Name: בידוד ואנליזה של Leukocytes המוחי מוחרם מ Plasmodium berghei עכברי אנקה נגוע (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: למדו לבודד לויקוציטים דלקתיים מדפנות כלי הדם במוח של עכברים נגועים ב-Plasmodium berghei ANKA. שיטה זו מאפשרת אנליזה פנוטיפית באמצעות ציטומטריית זרימה רב-צבעית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות למיס ליאנה מצקייביץ&#39; לסיוע טכני. עבודה זו התאפשרה בזכות תמיכה ויקטוריאני מדינת ממשלה התפעולית תשתיות וממשלה האוסטרלית הלאומיים בריאות והמועצה למחקר הרפואי IRIISS והפרויקט גרנט 1031212.

1. זיהום של עכברים עם פ berghei-אנקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר aliquot של פ cryopreserved berghei האנקה pRBC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרסן עכבר מוחות מלריה עמיד BALB / ג תורם (8-12 שבועות בן) באמצעות טכניקת האיפוק בשתי ידות. הזרק עכבר עם 100-200 μl של pRBC שימוש במזרק אינסולין מ&quot;ל 1 (28g מחט). באופן שגרתי, 1-2 עכברים תורמים מוזרקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בימים שלאחר הזיהום 4-5 (פאי) להסיר עכבר תורם מכלוב והנח אותו על תחנת עבודה או משטח עבודה פנויה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עדינות לרסן את העכבר עד סוף הזנב ובאמצעות מספריים קטנים לחתוך את קצה הזנב (כ 1 מ&quot;מ). לחלופין, לנקב זנב קטן באמצעות מחט 25 G יכול להתבצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח טיפת הדם מוריד הזנב של העכבר הקרוב לסוף שקופית מיקרוסקופ המעומם סוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח שקופית שנייה (מפזר) בזווית של 45 °, ולגבות אותו לטיפה של דם. ברגע שהדם מתפשט לאורך הקצה, לדחוף את המפזר-שקופית הערבnly פני שקופית מיקרוסקופ כדי להפוך את הכתם של הדם. אפשר למרוח לייבוש באוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את כתמי דם במתנול 100% למשך 30 שניות ולאחר מכן כתם שקופיות בGiemsa המוכן טרי למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את כתם דם במים זורמים במשך דקות 1, לאפשר לאוויר יבש ולבחון שקופיות מתחת למיקרוסקופ (100x, טבילת שמן). למנות pRBC בתוך 1000 אריתרוציטים ולחשב parasitemia אחוזים. עכברים תורמים צריכים להגיע לרמות parasitemia בין 2.5-5% לפני שניתן יהיו דממו הם לזיהום של חיות ניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף דם מעכבר התורם על ידי דימום רטרו מסלולית באמצעות צינור נימי מייקר המטוקריט heparinized. כל הניסויים מבוצעים בעמידה בדרישות וולטר ואלייזה הול המכון בבעלי חי ועדת האתיקה. בהתאם לדרישות ועדת אתיקת בעלי חיים מקומיות נהלי דימום אחרים עשויים להיות בשימוש. להמס כמות הנדרשת של דם במדיום RPMI בריכוז סופי של 1x10 6 pRBC/0.2 מ&quot;ל. תחשוב על זההמטוקריט עכבר רגיל הוא ~ 6x10 9 תאי דם אדומים / מ&quot;ל 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדביק C57BL ניסיוני / 6 עכברים (8-12 שבועות) על ידי הזרקת intraperitoneally (IP) מיליליטר 1x10 6 pRBC/0.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לעקוב אחר רמות parasitemia של עכברים נגועים בצע את השלבים 1.3-1.8. Parasitemia צריך להיות נחוש כל 2-3 ימים מתחיל ביום 2 או 3 pi </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התפרצות של מלריה חמורה בC57BL / 6 עכברים עלולים להתבטא במראה כפוף, ruffed פרווה ופעילות נמוכה. עכברים מסוימים עשויים להתאושש בשלב זה, אך התקדמות לאובדן של רפלקס ליישר עצמי מצביעה על מחלה בלתי הפיכה ובעלי החיים חייבים להיות מורדמים. </li></ol> 2. זלוף Intracardial של עכברים ומיצוי המוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב מערכת זלוף הכביד ידנית על ידי הבטחת מאגר 500 מ&quot;ל לבעל טור המחובר לחלקו העליון של מעמד עמודה 60 סנטימטרים. חבר צינור פלסטיק לקצה התחתון של המאגר ולאבטח מהדק צינורות לשלוט בזרימת חיץ. צרף צינורית למחט 23 G. Fill את המאגר עם PBS (החזיק ב22 מעלות צלזיוס), פתח לצבוט ולאפשר חיץ לרוץ דרך הצינורות כדי להסיר את כל בועות האוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים פ עכבר berghei אנקה נגועה על ידי 2 משאיפת CO. לאשר את המוות בהעדר הדוושה, מסלולית ותגובות בדרכי נשימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמד עכבר להרדים על ידי כפות האחוריות וקדמיות dorsally על קרש חיתוך קלקר הכלול במגש פלסטיק. בהתאם להרדמה מקומית Animal אתיקת ועדת דרישות יכולים להינתן בתחילה מוקדמת של pefusion intracardial. