Name: מיקרוסקופית Intravital של microcirculation המוח עכבר באמצעות חלון גולגולתי סגור (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-18T18:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: למדו מיקרוסקופיה אינטרוויטלית של מיקרו-מחזור הדם במוח עכבר באמצעות חלון גולגולתי כרוני. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר שינויים המודינמיים ותגובות דלקתיות בזמן אמת לאורך זמן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים R01-HL87290, R01-HL87290-S1 ו-R01 AI082610 מן המכון הלאומי לבריאות בארה&quot;ב כדי LJMC.

1. Craniotomy Craniotomy ב 8 ל-10-שבוע בעכברים הישנים יש לבצע מראש כמו 1 שתואר לעיל, פרט לכך בר טיטניום אינו ממוקם בראש של החיה. חלון גולגולתי כרוני הוא יציב ומאפשר בדיקה הכנה של microcirculation pial אפילו חודשים לאחר השתלה. בדרך כלל, אנו מבצעים מחקרים שלנו 2-3 שבועות לאחר ההשתלה את החלון גולגולתי. 2. Intravital מיקרוסקופיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שני שלושה שבועות לאחר craniotomy, טמפרטורת הגוף מסומנת ולאחר מכן העכבר הוא הרדים קלות isoflurane (4% לזירוז,% 1-2 לצורך תחזוקה). הרדמה אור משמש כדי למנוע מתח חיה ואי נוחות במהלך ההליך הניסיוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעלי חיים ממוקמות אז על מסגרת stereotaxic וראש מאובטח בקפידה באמצעות מוטות אוזן בעמדת מועדים. רמת מותאם באמצעות מנופים על ימין ועל שמאל. טמפרטורת הגוף Core נשמר באמצעות כרית חימום. כי עכברים עם מלריה מוחית לפתח היפותרמיה, את הגדרות הטמפרטורה צריך להיות מותאם עבור כל חיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחליק לכסות על חלון גולגולתי הוא ניקה בעדינות עם ספוגית צמר גפן טבולה שמן מינרלי תמונה פנורמית של כלי מתחת לחלון נלקחת בעזרת stereomicroscope לבין מצלמה דיגיטלית (Nikon Coolpix 995, יפן). התמונה מודפסת, המזוהה ומתוארך וישמש כמפה עבור מדידות של קוטר כלי ו כדוריות דם אדומות (RBC) מהירויות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העכבר הוא הועבר לאחר מכן בשלב מיקרוסקופ intravital (אישית לייקה-McBain, סן דייגו, קליפורניה). טיפת מים מונחת על החלון גולגולתי מנצל את יצרו גם אקריליק על ידי השיניים, להתמקד מותאם. המדידות מתבצעות באמצעות טבילה 20X (LUMPFL-לאגודה, מספרי הצמצם 0.6, אולימפוס) המטרה מים. הכלים אותם הם בעקבות כך השוואה ישירה לרמות הבסיס שלהם ניתן לבצעו המאפשר סטטיסטיקה יציב יותר עבור אוכלוסיות מדגם קטן. תמונות נלכדים באמצעות אור דיגיטלי נמוך במהירות גבוהה המצלמה (C9300 Hamamatsu-221, יפן), או אור נמוך מצלמה אנלוגית (COHU 4815, בסן דייגו, קליפורניה) קשור לקלטת וידאו (JVC, יפן), חותמת זמן (וידאו MicroImage מערכות, Boyertown, PA) וצג צבע (PELCO, קלוביס, CA). הקלטת מזוהה כראוי לפני תחילת ההקלטה, ואת חותמת הזמן מאפשר זיהוי של האירועים על ידי המתעדים את הזמן שבמהלכו אירועים כאלה היו recoded. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המחאה הראשונה של כלי נעשית על מנת להעריך את איכות של התכשיר ואם הדם זורם בתוך כלי כל. ואז, מבחר של כלי למדוד מורכב וזה צריך לכלול venules ו arterioles של קטרים ​​שונים (בהכנות עכבר pial שלנו, רוב כלי בטווח בין 20 ל 80μm) ומכסים במקומות שונים בשטח חשוף ליד החלון. Arterioles ו venules ניתן להבדיל בקלות על ידי בדיקת כיוון זרימת הדם ההשלכות של כלי השיט (אם זה מפיץ או אוסף דם). במחקרים שלנו, מדידות נעשות 12 כלי שיט. המיקום המדויק של כל נקודה כדי להימדד הוא המבואר בתמונה של vasculature pial. