כגרפים המייצגים את מספר האירועים בכל רמת פלואורסצנציה, ובגרפי D המציגים פיזור צדי לעומת שטח פולס פלואורסצנטי, ושטח פולס פלואורסצנטי לעומת רוחבו.דובלטים מוחרגים מהניתוח באמצעות תרשימי DO של שטח הפולס הפלואורסצנטי לעומת רוחבו עבור מיון אוכלוסיות של מונוציטים SM, כאשר מצב המיון ב-fax vantage מוגדר כ-normal R או normal C, תוך שימוש בשלוש טיפות ממוינות כמעטפה. כוון את הדיפרנציאל של הדגימה כדי לנתח תאים בקצב של 500 עד 1500 לשנייה. שמור את מבחנות הדגימה והאיסוף בטמפרטורה של שלושה עד ארבעה מעלות celsius באמצעות יחידת קירור.לחלופין, ניתן לצבוע את התאים בסבספנסיה באמצעות פלואורוכרומים אחרים. למשל, ניתן להשתמש בצבע החיוני HER 3 3 3 4 2 בריכוז סופי של 5 µg/mL ולהדגיר למשך 10 דקות לפחות ב-37 °C, תוך הגנה מהאור, עבור Hirsch.3, 3, 3, 4, 2 דגימות צביעה. ניתוח התאים בוצע באמצעות ציטומטר זרימה MO המצויד בלייזר באורך גל עירור UV הפועל בעוצמה של 25 milliwatts ודיזה של 70 micrometer. השתמש בתוכנת Summit 4.3 או בתוכנה דומה כדי לנתח את אותם הפרמטרים שצוינו קודם לכן, כאשר תליית התאים מנותחת תחת אופטיקת ניגודיות פנים ונצפות תלייות באיכות חיתוך טובה.היתרונות המרכזיים של פרוטוקול זה הם, ראשית, הכנת תרחיפי תאי אשך באמצעות מכונה וקבלתם תוך 15 דקות בלבד, כולל חיתוך רקמה, עיבוד במכונה וסינון; פרק זמן זה מהווה כשמיניאט מהזמן הנדרש בדרך כלל בפרוטוקולים אחרים. קצרו של פרוטוקול זה, יחד עם מינימום טיפול ידני, מסבירים את השימור הטוב של מקרו-מולקולות בעלות חיי מדף קצרים, דבר שהוא קריטי כאשר נדרש מדגם מייצג של תרכובות הנמצאות באוכלוסיית התאים המקורית. מכיוון שהשיטה כרוכה במינימום טיפול ידני, היא ניתנת לשחזור קל בטבלה זו.האחוזים היחסיים של אוכלוסיות תאי אשכים שונות עבור שבעה ניסויים עצמאיים שבוצעו בחולדות בוגרות ונותחו באמצעות ציטומטריה של זרימה מוצגים כדוגמה להדגמת השחזוריות של השיטה. בניגוד למרבית החלקיקים המשמשים כיום להכנת תלחי תאי אשכים, השיטה המוצגת כאן אינה כוללת פעילות אנזימטית. אף על פי שטיפות קולגנאז ב-RNAs, שהם האנזימים הנכללים בדרך כלל, תורמות להפרדה לא מספקת של הרקמה, הן עלולות להשפיע על השימור של מקרומולקולות רלוונטיות.היעדר טיפולים אנזימטיים לא רק תורם לשימור ה-RNA והחלבונים, אלא גם הופך את הפרוטוקול לזול יותר. למרות שדווח בעבר שתרחיפי תאים שהוכנו באופן מכני נוטים להצטבר (clump) בקלות רבה יותר מאלו שעברו טיפול בטריפסין, מצאנו כי פרוטוקול זה מוביל לתרחיפי תאים מופרדים היטב גם בהיעדר פעילות אנזימטית. הוספת NDA הוכחה כסיוע רב במניעת הצטברות תאים.האיכות הטובה של התרחופים ניכרת גם כאשר הדגימות עוברות אנליזה ציטומטרית, כפי שניתן להסיק מכמות השאריות התאיות המזערית שנצפתה. על פי מידע שפורסם, כ-13% מהזרעות העגולות נמצאות כרב-גרעיניות, הן כאשר תרחופי התאים מכינים בשיטה מכנית בלבד והן בנוכחות טריפסין. עם זאת, תרחופים רבים שהוכנו במכונה מראים כמות מועטה מאוד של תאים רב-גרעיניים, ככל הנראה בשל הפחתת הסבכים, שכן נטען כי תאים רב-גרעיניים נוצרים בעיקר כתוצאה ממניפולציה של הרקמה.