בידוד ואנליזה של Leukocytes המוחי מוחרם מ Plasmodium berghei עכברי אנקה נגוע

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד לויקוציטים דלקתיים דבקים מכלי הדם במוח של עכברים נגועים בעין פלסמודיום בורג כדי לגרום למלריה מוחית ניסיונית. עכברים נגועים בכדוריות דם אדומות טפיליות של פלסמודיום ברג עין אנקה בהזרקה. לאחר שהעכברים מתחילים להראות סימני מחלה, התאים במחזור הדם של עכברים נגועים במלריה מוסרים על ידי זלוף תוך אוראלי.

לאחר מכן המוחות נקצרים והרקמה מתעכלת עם אנזימים כדי לאפשר בידוד של לויקוציטים דלקתיים. לאחר מכן מבוצעת ציטומטריית זרימה רב-צבעונית לפנוטיפ חיסוני. ניתוח הלויקוציטים המבודדים במוח של הנתונים שהתקבלו חושף את האחוז והמספרים המוחלטים של לויקוציטים הנודדים למוחם של עכברים נגועים במלריה.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הפתוגנזה של מלריה, כגון איזה סוג של תאים דלקתיים נודדים לאתר של קיבוע טפילים במוחם של בעלי חיים נגועים בתנאי ניסוי שונים. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית. שלבי הזלוף קשים ללמידה מכיוון שהם דורשים גם מהירות וגם זהירות כדי לא לפגוע בכלי דם משמעותיים ידגימו חלקים מסוימים של הליך זה יהיו ליאנה מקיץ', טכנאית בעלי חיים, גב' ויקטוריה, ריק, דוקטורנטית, וד"ר ליסה אייז, פוסט-דוקטורנטית מהמעבדה שלי.

התחל את הפרוטוקול הזה על ידי הדבקת העכברים בעין p berge anca הפשרה של כדוריות דם אדומות טפיליות או pbcs על ידי מתן אפשרות להגיע לטמפרטורת החדר. הוציאו עכבר תורם בן שמונה עד 12 שבועות מהכלוב שלו והניחו אותו על תחנת עבודה. אחוז בשרוול הצוואר בין האצבע המורה לאגודל.

הפוך את העכבר והזריק 100 עד 200 מיקרוליטר של עין פלסמודיום ברג לחלל הצפק. באופן שגרתי מזריקים לשני עכברים תורמים pbcs. לאחר ההזרקה, הכניסו את העכברים לכלוב שלהם ארבעה עד חמישה ימים לאחר ההדבקה.

הוציאו עכבר תורם מהכלוב שלו והניחו אותו על תחנת עבודה. הניחו טיפת דם מווריד זנב העכבר בסמוך לקצה שקופית מיקרוסקופ קצה חלבית. הניחו שקופית שנייה בזווית של 45 מעלות והחזירו אותה לטיפת הדם.

לאחר שהדם מתפזר לאורך הקצה, דחוף את שקופית המפזר באופן שווה על פני שקופית המיקרוסקופ כדי לגרום למריחת הדם. הניחו למריחה להתייבש באוויר כדי לתקן את מריחות הדם. טבלו את השקופיות ב-100% מתנול למשך 30 שניות.

לאחר מכן מכתים שקופיות ב- GIM ZA טרי שהוכן למשך 10 דקות לאחר הצביעה ב- gim za, שטפו את השקופית במים זורמים למשך 30 שניות. הניחו לשקופית להתייבש באוויר, ולאחר מכן בחנו אותה תחת המיקרוסקופ באמצעות עדשת טבילת השמן פי 100. לספור את ה-PRBC בתוך אלף אריתרוציטים ולחשב אחוז פרה אם העכבר התורם הגיע לרמות הנדרשות של 2.5 עד 5% פרסיט אסוף דם מהעכבר התורם על ידי ניקוב לב בהרדמה או דימום רטרואורביטלי באמצעות צינור נימי מיקרו המטוקריט הפריני.

