טכניקה פשוטה ויעילה להכנת השעיות תא אשכים

בסרטון זה יוצג פרוטוקול פשוט ויעיל מאוד להשגת תרחיף תאים מחומר בדיקה ממכרסמים תוך 15 דקות בלבד. השיטה יושמה על דגימות מעכברים, חולדות וחזירי ים, והיא משתמשת במכשיר מטא-משינה (meta machine) כדי לפרק את הרקמה העטופה. לאחר סינון וצביעה, תרחיף התאים מוכן לבדיקה בזרם זרימה (flow cytometry).

ניתוח ציטומטרי או מיון: הומוגניות של אוכלוסיות תאים היא תנאי מקדים לניתוח אירועים ביוכימיים ומולקולריים במהלך התמיינות GA זכרית. לפיכך, ההטרוגניות האשכולית, הכוללת למעלה מ-30 סוגי תאים שונים, מהווה אחת מהבעיות המרכזיות במחקר של הבסיס המולקולרי של ספרמטוגנזה ביונקים. מסיבה זו, נעשה שימוש בשיטות שונות כדי להשיג אוכלוסיות תאים אשכוליות מועשרות או מטוהרות, כולל PU והפרדה צנטריפוגלית.

השלב הראשון בכל שיטה להפרדת תאים הוא הכנת סספנסיה תאית. עם זאת, פרוטוקולים נוכחיים הם בדרך כלל גוזלי זמן ועשויים להוביל לאובדן של מולקולות בעלות זמן מחצית קצר, כגון RNAs, דבר שאינו רצוי עבור ניתוחי ביטוי מאוחרים יותר. היתרון המרכזי של הפרוטוקול המוצג כאן הוא ביטול של שלבים בין הקרבת בעל החיים לבין מחקרים מולקולריים ספציפיים לשלבי זרע, ובעודו מבטיח איכות טובה וייצוג מצוין של סוגי התאים בסספנסיות התאיות.

את הפרוצדורה תדגים ד"ר Ana Rodriguez, חוקרת ב-AL Laboratory שפיתחה את השיטה, יחד עם Federico San Lopez, מומחה לציטומטריה של הזרימה שהיה אחראי על הניתוח הציטומטרי. הפרוצדורה דורשת ציוד קטן, מערכת meach, עם אביזרי ה-medicon וה-fcon שלה. עם זאת, ניתן להחליף את אביזרי ה-fcon בממברנות ניילון בעלות גודל נקבוביות זהה.

החומרים והריאגנטים הנוספים הדרושים הם לוחית זכוכית למריחה, שתי צלחות, מספריים ופינצטה, מזרק של 3 עד 5 מיליליטר, תא מעי, מצע גידול DMEM המועשר ב-10% fetal calf serum ו-NDA. במידה ומתוכננים יישומים המשכיים הכוללים מניפולציות של RNA, יש להתייחס לכל החומרים והתמיסות בהתאם לביצוע הפרוטוקול. העבר את האשך המנותח לכלי זכוכית של 96 מילימטר המונח על קרח ומכיל 10 מיליליטר של DMEM מועשר ומקורר.

הסר את ה-TAL Virginia, וחתוך את האשך ללא הראש לחתיכות ריבועיות של שני עד שלושה מילימטרים בכל צד. הנח ארבעה עד חמישה מחלקים אלו בתוך medicon חד-פעמי המופרד, יחד עם מיליליטר אחד של code מועשר ב-D, ועבד במערכת meta machine למשך 50 שניות. כל יחידה רפואית מכילה מסנן פלדת אל חלון קבוע עם כמאה חורים משושים המוקפים בשישה מיקרו-להבים.