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נגב צד הגחוני עם אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במספריים ומלקחיים גדולים כדי לפתוח עור לאורך קו האמצע על מנת לחשוף את חלל בית החזה. עור לקפל ולהדק את הצדדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את עצם החזה עם מלקחיים עדינים ולחתוך את הסרעפת ולאורך שני צידי עצם חזה ניתוק הצלעות. הקפד שלא לפגוע בשום כלי דם גדולים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להצמיד לצלעות בחזה באופן רופף לצד הראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק שנינות חדרי לבמלקחי h דקים ועלייה ימנית בזהירות חתוך במספריים עדינים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס מחט 23 ז המחובר למערכת זלוף הכביד לתוך חדר שמאלי לכיוון אב העורקים עולה תוך PBS פועל. הכנס רק 0.5 סנטימטר של קצה המחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תנקב את העכבר למשך 5 דקות או עד ששפכים הוא ברור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכבר הסר ולהניח אותה על הבטן שלה. נגב את הראש עם אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מספריים גדולים, עושה חתך מעל לאזור חוט השדרה הצווארי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במספריים מצוינים לעשות חתך החציוני זנב-מקורי מתחיל בבסיס הגולגולת ולקלף את העור כדי לחשוף את הגולגולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחזיק את הראש, הנח את הלהבים של מספריים קטנים לתוך כל חלל מסלולית ולעשות חתך בין המסלולים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך אורכים לאורך תפר sagittal ומקלף בזהירות את הגולגולת באונה כל מוח כלפי חוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מרית, בעדינות להרים את המוח ולמקם אותו לתוך צינור צנטריפוגה 10 מ&quot;ל המכיל בינוני RPMI. </li></ol>3. בידוד של מוח Leukocytes-מוחרם (מנהלת ליגה) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבודה בקבינט ביטחון, מקום שנקטף מוח טרי על גבי מסננת נירוסטת תא (40-60 גודל רשת) בצלחת פטרי המכילה 3-5 מ&quot;ל של מדיום תרבות רקמות RPMI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיתוך ברקמת מוח לחתיכות קטנות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדחוף חתיכות קטנות של רקמת מוח דרך מסננת התא באמצעות בוכנת גביש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת homogenate המוח לשפופרת 10 מ&quot;ל וצנטריפוגה XG ב 250 עבור 10 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממס גלול ב 3 מ&quot;ל של מדיום RPMI, המכיל 0.05% collagenase D ו2U/ml DNAse I. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב תערובת למשך 30 דקות בטמפרטורת חדר. להסיר שאריות של תאים על ידי דחיפת התערובת באמצעות מסננת 70 מיקרומטר ניילון תא ו / או על ידי דוגר על קרח למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שכב homogenate מוח על 30% מיליליטר כרית 7 Percoll וצנטריפוגה XG ב 400 (ללא ברקסים) למשך 20 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלול ב 1 מ&quot;ל של חיץ תאי דם האדום תמוגה ולדגור על קרח למשך 5 דקות כדיlyse pRBC חסיד, שלא ניתן להסירו מהמוח על ידי זלוף intracardial. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 9 מ&quot;ל של מדיום RPMI, לשטוף תאים וצנטריפוגות XG ב 250 עבור 10 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנהלת הליגה resuspend המכיל גלולה ב50-100 μl של מדיום RPMI ותאים להעברת צינור אפנדורף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל aliquot 5-10 μl של מדגם התא 01:02 בTrypan כחול לזיהוי של תאי קיימא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאי קיימא תחת מיקרוסקופ באמצעות hemocytometer. מגיל 6 ואילך pi יום, כאשר פ עכברי berghei אנקה נגועה להציג סימנים נוירולוגיים, 20,000-100,000 BSLs ניתן לשחזר. </li></ol> 4. Immunophenotyping של מנהלת ליגה על ידי cytometry זרימה הססגונית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה תאי XG ב 250 עבור 10 דקות ב 4 ° C, לשאוב supernatant ו resuspend גלול ב 50 μl של חיץ מכתים (PBS, 1% עוברי עגל בסרום (FCS), 2 המ&quot;מ EDTA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף μl 1 מתוך מטוהר anti-CD16/32 נוגדן (Fcblock). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת תאים עבור 10 דקות על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים עם 1 מ&quot;ל של הצפת כתמים. צנטריפוגה תאי XG ב 250 עבור 10 דקות ב 4 ° C ולשאוב supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי resuspend ב 50 μl של הכתמת המאגר המכיל דילולים שנקבעו מראש אופטימליים של נוגדני ניאון הנדרשים, CD4 נגד כלומר, אנטי CD8, אנטי TCR ואנטי NK1.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה במשך שעה 1 על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים עם 1 מ&quot;ל של הצפת כתמים. צנטריפוגה תאי XG ב 250 עבור 10 דקות ב 4 ° C ולשאוב supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאים ב100 μl של PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת תאים לצינור פלסטיק cytometry זרימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש cytometer זרימה, לרכוש לפחות 5,000-10,000 אירועים. פקדים מתאימים בתוליים תאים ודגימות פיצויי fluorochrome צריכים להיכלל כנדרשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את התוצאות באמצעות תוכנת cytometry זרימה מתאימה. </li></ol>

