מיקרוסקופית Intravital של microcirculation המוח עכבר באמצעות חלון גולגולתי סגור

המטרה הכוללת של הליך זה היא לחקור מיקרו-סירקולציה במוח העכבר על ידי מיקרוסקופיה תוך-חיונית, המאפשרת מעקב אחר שינויים דינמיים בסמנים המודינמיים ודלקתיים במיקרו-סירקולציה של הערימה לאורך תקופות זמן ממושכות. טכניקה זו פותחה במכון הביו-הנדסי לה ג'ולה, שם היא שימשה לסוגים רבים של מחקרים. למשל, מעקב אחר שינויים המודינמיים במהלך זיהום פלסמודיום בורגי אונקה, ובזמן הביטוי של מלריה מוחית.

זה מושג על ידי השתלת חלון גולגולת כרוני שבועיים לפני מחקרי המיקרוסקופיה התוך-חיונית. השלב השני של ההליך הוא רישום המורפולוגיה הכוללת של חלון הגולגולת באמצעות תמונה דיגיטלית ברזולוציה גבוהה בהגדלה נמוכה. השלב השלישי של ההליך הוא רכישת תמונות מיקרוסקופיה תוך-חיונית באמצעות תאורה קונבנציונלית ופלואורסצנטית, ובחירת אתרי מחקר ספציפיים למדידות מקוונות של קוטר כלי הדם ומהירות ה-RBC.

השלב האחרון של ההליך הוא ביצוע ניתוח תוך-חיוני של היצמדות לויקוציטים וטסיות דם בכלי הערימה באמצעות נוגדנים ספציפיים המסומנים בפלואורסצנט. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות in vivo, שינויים מיקרו במחזור הדם במודלים של שיקוף מוחי של מצבים פיזיולוגיים פתופיזיולוגיים או חולים באמצעות מיקרוסקופיה תוך-חיונית של המוח כדי לבסס שינויים המודינמיים הקשורים למצבים אלה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאנו מתבוננים במוח בסביבתו הפיזיולוגית מבלי לחשוף אותו לסוכנים חיצוניים או למדיום מלאכותי, מיקרוסקופיה תוך-חיונית בהשוואה לתמונה, לתהודה מגנטית ואנגיוגרפיה יש רזולוציות מרחביות וזמניות ומאפשרות לנו להסתכל מהרמה המיקרוסקופית לרמה המיקרוסקופית.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בפיזיולוגיה ובפתופיזיולוגיה של מיקרו-סירקולציה במוח, כגון שינוי המודינמי ודלקתי במהלך מחלה חריפה וכרונית, שבועיים-שלושה לפני המיקרוסקופיה התוך-חיונית. קרניוטומיה מבוצעת בעכברים בני שמונה עד 10 שבועות שהודגמה בעבר למעט העובדה שמוט טיטניום אינו מונח בראש החיה. חלון הגולגולת הכרוני הוא תכשיר יציב, המאפשר בחינה של המיקרו-סירקולציה של הערימה גם חודשים לאחר ההשתלה ביום הניסוי.

ראשית, בדוק את טמפרטורת הגוף של החיה לפני הנחת החיה במסגרת סטריאוטקסית שהוחדרה אריתרוציטים בעלי תווית פלואורסצנטית שהוכנו בעבר דרך וריד הזנב של העכבר. זה יאפשר מעקב אחר אריתרוציטים, שיודגם בהמשך. ואז להרדים קלות את העכבר עם איזוף פלואור.

4% לאינדוקציה, 1% עד 2% לתחזוקה. לאחר מכן, הניחו את החיה במצב נוטה במסגרת סטריאוטקסית על כרית חימום. אבטח את הראש בזהירות באמצעות מוטות האוזניים והתאם את המפלס באמצעות הידית הימנית והשמאלית.

נקו בעדינות את החלקת הכיסוי על חלון הגולגולת בעזרת צמר גפן רטוב בשמן מינרלי. לאחר מכן באמצעות מיקרוסקופ סטריאו המחובר למצלמה דיגיטלית, צלם כמה תמונות פנורמיות של כלי השיט מתחת לחלון. לאחר העברת התמונות הפנורמיות למחשב, בחר את התמונה הטובה ביותר להדפסה, זיהוי ותאריך.

תמונה זו תשמש כמפה למדידות של קוטר כלי הדם ומהירויות כדוריות הדם האדומות, אשר יודגמו בהמשך כדי להתחיל במיקרוסקופיה תוך-חיונית. העבר את העכבר לשלב מיקרוסקופ תוך-חיוני מותאם אישית. הניחו טיפת מים על חלון הגולגולת תוך ניצול הבאר שנוצרה על ידי האקריליק הדנטלי.

נעשה שימוש ביעד טבילה במים פי 20 עם צמצם מספרי של 0.5. התמונות מוקלטות באמצעות שתי מצלמות, מצלמה דיגיטלית בתאורה חלשה, מצלמה מהירה המחוברת למחשב ולצג, ומצלמה אנלוגית לתאורה חלשה המחוברת לקלטת וידאו, חותמת זמן ומוניטור צבעוני לפני בחירת כלי הדם למדידה, בודקים את כלי הדם כדי להעריך את איכות התכשיר ואם זורם דם בכל כלי הדם, לאחר מכן בחר את הכלים למדידה. הם צריכים לכלול מקומות ועורקים בקטרים שונים ולכסות מקומות שונים בתוך האזור החשוף על ידי החלון.