הרקמה מובאת לכל חור על ידי רוטור מתכת בתוך תא המדיקון (medicon) ומפורקת על ידי מעבר מעל החורים המשחזים ובדרך דרך מסנן המתכת, בעוד שמיקרו-משאבה מתחת למסנן מספקת נוזל ושוטפת את הקליפות. אספו את התוצאה בתרחף תאים מהמדיקון באמצעות מזרק של שלושה עד חמישה מילימטרים ללא מחט. לאחר מכן, השרו רשת ניילון במיקרון 50 של פלקון (falcon) או רשת ניילון דומה בגודל של ארבעה מיקרון בחצי מיליליטר מצע, וסננו דרכה את התרחף.

חזור על השלב, אך השתמש ברשת ניילון של 25 µm או ביחידת falcon שקולה והנח על קרח, קח דגימת ALI של תרחיף התאים לספירה בתוך תא נויר (noyer chamber) וכוונן את ריכוז התאים למספר של 1 עד 2 כפול 10⁷ תאים ל-mL במצע תרבית. לבסוף, הוסף NDA לריכוז סופי של 0.2% כדי למנוע התקבצות תאים וכן כדי למנוע סתימות של המכשיר במהלך בדיקות זרימה עוקבות. במידה וישנה כוונה להעריך את חיוניות התאים, ניתן לבצע זאת באמצעות ערכת בדיקת חיוניות (live dead viability kit) לתאי בעלי חיים לפי הוראות היצרן; לפני הניתוח בציטומטריה של זרימה, הוסף צבע פלואורסצנטי.

בחירת הפלואורוכרום תלויה בלייזרים הזמינים. בהדגמה זו, יוצג השימוש בצבעים שונים הנקשרים ל-DNA. למרות ש-propidium iodide הוא הצבע המקובל לתאים מקובעים או מתים בריכוזים נמוכים, מצאנו כי כאשר הוא משמש בריכוזים גבוהים, ה-PI חודר לתאים טסטוסטרונליים שאינם מקובעים בסוסיפנסיות שהוכנו בשיטה המוצגת כאן.

סביר להניח שהדבר נובע מהמאמץ המכני הכרוך בכך, אשר בשילוב עם אופיו התחושתי של אפיתליון הזרע עלול להוביל לשבירה של גשרי החיבור בין התאים במינימום מניפולציה. לצביעה ב-propidium iodide, 10 דקות לפני ניתוח הדגימה, הוסיפו לתליה התאים את התמיסה בריכוז סופי של 50 µg/mL והדגירו ב-0 °C בחושך. לניתוח צביעת propidium iodide. למיון נוסף, השתמשנו בציטומטר זרימה מסוג FACS Vantage המצויד בלייזר ארגון (argon) קוהרהנט המכוון לפליטה ב-488 nm. עוצמת הלייזר נקבעה ל-100 mW, והפלואורסצנציה הנפלטת מה-propidium iodide נאספה על ידי גלאי FL2 באמצעות פילטר band pass של 575/26 nm.

השתמשו בנחיר (nozzle) של 70 µm למדידות בציטומטריה של זרימה ובתוכנת squa כדי לנתח את הפרמטרים הבאים: פיזור קדמי (Forward scatter), פיזור צדי (side scatter), פלואורסצנציה פולטת כוללת או שטח פולס (pulse area), ומשך הפליטות הפלואורסצנטיות או רוחב פולס (pulse width). התוצאות מוצגות כגרפים המייצגים את מספר האירועים בכל רמת פלואורסצנציה, ובגרפי D המציגים פיזור צדי לעומת שטח פולס פלואורסצנטי, ושטח פולס פלואורסצנטי לעומת רוחבו.

דובלטים מוחרגים מהניתוח באמצעות תרשימי DO של שטח הפולס הפלואורסצנטי לעומת רוחבו עבור מיון אוכלוסיות של מונוציטים SM, כאשר מצב המיון ב-fax vantage מוגדר כ-normal R או normal C, תוך שימוש בשלוש טיפות ממוינות כמעטפה. כוון את הדיפרנציאל של הדגימה כדי לנתח תאים בקצב של 500 עד 1500 לשנייה. שמור את מבחנות הדגימה והאיסוף בטמפרטורה של שלושה עד ארבעה מעלות celsius באמצעות יחידת קירור.