<ol><li>Brian de Souza, J., Riley, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+malaria%3A+the+contribution+of+studies+in+animal+models+to+our+understanding+of+immunopathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Cerebral malaria: the contribution of studies in animal models to our understanding of immunopathogenesis.</a> Microbes and Infection. 4, 291-300 (2002).</li>
<li>Schofield, L., Grau, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+processes+in+malaria+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Immunological processes in malaria pathogenesis.</a> Nature. 5, 722-735 (2005).</li>
<li>Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathogenic+basis+of+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The pathogenic basis of malaria.</a> Nature. 415, 673-679 (2002).</li>
<li>Howe, C. L., Lafrance-Corey, R. G., Sundsbak, R. S., Lafrance, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+monocytes+damage+the+hippocampus+during+acute+picornavirus+infection+of+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Inflammatory monocytes damage the hippocampus during acute picornavirus infection of the brain.</a> Journal of neuroinflammation. 9, 50(2012).</li>
<li>LaFrance-Corey, R. G., Howe, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Brain-infiltrating+Leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes.</a> J. Vis. Exp. (52), e2747(2011).</li>
<li>Lim, S. M., Koraka, P., Osterhaus, A. D., Martina, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((West+Nile+virus%3A+immunity+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">West Nile virus: immunity and pathogenesis.</a> Viruses. 3, 811-828 (2011).</li>
<li>Belnoue, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+pathogenic+role+of+brain-sequestered+alphabeta+CD8%2B+T+cells+in+experimental+cerebral+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">On the pathogenic role of brain-sequestered alphabeta CD8+ T cells in experimental cerebral malaria.</a> Journal of Immunology. 169, 6369-6375 (2002).</li>
<li>Campanella, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokine+receptor+CXCR3+and+its+ligands+CXCL9+and+CXCL10+are+required+for+the+development+of+murine+cerebral+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Chemokine receptor CXCR3 and its ligands CXCL9 and CXCL10 are required for the development of murine cerebral malaria.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 105, 4814-4819 (2008).</li>
<li>Hansen, D. S., Bernard, N. J., Nie, C. Q., Schofield, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NK+cells+stimulate+recruitment+of+CXCR3%2B+T+cells+to+the+brain+during+Plasmodium+berghei-mediated+cerebral+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">NK cells stimulate recruitment of CXCR3+ T cells to the brain during Plasmodium berghei-mediated cerebral malaria.</a> Journal of Immunology. 178, 5779-5788 (2007).</li>
<li>Amante, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+natural+regulatory+T+cells+in+the+pathogenesis+of+experimental+cerebral+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">A role for natural regulatory T cells in the pathogenesis of experimental cerebral malaria.</a> The American journal of pathology. 171, 548-559 (2007).</li>
<li>Nie, C. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IP-10-mediated+T+cell+homing+promotes+cerebral+inflammation+over+splenic+immunity+to+malaria+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">IP-10-mediated T cell homing promotes cerebral inflammation over splenic immunity to malaria infection.</a> PLoS pathogens. 5, e1000369(2009).</li>
<li>Franke-Fayard, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+malaria+parasite+sequestration%3A+CD36+is+the+major+receptor%2C+but+cerebral+pathology+is+unlinked+to+sequestration%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Murine malaria parasite sequestration: CD36 is the major receptor, but cerebral pathology is unlinked to sequestration.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 11468-11473 (2005).</li>
<li>Nitcheu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perforin-dependent+brain-infiltrating+cytotoxic+CD8%2B+T+lymphocytes+mediate+experimental+cerebral+malaria+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunololgy%22%5BJournal%5D)">Perforin-dependent brain-infiltrating cytotoxic CD8+ T lymphocytes mediate experimental cerebral malaria pathogenesis.</a> Journal of Immunololgy. 170, 2221-2228 (2003).</li>
<li>Lundie, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-stage+Plasmodium+infection+induces+CD8%2B+T+lymphocytes+to+parasite-expressed+antigens%2C+largely+regulated+by+CD8alpha%2B+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceeding+of+the+National+Academy+of+Science+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Blood-stage Plasmodium infection induces CD8+ T lymphocytes to parasite-expressed antigens, largely regulated by CD8alpha+ dendritic cells.</a> Proceeding of the National Academy of Science U S A. 105, 14509-14514 (2008).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