בניסוי שלנו, אנו בוחרים 12 כלי דם למדידה כאשר אתם צופים בשדות שונים בתוך חלון הגולגולת. כדי לבחור את הכלים, ציין את המיקום המדויק של כל נקודה שיש למדוד בתצלום של כלי הדם PY שצולם קודם לכן עבור כל נקודה, קוטר הכלי נמדד באמצעות מכשיר גזירה תמונה. לאחר בחירת הנקודה, תמונת הכלי מיושרת במצב אנכי והתמונה נגזזת עד להיפך.

הקצוות מיושרים והקריאה מתועדת. לצורך מעקב אחר אריתרוציטים, כל נקודה מוקלטת על ידי המצלמה הדיגיטלית למשך 30 שניות לפחות, ותמונות הווידאו מוקלטות ב-150 פריימים לשנייה. קצב זה מוגדר לקבל תמונה אחת עד שש תמונות של תא על מסגרת וידאו אחת לקביעת מהירויות של עד שישה מילימטרים לשנייה.

לאחר סיום איסוף הנתונים, הסר את העכבר מהמסגרת הסטריאוטקסית והחזיר אותו לכלוב שלו כדי להתאושש מההרדמה באמצעות תוכנה מתאימה. תמונות הווידאו שנרכשו הן דיגיטליות ו-XY. מתקבלים נתוני קואורדינטות עבור כל תמונת תא. מיקומי התאים נקבעים באופן ידני ולא על ידי ניתוח תמונה.

בהתחשב בכך שעינו של צופה מיומן נותנת הערכה טובה של מיקום מרכז התא, אשר באופן כללי תואם את מיקום הקרינה המקסימלית שנצפתה. עבור רוב כיווני התאים, קביעות מיקום ומהירות נעשות עבור 15 תאים בכל כלי. ממוצע להשגת מהירות RBC ממוצעת ברגע שמדידות קוטר הכלי ומהירות RBC זמינות.

חישוב זרימת הדם בכל כלי יכול להיעשות על ידי שימוש בנוסחה Q שווה D על פני שני ריבועים כפול PI כפול V כאשר Q שווה לזרימת הדם V שווה למהירות RBC, ו-D שווה לקוטר הכלי להערכת שפע וניתוח היצמדות לויקוציטים בכלי ערימה. מיקרוסקופיה תוך-חיונית מבוצעת על בעל חיים שהוחדר אליו תערובת של אלבומין המסומן FSE ונוגדנים כנגד סמן הלויקוציטים הפאן CD 45 המסומן באדום טקסס. האלבומין הפלואורסצנטי המסומן מאפשר הדמיה משופרת של רשת כלי הדם, כולל כלי דם חודרים והוא שימושי במיוחד במצבי מחלה כמו מלריה מוחית כדי לבדוק אם אין כלי דם לא מחוללים או מתחת לכלי דם.

הנוגדנים הפלואורסצנטיים המסומנים נגד CD 45 מקלים על זיהוי וכימות גלגול לויקוציטים והיצמדות לכלי ערימה. כימות הידבקות הלויקוציטים נעשה על ידי ספירת מספר הלויקוציטים באורך כלי של 100 מיקרון. הגלגול מכומת על ידי ספירת מספר הלויקוציטים הנעים במהירות איטית משמעותית ממהירות הדם באותו אורך של 100 מיקרון במשך 30 שניות. המוצג.

הנה דוגמה למדידות מהירות תאי דם אדומים מיקרו-וסקולריים על ידי מעקב אחר תאים מפלואורסצנטיות במהירות גבוהה. תמונות הקלטות וידאו A עד F הן תמונות רצף של המיקרו-סירקולציה. כל תמונה מייצגת את המיקום של תא דם אדום זורם בודד, שנלכד פריים אחר פריים על ידי המצלמה המהירה.

הגרף הזה מניסוי מייצג מראה את השינויים בזרימת הדם בערימה לאורך זמן. בעכברים נגועים בפלסמודיום, בורגי ואונקה ובעכברי ביקורת לא נגועים, בעוד שבעכברי ביקורת, זרימת הדם בערימה יציבה יחסית לאורך זמן. עכברים נגועים ב-PBA מראים ירידה בזרימת הדם בשוק בזמן התפתחות מלריה מוחית.

ביום השישי, צביעה באנטי CD 45, נוגדנים פלואורסצנטיים אדומים מטקסס מגלים מספר רב של לויקוציטים הנצמדים לכלי ערימה של עכבר נגוע בפלסמודיום בורגי אונקה. להליך זה יש מגוון רחב של יישומים מלבד העבודה האחת כאן היום. ניתן להתאים כל טכניקה אופטית שניתן להשתמש בה in vivo למודל זה וניתן לחקור במודל זה פרמטרים כגון רקמה, רקמת רמת חמצן, מיני חמצן תגובתי pH ואינטראקציה אנדותל עם לויקוציטים.