לחלופין, ניתן לצבוע את התאים בסבספנסיה באמצעות פלואורוכרומים אחרים. למשל, ניתן להשתמש בצבע החיוני HER 3 3 3 4 2 בריכוז סופי של 5 µg/mL ולהדגיר למשך 10 דקות לפחות ב-37 °C, תוך הגנה מהאור, עבור Hirsch.

3, 3, 3, 4, 2 דגימות צביעה. ניתוח התאים בוצע באמצעות ציטומטר זרימה MO המצויד בלייזר באורך גל עירור UV הפועל בעוצמה של 25 milliwatts ודיזה של 70 micrometer. השתמש בתוכנת Summit 4.3 או בתוכנה דומה כדי לנתח את אותם הפרמטרים שצוינו קודם לכן, כאשר תליית התאים מנותחת תחת אופטיקת ניגודיות פנים ונצפות תלייות באיכות חיתוך טובה.

היתרונות המרכזיים של פרוטוקול זה הם, ראשית, הכנת תרחיפי תאי אשך באמצעות מכונה וקבלתם תוך 15 דקות בלבד, כולל חיתוך רקמה, עיבוד במכונה וסינון; פרק זמן זה מהווה כשמיניאט מהזמן הנדרש בדרך כלל בפרוטוקולים אחרים. קצרו של פרוטוקול זה, יחד עם מינימום טיפול ידני, מסבירים את השימור הטוב של מקרו-מולקולות בעלות חיי מדף קצרים, דבר שהוא קריטי כאשר נדרש מדגם מייצג של תרכובות הנמצאות באוכלוסיית התאים המקורית. מכיוון שהשיטה כרוכה במינימום טיפול ידני, היא ניתנת לשחזור קל בטבלה זו.

האחוזים היחסיים של אוכלוסיות תאי אשכים שונות עבור שבעה ניסויים עצמאיים שבוצעו בחולדות בוגרות ונותחו באמצעות ציטומטריה של זרימה מוצגים כדוגמה להדגמת השחזוריות של השיטה. בניגוד למרבית החלקיקים המשמשים כיום להכנת תלחי תאי אשכים, השיטה המוצגת כאן אינה כוללת פעילות אנזימטית. אף על פי שטיפות קולגנאז ב-RNAs, שהם האנזימים הנכללים בדרך כלל, תורמות להפרדה לא מספקת של הרקמה, הן עלולות להשפיע על השימור של מקרומולקולות רלוונטיות.

היעדר טיפולים אנזימטיים לא רק תורם לשימור ה-RNA והחלבונים, אלא גם הופך את הפרוטוקול לזול יותר. למרות שדווח בעבר שתרחיפי תאים שהוכנו באופן מכני נוטים להצטבר (clump) בקלות רבה יותר מאלו שעברו טיפול בטריפסין, מצאנו כי פרוטוקול זה מוביל לתרחיפי תאים מופרדים היטב גם בהיעדר פעילות אנזימטית. הוספת NDA הוכחה כסיוע רב במניעת הצטברות תאים.

האיכות הטובה של התרחופים ניכרת גם כאשר הדגימות עוברות אנליזה ציטומטרית, כפי שניתן להסיק מכמות השאריות התאיות המזערית שנצפתה. על פי מידע שפורסם, כ-13% מהזרעות העגולות נמצאות כרב-גרעיניות, הן כאשר תרחופי התאים מכינים בשיטה מכנית בלבד והן בנוכחות טריפסין. עם זאת, תרחופים רבים שהוכנו במכונה מראים כמות מועטה מאוד של תאים רב-גרעיניים, ככל הנראה בשל הפחתת הסבכים, שכן נטען כי תאים רב-גרעיניים נוצרים בעיקר כתוצאה ממניפולציה של הרקמה.