הבידוד והאנליזה של מנהלת הליגה הוא שיטה המאפשרת אפיון וכימות של תאים דלקתיים הנודדים למוח בתגובה לפגיעה ברקמות או זיהום במודלים של עכברי ניסוי. ההקדמה של צעד זלוף intracardial להסרת תא הדם לפני חילוץ איברים ובידוד התא הבא היא שימושית כדי למנוע זיהום של תאים דלקתיים עם לויקוציטים במחזור שאינו דלקתי. זה לא יכול להיות דרישה הכרחית בזיהומי neurotropic כגון וירוס Encephalomyelitis עכברי שבתאים דלקתיים לחדור למוח parenchyma 5, אך רלוונטי במיוחד במלרית מכרסם, בי אריתרוציטים נג...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות (אופציונלי) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> פתרונות וחוצצים </td></tr><tr><td> הפתרון של Giemsa Azur eosin תילן הכחול </td><td> מרק Millipore </td><td> 1.09204.0500 </td><td> דילול 1:10 במים מזוקקים </td></tr><tr><td> RPMI בינוני </td><td></td><td></td><td> העכבר tonicity </td></tr><tr><td> עכבר tonicity PBS </td><td></td><td></td><td> פוספט 20 מ&quot;מ נתרן, 0.149 NaCl, 7.3 pH </td></tr><tr><td> 0.4% Trypan הכחול </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> T-8154 </td><td> 01:02 דילול </td></tr><tr><td> Collagenase D </td><td> ורטינגטון יוכימית </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Deoxyribonuclease (DNAse) אני </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> D4263-5VL </td><td> מלבלב שור </td></tr><tr><td> Percoll </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0891-01 </td><td> 30% בפתרון PBS </td></tr><tr><td> Ultrapure טריס </td><td> Invitrogen </td><td> 15505-020 </td><td></td></tr><tr><td> כלוריד אמוניום (NH 4 Cl) </td><td> AnalaR </td><td> 10017 </td><td></td></tr><tr><td> מאגר תמוגה תא אדום </td><td></td><td></td><td> 17 המ&quot;מ טריס, 4 Cl 14nM NH, 7.2 pH </td></tr><tr><td> FCS </td><td> Gibco </td><td> 1009 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA disodium מלח </td><td> מרק </td><td> 10093.5V </td><td> 0.1M, 7.2 pH </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> נוגדנים וconjugates </td></tr><tr><td> אנטי עכבר CD16/CD32 (FC בלוק), השיבוט 2.4G2 </td><td> BD Pharmingen </td> &lt;td&gt; 553142 </td><td> μl 1 בחיץ מכתים 50 μl (0.5mg/50 מ&quot;ל) </td></tr><tr><td> CD4 FITC-אנטי עכבר, השיבוט H129.19 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553651 </td><td></td></tr><tr><td> PE-אנטי עכבר NK1.1, PK136 שיבוט </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553165 </td><td></td></tr><tr><td> PerCPCy5.5-אנטי עכבר CD8, 53-6-7 שיבוט </td><td> BD Pharmingen </td><td> 551162 </td><td></td></tr><tr><td> APC-אנטי עכבר TCR-β, שיבוט H57-597 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553174 </td><td></td></tr><tr><td> PE-אנטי עכבר CXCR3, 220803 שיבוט </td><td> מו&quot;פ מערכות </td><td> FAB1685P </td><td></td></tr><tr><td> Biotinylated-אנטי עכבר CCR5, שיבוט C34-3448 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 559922 </td><td></td></tr><tr><td> Steptavidin-PerCP-Cy5.5 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 551419 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> ציוד וחומרים </td></tr><tr><td> שקופית מיקרוסקופ SuperFrost </td><td> Lomb Menzel-גלזר </td><td></td><td></td></tr><tr><td> מלקחי נתיחה, מספריים </td><td> רידא Instrumente </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 500 מ&quot;ל PBS מאגר </td><td> Nalgene </td><td></td><td></td></tr><tr><td> צינור גומי </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> מחט 23 ז </td><td> BD PrecisionGlide </td><td> 302008 </td><td></td></tr><tr><td> תא דיסוציאציה ערכה המכילה מתכת מסננת </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> תקליטור-1 </td><td></td></tr><tr><td> מסננת תא ניילון 70 מיקרומטר </td><td> BD פלקון </td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> Hemocytometer </td><td> GmbH נויבאואר </td><td> 717810 </td><td></td></tr><tr><td> צינורות זרימה cytometry </td><td> Bד פלקון </td><td> 352008 </td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד ואנליזה של leukocytes המוחי מוחרם מ<em&gt; plasmodium berghei</em&gt; עכברי אנקה נגוע