בתמונה זו ניתן להבחין בדוגמה של תרחיף תאים שהוכן באמצעות מכונת Many-Machine מאשכים של חולדה. כפי שניתן לראות, הציטופלזמה נשמרה היטב; האחוזים היחסיים של אוכלוסיות תאי 2C ו-4C בתרחיפים אשכיים שהוכנו ב-Many-Machine עבור מכרסמים שונים היו דומים לאלו של ה-PEs השלמים.דבר זה תומך בהנחה שהשיטה המתוארת כאן אינה גורמת לנזק סלקטיבי לסוג תא ספציפי כלשהו. באופן מפתיע, ייצוג סוגי התאים בתרחיפים רבים שהוכנו באמצעות מכונה נשמר בצורה טובה בהרבה מאשר בשיטות ההכנה הקלאסיות המבוססות על טפטוף. כפי שניתן לראות, הגרפים הציטומטריים שהתקבלו עבור תרחיפי תאי אשכים שעובדו בשיטה זו אינם שונים באופן מהותי מאלו שדווחו בעבר.למעשה, ההיסטוגרמות וגרפי הנקודות (dot plots) שהתקבלו מציגים את שלוש אוכלוסיות תאי האשכים האופייניות בעלות תוכן DNA של 4C, 2C ו-C, כמו גם את אוכלוסיית ה-subha הגלומה, המייצגת את תאי הזרע ההפלואידיים הדחוסים מאוד. פרופילים אלו נצפו הן בתרחיפים צבועים ב-Hoechst והן בתרחיפים צבועים ב-propidium iodide, וזאת הן עבור פרטים בוגרים והן עבור פרטים צעירים. מיון של תאי זרע בשלבי התפתחותם הושג בהצלחה ברמת טוהר של מעל 98%, הן עבור אוכלוסיות אשכים נבחרות על בסיס תוכן ה-DNA והן עבור תתי-אוכלוסיות בעלות תוכן DNA זהה אך ברמות דחיסות שונות של כרומטין, כגון spermatids ו-spermatocytes.כפי שניתן היה להבחין בתמיסות בדיקה של חזירים גינאיים, מכיוון שהפרוטוקול אינו כולל טיפול ב-RNA, אוכלוסיות ממוינות מציגות איכות RNA טובה ומאפשרות מחקרי ביטוי גנים דיפרנציאלי, אפילו עבור אוכלוסיות שצבעו ב-propidium iodide. במובן זה, ראוי להזכיר כי בניגוד לצבעים אחרים, propidium iodide צובע DNA וכן RNA דו-גללי; עם זאת, בגרפים אלו של ניתוח תמיסות מאשכים של חזיר גינאי, הפרופילים הדומים שהתקבלו בשימוש ב-propidium iodide במקביל ל-viable dye orange, שהוא צבע ספציפי ל-DNA, מראים כי צביעת RNA אינה משפיעה באופן משמעותי על דפוסי ההיסטוגרמה הציטומטריים.רשימה זו מסכמת את היתרונות העיקריים של הפרוטוקול המוצג. השיטה האופטימלית המתוארת כאן מאפשרת להאיץ את הכנתם של תרחיפי תאי אשכים מתאימים לניתוח ציטומטרי של שלבי זרע שונים ממכרסמים תוך 15 דקות בלבד, כולל דיסקציה של האשכים, חיתוך רקמות ועיבוד באמצעות מערכת מכונת ה-ME. הקוצר, איכות השחזור הגבוהה יותר ופרופורציות סוגי התאים בתרחיפי התאים הופכים אותה לחלופה טובה לטכניקות הכנה עצמיות אחרות, מייגעות וגוזלות זמן יותר, הנמצאות כיום בשימוש.יתרה מכך, מכיוון ששיטה זו כרוכה במניפולציה מועטה מאוד ונמנעת משימוש באנזימים ובדטרגנטים, היא מהווה בחירה אידיאלית ליישומים רגישים בהמשך התהליך, כגון מחקרי ביטוי גנים.