בתמונה זו ניתן להבחין בדוגמה של תרחיף תאים שהוכן באמצעות מכונת Many-Machine מאשכים של חולדה. כפי שניתן לראות, הציטופלזמה נשמרה היטב; האחוזים היחסיים של אוכלוסיות תאי 2C ו-4C בתרחיפים אשכיים שהוכנו ב-Many-Machine עבור מכרסמים שונים היו דומים לאלו של ה-PEs השלמים.

דבר זה תומך בהנחה שהשיטה המתוארת כאן אינה גורמת לנזק סלקטיבי לסוג תא ספציפי כלשהו. באופן מפתיע, ייצוג סוגי התאים בתרחיפים רבים שהוכנו באמצעות מכונה נשמר בצורה טובה בהרבה מאשר בשיטות ההכנה הקלאסיות המבוססות על טפטוף. כפי שניתן לראות, הגרפים הציטומטריים שהתקבלו עבור תרחיפי תאי אשכים שעובדו בשיטה זו אינם שונים באופן מהותי מאלו שדווחו בעבר.

למעשה, ההיסטוגרמות וגרפי הנקודות (dot plots) שהתקבלו מציגים את שלוש אוכלוסיות תאי האשכים האופייניות בעלות תוכן DNA של 4C, 2C ו-C, כמו גם את אוכלוסיית ה-subha הגלומה, המייצגת את תאי הזרע ההפלואידיים הדחוסים מאוד. פרופילים אלו נצפו הן בתרחיפים צבועים ב-Hoechst והן בתרחיפים צבועים ב-propidium iodide, וזאת הן עבור פרטים בוגרים והן עבור פרטים צעירים. מיון של תאי זרע בשלבי התפתחותם הושג בהצלחה ברמת טוהר של מעל 98%, הן עבור אוכלוסיות אשכים נבחרות על בסיס תוכן ה-DNA והן עבור תתי-אוכלוסיות בעלות תוכן DNA זהה אך ברמות דחיסות שונות של כרומטין, כגון spermatids ו-spermatocytes.

כפי שניתן היה להבחין בתמיסות בדיקה של חזירים גינאיים, מכיוון שהפרוטוקול אינו כולל טיפול ב-RNA, אוכלוסיות ממוינות מציגות איכות RNA טובה ומאפשרות מחקרי ביטוי גנים דיפרנציאלי, אפילו עבור אוכלוסיות שצבעו ב-propidium iodide. במובן זה, ראוי להזכיר כי בניגוד לצבעים אחרים, propidium iodide צובע DNA וכן RNA דו-גללי; עם זאת, בגרפים אלו של ניתוח תמיסות מאשכים של חזיר גינאי, הפרופילים הדומים שהתקבלו בשימוש ב-propidium iodide במקביל ל-viable dye orange, שהוא צבע ספציפי ל-DNA, מראים כי צביעת RNA אינה משפיעה באופן משמעותי על דפוסי ההיסטוגרמה הציטומטריים.

רשימה זו מסכמת את היתרונות העיקריים של הפרוטוקול המוצג. השיטה האופטימלית המתוארת כאן מאפשרת להאיץ את הכנתם של תרחיפי תאי אשכים מתאימים לניתוח ציטומטרי של שלבי זרע שונים ממכרסמים תוך 15 דקות בלבד, כולל דיסקציה של האשכים, חיתוך רקמות ועיבוד באמצעות מערכת מכונת ה-ME. הקוצר, איכות השחזור הגבוהה יותר ופרופורציות סוגי התאים בתרחיפי התאים הופכים אותה לחלופה טובה לטכניקות הכנה עצמיות אחרות, מייגעות וגוזלות זמן יותר, הנמצאות כיום בשימוש.

יתרה מכך, מכיוון ששיטה זו כרוכה במניפולציה מועטה מאוד ונמנעת משימוש באנזימים ובדטרגנטים, היא מהווה בחירה אידיאלית ליישומים רגישים בהמשך התהליך, כגון מחקרי ביטוי גנים.