ממיסים את הדם במדיום RPMI בריכוז סופי של אחד כפול 10 עד ששת ה-PRBC לכל 0.2 מיליליטר לעכבר. קחו בחשבון שההמטוקריט רגיל של עכבר הוא בערך פי שש עד תשיעית תאי דם אדומים למיליליטר. למעשה, ניסוי בן שמונה עד 12 שבועות C 57 שחור שישה עכברים על ידי הזרקה אחת כפול 10 ל-PRBC השישי ב-0.2 מיליליטר תוך צפקי כמו קודם.

כדי לנטר את רמות הפרה של עכברים נגועים, הכינו מריחת דם כמו קודם. יש לקבוע את ה-Para כל יומיים-שלושה החל מהיום השני או השלישי לאחר ההדבקה מהיום החמישי. לאחר ההדבקה ואילך.

עכברים מנוטרים מדי יום לאיתור סימנים של מלריה חמורה ברגע שרמות הפרה גבוהות מ-5% ועכברים מראים תסמינים נוירולוגיים בסביבות היום השישי לאחר ההדבקה. העכברים הנגועים מורדמים בשאיפת CO2 ומיד מועברים ל-PBS כמתואר במסמך הנלווה. ההיבט הקשה ביותר בהליך זה הוא הזלוף התוך לבבי.

סדרה של טיפים לפתרון בעיות מתוארת כאן כאשר העכבר מוצמד ללוח חיתוך קלקר. בתוך מגש חיתוך. נגב את הצד הגחוני עם אתנול 70%, ולאחר מכן השתמש במספריים גדולים ובמלקחיים כדי לפתוח את העור לאורך קו האמצע כדי לחשוף את חלל בית החזה, לקפל ולהצמיד את העור לצדדים.

החזק את עצם החזה בעזרת מלקחיים עדינים וחתוך את הסרעפת ולאורך שני צידי עצם החזה, תוך ניתוק הצלעות. הקפד לא לפגוע בכלי דם גדולים. הצמד את כלוב הצלעות בעצם החזה באופן רופף ליד הראש.

החזיקו חדרים בעזרת מלקחיים עדינים וחתכו בזהירות את הפרוזדור הימני במספריים עדינים. הכנס מחט 23 מד המחוברת למערכת זלוף הכבידה לחדר השמאלי לכיוון אבי העורקים העולה. בזמן ש-PBS פועל, הכנס רק 0.5 סנטימטרים מקצה המחט כדי לחלחל את העכבר למשך חמש דקות או עד שהשפכים צלולים.

לאחר הזלוף הפנימי, נתחו את המוח והניחו אותו בצינור צנטריפוגה של 10 מיליליטר המכיל RPMI. בינוני. הניחו את המוח הטרי שנקטף על גבי מסננת תאי נירוסטה בגודל 40 עד 60 רשת בצלחת פטרי המכילה שלושה עד חמישה מיליליטר של מדיום תרבית רקמות RPMI. חותכים את רקמת המוח לחתיכות קטנות.

לאחר מכן, באמצעות בוכנה קריסטלית, דחפו חתיכות קטנות של רקמת מוח דרך מסננת התאים. העבירו את המוח להומוגנציה לצינור של 10 מיליליטר וצנטריפוגה אותו ב-250 פעמים G למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הסיבוב, השליכו את הסופרנטנט והמיסו את הכדור בשלושה מיליליטר של RPMI.

מדיום המכיל קולגנאז D וברבור DNA. סובבו את התערובת למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. הסר כל פסולת תאים על ידי דחיפת התערובת דרך מסננת תאי ניילון של 70 מיקרון.

לאחר מכן דגרו על קרח במשך חמש דקות לאחר הדגירה בצינור של 10 מיליליטר. שכבו בזהירות את המוח על צנטריפוגה של שבעה מיליליטר 30% לכל כרית שיחה ב-400 פעמים G למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר עם ההפסקה. לאחר השלכת הסופרנטנט, השעו מחדש את הכדור במיליליטר אחד של ליזיס כדוריות דם אדומות, חוצצים ודגרו על קרח למשך חמש דקות.