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

אנו מתארים שיטה לבידוד ואפיון של תאי דלקת חסיד מכלי דם במוח של פ עכברי berghei אנקה נגוע. זיהום של-זני עכברים רגישים עם תוצאות מתח טפיל זה באינדוקציה של קדחת מוח ניסיונית, תסמונת נוירולוגית שחוזר על היבטים חשובים מסוימים של מלריה חמורה Plasmodium falciparum בתיווך ב1,2 בני האדם. צורות בוגרות של מלריה בדם שלב לבטא חלבונים טפילים על פני השטח של כדורי האדום הנגוע, המאפשר להם להיקשר לתאי האנדותל של כלי דם. תהליך זה גורם לחסימות בזרימת דם, וכתוצאה מהיפוקסיה ושטפי דם 3 וגם ממגר את הגיוס של לויקוציטים הדלקתי לאתר של קיבוע טפיל. בניגוד לזיהומים אחרים, וירוסים כלומר neutrotopic 4-6, שני תאי המלריה parasitized דם האדומים (pRBC), כמו גם הקשור inflammleukocytes atory יישאר מוחרם בתוך כלי דם ולא מסתנן parenchyma המוח. לפיכך, כדי למנוע זיהום של לויקוציטים המוחרם עם תאים שאינם דלקתיים במחזור, זלוף intracardial הנרחב של עכברים נגועים לפני חילוץ איברים ועיבוד רקמות נדרש בהליך זה כדי להסיר את תא הדם. לאחר זלוף, המוח נקצר ומבותר לחתיכות קטנות. מבנה הרקמה שבש עוד יותר על ידי טיפול האנזימטית עם collagenase D וDNAse I. אז homogenate המוח וכתוצאה הוא centrifuged בשיפוע Percoll המאפשר פרדה של לויקוציטים מוח המוחרם (מנהלת ליגה) מהמיאלין ופסולת רקמות אחרות. תאים מבודדים אז נשטפים, נספר באמצעות hemocytometer ומוכתם עם נוגדני ניאון לניתוח שלאחר מכן על ידי cytometry זרימה. הליך זה מאפשר אפיון הפנוטיפי מקיף של לויקוציטים הדלקתי נודד למוח מחדשsponse לגירויים שונים, כולל שבץ, כמו גם זיהומים נגיפיים או טפילים. השיטה מספקת גם כלי שימושי להערכת טיפולים חדשניים אנטי דלקתיים במודלים של בעלי חיים קדם קליניים.

התוצאות באיור. 2 אחוזים מהופעות ולמספרים מוחלטים של אוכלוסיות שונות מנהלות התאוששו ממוחם של עכברי perfused או unperfused בקרה נגועה מלריה, ונאיביים. מנהלת הליגה מבודדת הוכתמה PE-אנטי NK1.1 ונוגדני APC-אנטי TCR-β כפי שצוינה בפרוטוקול הטקסט. עולה בקנה אחד עם ממצאים קודמים 7-9, αβTCR + תאי T מורכב שיעור גבוה של ברכת מנהלת הליגה במוחם של עכברים נגועים במלרית perfused (היום 6 פאי). אוכלוסייה זו שנראית באופן משמעותי ייצוג במוחם של בעלי חיים שאינם perfused (איור 2A-...

שיטה לבידוד של לויקוציטים הדלקתי חסיד מכלי דם במוח<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; עכברי אנקה נגוע מתוארים. השיטה מאפשרת כימות, כמו גם אפיון הפנוטיפי של לויקוציטים הבודד לאחר ההכתמה עם נוגדני ניאון וניתוח שלאחר מכן על ידי cytometry זרימה.

בידוד ואנליזה של Leukocytes המוחי מוחרם מ<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; עכברי אנקה נגוע