simple-efficient-technique-for-preparation-testicular-cell

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

Dissociating תאים סוגי רקמות ספציפיות דורש פרמטרים ספציפיים aggitation רקמות לקבל כמות גדולה של תאים קיימא culturable. GentleMACS Miltenyi Dissociator מייעל את המשימה עם פרוטוקול, פשוט מעשית. בפרסום זה השימוש במנגנון הזה על רקמת nerual הוא הסביר.

הדור של תא בודד מרקמת השעיות עכבר עצבית

סרטון זה מדגים את הליך הבידוד של תאי סרטולי מצינוריות זרע של עכברים, מרכיב באשכים. עיכול אנזימטי ושטיפות חוזרות ונשנות מקדמים את שחרורם של תאי סרטולי לתמיסה, אשר ניתן לגדל בתרבית נוספת לצורך התרבות וצמיחה.

בידוד תאי סרטולי בקרה חיסונית מצינוריות זרע עכבר

שיטה פשוטה לגזור ולשמור גזע spermatogonial ושורות תאי אב מעכברים בוגרים מוצגת כאן. השיטה מנצלת תאים מזינים שמקורם מתא תא סומטי מאשכי העכברים הבוגרים. טכניקה זו היא ישימה זנים נפוצים, כוללים עכבר מהונדס מוחץ, ולדפוק בעכברים.

העשרה סידורית של גזע Spermatogonial ותאי אב (SSCs) בתרבות לגזירת קווי SSC מאוסים למבוגרים לזמן ארוך

שיטת STA-PUT מאפשרת הפרדה של אוכלוסיות שונות של תאי spermatogenic בהתבסס על גודל וצפיפות.

הפרדה של סוגי תאי Spermatogenic שימוש בשקיעה מהירות STA-PUT

החומר כאן מתאר שיטה שפותחה כדי לשמר את מבנה הכרומטין התלת מימדי של תאי נבט האשכים. שיטה זו נקראה שיטת השקופית התלת-ממדית (תלת-ממדית). שיטה זו משפרת את הרגישות לגילוי מבנים תת-גרעיניים והיא ישימה עבור פלואורסצנטיות חיסונית, דנ"א ופלואורסצנטיות RNA בהכלאה במקום (FISH).

שיטת הכנת שקופיות לשמירה על ארכיטקטורת כרומטין תלת מימדית של תאי נבט האשכים

תאי Sertoli הראשי נדרשים ללימוד זכות testis-אימוניות, הולך אותות בזמן דלקת או זיהום, וניצול של נכסי immunoprotective שלהם. כאן אנו מתארים פרוטוקול אנזים המבוסס עבור בידוד של תאי Sertoli העיקרי נקיים במיוחד ותאי peritubular מן אשכי חולדה.

תאי בידוד של תאי Sertoli ו Peritubular מן חולדת האשכים

עבודה זו מתארת ​​את סטנדרטיזציה של שיטה להשיג אוכלוסיות תאים נבט מטופלים מרקמת האשכים של מינים שונים של יונקים. זהו פרוטוקול פשוט המשלב דיסוציאציה פשוטה מכנית, מכתים עם Hoechst-33342 ו propidium iodide, ו FACS מיון, עם יישומים רחב במחקרים השוואתיים של ביולוגיה הרבייה הגברית.

גישה סטנדרטית עבור multispecies טיהור תאים יונקים זכר יונקים על ידי דיסוציאציה רקמות מכנית זרימת cytometry

מוצג כאן הוא פרוטוקול עבור העשרת החומר העשיר pachytene, עגול spermatocytes, ו להאריך spermatocytes מתוך האשכים עכבר למבוגרים באמצעות סרום מתמשך פרה אלבומין הדרגתי עם מעבדה סטנדרטית ציוד.

העשרה של פכיטנא ספרציטים וספרטידים מאשכים עכבר באמצעות ציוד מעבדה סטנדרטית

לכאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור הדור הניתן להתרבות של אורגנואידים האשך של חזירי עם ארכיטקטורת רקמה ספציפית בראש באמצעות מערכת התרבות הזמינה מסחרית למיקרוגל.

הדור של מבנה האשך של פורצין עם הארכיטקטורה הספציפית ביותר באמצעות התרבות של המיקרוגל

כאן, ארבע שיטות ליצירת אורגנואידים אשכים מתאי אשכים מורין ילודים ראשוניים מתוארים כלומר, מטריצה חוץ תאית (ECM) וסביבות תרבות 2D ותלת-מיוד ללא ECM. טכניקות אלה יש יישומי מחקר מרובים והם שימושיים במיוחד ללימוד פיתוח האשכים ופיזיולוגיה במבחנה.

אקסטרה סלולר מבוסס מטריצה ודור נוסף ללא מטריקס סלולרי של אורגנואידים אשכים Murine

כאן אנו מציגים שיטה פשוטה ויעילה לבודד תאי חיידקים מיוטיים ופוסט-מיוטיים חיים מערכי עכבר בוגרים. באמצעות ציטוקסיות נמוכה, צבע מחייב DNA סגול-נרגש ומיון תאים המופעלים על-ידי פלואורסצנה, ניתן לבודד אוכלוסיות תאי זרע מועשרים מאוד עבור יישומים רבים במורד הזרם.

בידוד של תאי זרע מורין באמצעות צבע מחייב DNA סגול-נרגש תא חרוש

למד פרוטוקול מהיר וללא אנזימים להכנת השעיות תאי אשכים ממכרסמים תוך 15 דקות בלבד. השיטה שומרת על חיוניות התאים ועל שלמות מולקולות RNA לניתוח זרימה ולמחקרי ביטוי גנים.

טכניקה פשוטה ויעילה להכנת השעיות תא אשכים

גלה סרטונים נוספים