ליז pbcs דבקים, שאינם מוסרים מהמוח על ידי זלוף תוך אוראלי. הוסף תשעה מיליליטר של תאי שטיפה בינוניים RPMI וצנטריפוגה ב -250 פעמים G למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. Resus משהה את הלויקוציטים המבודדים במוח או גלולה המכילה BSL ב-50 עד 100 מיקרוליטר של מדיום RPMI ומעביר תאים לצינור מיקרו צנטריפוגה לספור תאים ברי קיימא תחת המיקרוסקופ באמצעות ציטומטר המו והדרה כחולה טריאן.

שישה ימים לאחר ההדבקה, ניתן לשחזר 20,000 עד 100,000 BSLs לאחר קבלת ספירת התאים הקיימת. התאים מוכנים לניתוח על ידי ציטומטריית זרימה. הפרטים של נוהל זה ניתנים במסמך הנלווה, אך מסוכמים כאן תחילה.

כל התאים המבודדים מכל מוח עוברים צנטריפוגה בצינור מיקרו פוגה של 1.5 מיליליטר ומושעיים מחדש במאגר צביעה עם נוגדנים חוסמי CD 16 ו-CD 32. לאחר דגירה של 10 דקות על קרח, התאים נשטפים שוב עם מאגר צביעה צנטריפוגה ומושעים מחדש במאגר צביעה המכיל נוגדנים פלואורסצנטיים נגד CD 4, anti CD 8 anti TCR ו-anti NK 1.1. התאים מודגרים על קרח למשך שעה אחת ונשטפים בכתמים, חיץ וצנטריפוגה.

לאחר הסיבוב, התאים מושעים מחדש ב-PBS ולפחות 5,000 עד 10,000 אירועים נרכשים על ציטומטר זרימה. הנתונים המתקבלים מנותחים באמצעות תוכנת זרימה ציטומטרית מתאימה. אוכלוסיות BSL התאוששו ממוחות של עכברי ביקורת שנפגעו או או"ם, נגועים במלריה ונאיביים ונצבעו בנוגדני בטא pe, anti NK 1.1 ו-PC anti TCR.

תרשימי נקודות אלה מתארים אחוזים של תאי NK, לימפוציטים T, תאים חיוביים ל-TCR חיוביים NK 1.1 ותאים שליליים כפולים. NK 1.1 TCR שלילי שלילי בעכברי ביקורת מאוחדים או לא מאוחדים, נגועים במלריה וביקורת נאיבית התואמים את הממצאים הקודמים. תאי T חיוביים ל-TCR אלפא בטא היוו שיעור גבוה ממאגר ה-BSL במוחם של עכברים נגועים במלריה ביום השישי לאחר ההדבקה.

נראה כי אוכלוסייה זו מיוצגת באופן משמעותי במוחם של בעלי חיים שאינם מעוותים. הירידה לכאורה בתדירות תאי T במוחות לא מחולפים הייתה קשורה לאחוז גבוה משמעותית ולמספר הכולל של תאים שליליים כפולים בבעלי חיים אלה. אחוזים ומספרים גבוהים של תאים שליליים כפולים במוחות לא מזוהמים התגלו לא רק בעכברים נגועים במלריה, אלא גם בבקרות נאיביות המצביעות על כך שתאים אלה הם לויקוציטים לא דלקתיים הנמצאים בכלי דם במוח המתאוששים יחד עם תאים דלקתיים אם לא מבוצע זלוף תוך לבבי.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לבצע שפע תוך קרדיולוגי נרחב של עכברים נגועים לפני מיצוי איברים כדי למנוע זיהום של לויקוציטים מבודדים בתאים במחזור דם לא דלקתיים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לבודד ולנתח לויקוציטים מופרדים במוח מעכברים נגועים בפלסמודיום וירגה על ידי גיאומטריה זורמת.