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד לויקוציטים דלקתיים דבקים מכלי הדם במוח של עכברים נגועים בעין פלסמודיום בורג כדי לגרום למלריה מוחית ניסיונית. עכברים נגועים בכדוריות דם אדומות טפיליות של פלסמודיום ברג עין אנקה בהזרקה. לאחר שהעכברים מתחילים להראות סימני מחלה, התאים במחזור הדם של עכברים נגועים במלריה מוסרים על ידי זלוף תוך אוראלי.לאחר מכן המוחות נקצרים והרקמה מתעכלת עם אנזימים כדי לאפשר בידוד של לויקוציטים דלקתיים. לאחר מכן מבוצעת ציטומטריית זרימה רב-צבעונית לפנוטיפ חיסוני. ניתוח הלויקוציטים המבודדים במוח של הנתונים שהתקבלו חושף את האחוז והמספרים המוחלטים של לויקוציטים הנודדים למוחם של עכברים נגועים במלריה.שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הפתוגנזה של מלריה, כגון איזה סוג של תאים דלקתיים נודדים לאתר של קיבוע טפילים במוחם של בעלי חיים נגועים בתנאי ניסוי שונים. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית. שלבי הזלוף קשים ללמידה מכיוון שהם דורשים גם מהירות וגם זהירות כדי לא לפגוע בכלי דם משמעותיים ידגימו חלקים מסוימים של הליך זה יהיו ליאנה מקיץ', טכנאית בעלי חיים, גב' ויקטוריה, ריק, דוקטורנטית, וד"ר ליסה אייז, פוסט-דוקטורנטית מהמעבדה שלי.התחל את הפרוטוקול הזה על ידי הדבקת העכברים בעין p berge anca הפשרה של כדוריות דם אדומות טפיליות או pbcs על ידי מתן אפשרות להגיע לטמפרטורת החדר. הוציאו עכבר תורם בן שמונה עד 12 שבועות מהכלוב שלו והניחו אותו על תחנת עבודה. אחוז בשרוול הצוואר בין האצבע המורה לאגודל.הפוך את העכבר והזריק 100 עד 200 מיקרוליטר של עין פלסמודיום ברג לחלל הצפק. באופן שגרתי מזריקים לשני עכברים תורמים pbcs. לאחר ההזרקה, הכניסו את העכברים לכלוב שלהם ארבעה עד חמישה ימים לאחר ההדבקה.הוציאו עכבר תורם מהכלוב שלו והניחו אותו על תחנת עבודה. הניחו טיפת דם מווריד זנב העכבר בסמוך לקצה שקופית מיקרוסקופ קצה חלבית. הניחו שקופית שנייה בזווית של 45 מעלות והחזירו אותה לטיפת הדם.לאחר שהדם מתפזר לאורך הקצה, דחוף את שקופית המפזר באופן שווה על פני שקופית המיקרוסקופ כדי לגרום למריחת הדם. הניחו למריחה להתייבש באוויר כדי לתקן את מריחות הדם. טבלו את השקופיות ב-100% מתנול למשך 30 שניות.לאחר מכן מכתים שקופיות ב- GIM ZA טרי שהוכן למשך 10 דקות לאחר הצביעה ב- gim za, שטפו את השקופית במים זורמים למשך 30 שניות. הניחו לשקופית להתייבש באוויר, ולאחר מכן בחנו אותה תחת המיקרוסקופ באמצעות עדשת טבילת השמן פי 100. לספור את ה-PRBC בתוך אלף אריתרוציטים ולחשב אחוז פרה אם העכבר התורם הגיע לרמות הנדרשות של 2.5 עד 5% פרסיט אסוף דם מהעכבר התורם על ידי ניקוב לב בהרדמה או דימום רטרואורביטלי באמצעות צינור נימי מיקרו המטוקריט הפריני.ממיסים את הדם במדיום RPMI בריכוז סופי של אחד כפול 10 עד ששת ה-PRBC לכל 0.2 מיליליטר לעכבר. קחו בחשבון שההמטוקריט רגיל של עכבר הוא בערך פי שש עד תשיעית תאי דם אדומים למיליליטר. למעשה, ניסוי בן שמונה עד 12 שבועות C 57 שחור שישה עכברים על ידי הזרקה אחת כפול 10 ל-PRBC השישי ב-0.2 מיליליטר תוך צפקי כמו קודם.כדי לנטר את רמות הפרה של עכברים נגועים, הכינו מריחת דם כמו קודם. יש לקבוע את ה-Para כל יומיים-שלושה החל מהיום השני או השלישי לאחר ההדבקה מהיום החמישי. לאחר ההדבקה ואילך.עכברים מנוטרים מדי יום לאיתור סימנים של מלריה חמורה ברגע שרמות הפרה גבוהות מ-5% ועכברים מראים תסמינים נוירולוגיים בסביבות היום השישי לאחר ההדבקה. העכברים הנגועים מורדמים בשאיפת CO2 ומיד מועברים ל-PBS כמתואר במסמך הנלווה. ההיבט הקשה ביותר בהליך זה הוא הזלוף התוך לבבי.סדרה של טיפים לפתרון בעיות מתוארת כאן כאשר העכבר מוצמד ללוח חיתוך קלקר. בתוך מגש חיתוך. נגב את הצד הגחוני עם אתנול 70%, ולאחר מכן השתמש במספריים גדולים ובמלקחיים כדי לפתוח את העור לאורך קו האמצע כדי לחשוף את חלל בית החזה, לקפל ולהצמיד את העור לצדדים.החזק את עצם החזה בעזרת מלקחיים עדינים וחתוך את הסרעפת ולאורך שני צידי עצם החזה, תוך ניתוק הצלעות. הקפד לא לפגוע בכלי דם גדולים. הצמד את כלוב הצלעות בעצם החזה באופן רופף ליד הראש.החזיקו חדרים בעזרת מלקחיים עדינים וחתכו בזהירות את הפרוזדור הימני במספריים עדינים. הכנס מחט 23 מד המחוברת למערכת זלוף הכבידה לחדר השמאלי לכיוון אבי העורקים העולה. בזמן ש-PBS פועל, הכנס רק 0.5 סנטימטרים מקצה המחט כדי לחלחל את העכבר למשך חמש דקות או עד שהשפכים צלולים.לאחר הזלוף הפנימי, נתחו את המוח והניחו אותו בצינור צנטריפוגה של 10 מיליליטר המכיל RPMI. בינוני. הניחו את המוח הטרי שנקטף על גבי מסננת תאי נירוסטה בגודל 40 עד 60 רשת בצלחת פטרי המכילה שלושה עד חמישה מיליליטר של מדיום תרבית רקמות RPMI. חותכים את רקמת המוח לחתיכות קטנות.לאחר מכן, באמצעות בוכנה קריסטלית, דחפו חתיכות קטנות של רקמת מוח דרך מסננת התאים. העבירו את המוח להומוגנציה לצינור של 10 מיליליטר וצנטריפוגה אותו ב-250 פעמים G למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הסיבוב, השליכו את הסופרנטנט והמיסו את הכדור בשלושה מיליליטר של RPMI.מדיום המכיל קולגנאז D וברבור DNA. סובבו את התערובת למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. הסר כל פסולת תאים על ידי דחיפת התערובת דרך מסננת תאי ניילון של 70 מיקרון.לאחר מכן דגרו על קרח במשך חמש דקות לאחר הדגירה בצינור של 10 מיליליטר. שכבו בזהירות את המוח על צנטריפוגה של שבעה מיליליטר 30% לכל כרית שיחה ב-400 פעמים G למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר עם ההפסקה. לאחר השלכת הסופרנטנט, השעו מחדש את הכדור במיליליטר אחד של ליזיס כדוריות דם אדומות, חוצצים ודגרו על קרח למשך חמש דקות.ליז pbcs דבקים, שאינם מוסרים מהמוח על ידי זלוף תוך אוראלי. הוסף תשעה מיליליטר של תאי שטיפה בינוניים RPMI וצנטריפוגה ב -250 פעמים G למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. Resus משהה את הלויקוציטים המבודדים במוח או גלולה המכילה BSL ב-50 עד 100 מיקרוליטר של מדיום RPMI ומעביר תאים לצינור מיקרו צנטריפוגה לספור תאים ברי קיימא תחת המיקרוסקופ באמצעות ציטומטר המו והדרה כחולה טריאן.שישה ימים לאחר ההדבקה, ניתן לשחזר 20,000 עד 100,000 BSLs לאחר קבלת ספירת התאים הקיימת. התאים מוכנים לניתוח על ידי ציטומטריית זרימה. הפרטים של נוהל זה ניתנים במסמך הנלווה, אך מסוכמים כאן תחילה.כל התאים המבודדים מכל מוח עוברים צנטריפוגה בצינור מיקרו פוגה של 1.5 מיליליטר ומושעיים מחדש במאגר צביעה עם נוגדנים חוסמי CD 16 ו-CD 32. לאחר דגירה של 10 דקות על קרח, התאים נשטפים שוב עם מאגר צביעה צנטריפוגה ומושעים מחדש במאגר צביעה המכיל נוגדנים פלואורסצנטיים נגד CD 4, anti CD 8 anti TCR ו-anti NK 1.1. התאים מודגרים על קרח למשך שעה אחת ונשטפים בכתמים, חיץ וצנטריפוגה.לאחר הסיבוב, התאים מושעים מחדש ב-PBS ולפחות 5,000 עד 10,000 אירועים נרכשים על ציטומטר זרימה. הנתונים המתקבלים מנותחים באמצעות תוכנת זרימה ציטומטרית מתאימה. אוכלוסיות BSL התאוששו ממוחות של עכברי ביקורת שנפגעו או או"ם, נגועים במלריה ונאיביים ונצבעו בנוגדני בטא pe, anti NK 1.1 ו-PC anti TCR.תרשימי נקודות אלה מתארים אחוזים של תאי NK, לימפוציטים T, תאים חיוביים ל-TCR חיוביים NK 1.1 ותאים שליליים כפולים. NK 1.1 TCR שלילי שלילי בעכברי ביקורת מאוחדים או לא מאוחדים, נגועים במלריה וביקורת נאיבית התואמים את הממצאים הקודמים. תאי T חיוביים ל-TCR אלפא בטא היוו שיעור גבוה ממאגר ה-BSL במוחם של עכברים נגועים במלריה ביום השישי לאחר ההדבקה.נראה כי אוכלוסייה זו מיוצגת באופן משמעותי במוחם של בעלי חיים שאינם מעוותים. הירידה לכאורה בתדירות תאי T במוחות לא מחולפים הייתה קשורה לאחוז גבוה משמעותית ולמספר הכולל של תאים שליליים כפולים בבעלי חיים אלה. אחוזים ומספרים גבוהים של תאים שליליים כפולים במוחות לא מזוהמים התגלו לא רק בעכברים נגועים במלריה, אלא גם בבקרות נאיביות המצביעות על כך שתאים אלה הם לויקוציטים לא דלקתיים הנמצאים בכלי דם במוח המתאוששים יחד עם תאים דלקתיים אם לא מבוצע זלוף תוך לבבי.בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לבצע שפע תוך קרדיולוגי נרחב של עכברים נגועים לפני מיצוי איברים כדי למנוע זיהום של לויקוציטים מבודדים בתאים במחזור דם לא דלקתיים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לבודד ולנתח לויקוציטים מופרדים במוח מעכברים נגועים בפלסמודיום וירגה על ידי גיאומטריה זורמת.

isolation-analysis-brain-sequestered-leukocytes-from-plasmodium

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מיקרוסקופיה Intravital לעקוב אחרי האירועים hemodynamic ו דלקתיות ומרחב ב microcirculation pial.

מיקרוסקופית Intravital של microcirculation המוח עכבר באמצעות חלון גולגולתי סגור

שיטה מהירה להשיג leukocytes חדירה מהמוח Murine מתואר. שיטה זו מנצלת שיפוע Percoll רציפה שיפוע Ficoll רציפה כדי לבחור ולטהר את שכבת ליקוציט מועשר. Leukocytes מבודד ואז עלול להיות מאופיין על ידי מדידות זרימת cytometric.

בידוד של המוח, שחדר Leukocytes

סרטון זה מדגים את הדור של מודל עכבר ניסיוני של מלריה מוחית. ספורוזואיטים שבודדו מנקבות יתושים נגועות בפלסמודיום ברגהיי מוזרקות לוורידי הזנב של עכבר מרוסן, מה שמוביל להפרעה במחסום הדם-מוח ולדלקת במוח, מה שגורם למלריה מוחית. מודל עכבר נגוע זה מציע כלי רב ערך לחקר פתולוגיה מיקרו-וסקולרית in vivo הקשורה למלריה מוחית.

יצירת מודל עכברי של מלריה מוחית ניסיונית באמצעות ספורוזואיטים שמקורם ביתושים מארחים

סרטון זה מדגים בדיקה לחיסון מודל עכבר עם ספורוזואיטים חיים מוחלשים. הפלסמודיום ספורוזואיטים המוחלשים בקרינה מוזרקים לצד הגבי של אוזנו של העכבר. לאחר הזרקות במספר מקומות בשתי האוזניים, העכבר רשאי להתאושש.

חיסון תוך עורי עם ספורוזואיטים חיים מוחלשים במודל עכבר

אנו מתארים כאן פרוטוקול לבידוד תאים מיאלואידים מעור העכבר וניקוז בלוטות הלימפה לאחר הזרקה תוך עורית של Plasmodium sporozoites. ציטומטריית זרימה של תאים שנאספו מספקת בדיקה אמינה לאפיון העור וניקוז התגובה הדלקתית של בלוטות הלימפה לטפיל.

בידוד תא מיאלואידית מעור העכבר וניקוז הלימפה הצומת בעקבות החיסון תוך-עורית עם נחלש חי<em&gt; Plasmodium</em&gt; Sporozoites

אנו מתארים מודל עכבר של מלריה מוחית ניסיונית ומראים כיצד ניתן לעקוב אחר פתולוגיה דלקתית ומיקרו-וסקולרית in vivo באמצעות הדמיית תהודה מגנטית.

בשנת מעקב Vivo של בצקת פיתוח ופתולוגיה מיקרוסקולרית במודל של מלריה מוחית ניסיוני באמצעות תהודה מגנטית הדמיה

בשל הדמיון הבולט של מחזור החיים ביולוגיה של טפילים מלריה מכרסמים לטפילים מלריה אדם, מודלים מלריה מכרסם הפכו חיוניים למחקר מלריה. בזאת, אנו מתוקננת כמה מן הטכניקות החשובות ביותר בשימוש בניתוח פנוטיפ של פראי סוג ומלריה מכרסם הטרנסגניים.

ניתוח פנוטימית של מלריה מכרסם טפיל מינית ושלבי דם מיניים ושלבי יתוש

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא להנחות כיצד לחלץ, לתחזק, ו הנתק מורטין אסטרוציט ו מיקרוגליה תאים ממערכת העצבים המרכזית, ואחריו זיהום עם טפילים פרוטותים.

בידוד הראשוני של אסטרוציטים ומיקרוגליה לזיהום טפיל

מלריה מועברת באמצעות חיסון של שלב sporozoite של פלסמודיום על ידי יתושים נגועים. פלסמודיום מהונדס איפשר לנו להבין טוב יותר את הביולוגיה של המלריה ותרם ישירות למאמצי פיתוח החיסון למלריה. כאן, אנו מתארים מתודולוגיה יעילה ליצירת פלסמודיום ברגהיי sporozoites מהונדס.

יצירת פלסמודיום מהונדס גנטית ברגהיי ספורוזואיטים

נכון להיום, פרוטוקולים לבידוד סימולטני של כל סוגי התאים העיקריים השוכנים במערכת העצבים המרכזית מאותו עכבר הם דרישה שלא נענתה. הפרוטוקול מראה הליך ישים בעכברים אוטואימוניים נאיביים וניסיוניים של אנצפלומיאליטיס לחקור רשתות סלולריות מורכבות במהלך דלקת עצבית ובו זמנית להפחית את מספר העכברים הנדרש.

בידוד סימולטני של סוגי תאים עיקריים תושבי מערכת העצבים המרכזית מעכברים אוטואימוניים בוגרים

התפתחות מינית של פלסמודיום מתרחשת במעי האמצעי של היתוש. התמקדות בשלבים המיניים של הטפיל היא אסטרטגיה מבטיחה לחסימת ההדבקה. פיתחנו את Ookluc, P. berghei טרנסגני המבטא ננו-לוציפראז לאחר היווצרות זיגוטה, המאפשר סינון בתפוקה גבוהה של תרכובות חוסמות העברה. מאמר זה מפרט את שיטות הבדיקה באמצעות Ookluc.

Ookluc: קו פלסמודיום ברגהיי לזיהוי תרכובות חוסמות שידור

למדו לבודד לויקוציטים דלקתיים מדפנות כלי הדם במוח של עכברים נגועים ב-Plasmodium berghei ANKA. שיטה זו מאפשרת אנליזה פנוטיפית באמצעות ציטומטריית זרימה רב-צבעית.

בידוד ואנליזה של Leukocytes המוחי מוחרם מ

גלה סרטונים נוספים