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל נקודה, קוטר כלי נמדד באמצעות מכשיר גזירה התמונה (לגזור תמונה, Vista אלקטרוניקה, בסן דייגו, קליפורניה) 2. לאחר נקודה זו מסומנת, תמונה של כלי מיושר במצב אנכי ואת התמונה הוא טעון עד הקצוות בניגוד מיושרים והקריאה מתועדת. ערך זה יכול להיתרגם מיקרומטר ידי כיול הקודם עבור כל הגדלה מסוימת באמצעות כיול reticle שלב מיקרומטר (אדמונד Optics Inc, ברינגטון, NJ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקום כל שנרשמו במהלך 30 שניות לפחות למעקב כדורית אדומה. במשך המעקב, דגימת דם נאסף ו אריתרוציטים מסומנים fluorescently עם carbocyanine לצבוע דיל (בדיקות מולקולריות, Carlsbad, CA) ואת חדורים דרך וריד הזנב להשיג ריכוז vivo של 0.4-0.5% ~ 3. אצל בעלי חיים נגועים Plasmodium berghei אנקה (PBA) המבטאים את חלבון הפלואורסצנט הירוק (PBA-GFP, תרומה מן המחקר מלריה מגיב הפניה מרכז MR4, Manassas, VA, שהופקד על ידי CJ Janse ו AP ווטרס), לא עירוי של תווית התא הוא הכרחי. התמונות וידאו נרשמות 150 מסגרות לשנייה. שיעור זה מוגדר להשיג 05:59 תמונות של תא על מסגרת וידאו אחד לקביעת מהירויות של עד 8 מ"מ / s. תמונות וידאו דיגיטלית עם מחשב אישי באמצעות תוכנת Adobe Premier 4.0, ו - xy נתונים לתאם עבור כל תמונה התא מתקבלים באמצעות SigmaScan Pro 4.0 התוכנה (SPSS שיקגו, אילינוי) 4. עמדות Cell נקבעים באופן ידני ולא על ידי ניתוח התמונה, בהתחשב בכך את עינו של הצופה מיומן הוצגה לתת הערכה טובה של מיקום מרכז התא, אשרח בכלל מתאים למיקום של הקרינה המרבית נצפתה עבור אוריינטציות תא ביותר. קביעות מרובות של המיקום ואת המהירות מיוצרים עבור כל תא ממוצעים להשיג ממוצע מהירות RBC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר המדידות RBC מהירות מבוצעות מקוון, זמן תצפית סך כל עכבר אינו עולה על 10-15 דקות מזעור ההשפעות cardiodepressive של הרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר קוטר כלי מדידות מהירות RBC זמינים, החישוב של זרימת הדם בכלי זה יכול להתבצע באמצעות הנוסחה: Q = V x π (D / 2) 2, שם ש = זרימת הדם, V = מהירות RBC ו-D = קוטר כלי הדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נהלים אלה ניתן לחזור לאורך זמן. לדוגמה, במודל עכבר של קדחת המוח, אנו מבצעים מדידות יומי החל ביום 4 של זיהום. הערכים המתקבלים כל יום במשך כל עכבר מנורמל הן ביחס ליום 0 (טרום זיהום), אשר נחשב 100%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנוסף קוטר כלי הדם וזרימת מדידות, הערכות נוספות יכול להתבצע, למשל הערכה משופרת של זלוף ועל ניתוח של גלגול ליקוציט ו / או טסיות דם דבקות בכלי pial. מדידות אלה מבוצעות בעזרת סמנים ניאון שכותרתו. במקרה של מלריה, אנו יכולים גם לזהות במחזור או טפילים חסיד באמצעות שימוש זן PBA המבטא GFP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להערכת זלוף אנו משתמשים בפתרון של FITC שכותרתו אלבומין (Sigma, סנט לואיס, מיזורי 50μg/mouse), וכן לכמת דבקות ליקוציט לכלי pial אנו משתמשים נוגדנים כנגד סמן הפאן ליקוציט CD45 שכותרתו עם טקסס אדום (TxR) ( Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה 4μg/mouse). לשם כך, 25μL של אלבומין-FITC (2mg/mL) ו 20μL של נוגדנים נגד CD45-PE (200μg/mL) מעורבבים והזריקו ברוח טרום חימם את הזנב. עכבר אז יכול להיות צילמו מיד, אולם אם מדידות זליגה ייקח אלבומין-FITC מותר להסתובב במשך 15 דקות. פלואורסצנטי ירוק (518nm) הנפלטת אלבומין-FITC ו-GFP (PBA-GFP pRBC) הוא שנתפסו באמצעות אלפא ו Vivid: XF100-2 (אומגה אופטי, Brattleboro, VT), אנטי-CD45 TxR פלואורסצנטי (615nm) הוא יצא ו שנתפסו עם תקן Vivid: XF42. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניאון שכותרתו אלבומין מאפשרת הדמיה משופרת של רשת כלי הדם, כולל כלי חודר, והיא שימושית במיוחד במצבי מחלה כמו מלריה מוחית כדי לבדוק את כלי הלא perfused או מתחת perfused. זה יכול לשמש גם כדי למדוד את זליגת הדם 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניאון שכותרתו אנטי CD45 נוגדנים לעשות את זה קל לזהות ולכמת מתגלגל הידבקות לויקוציטים וכן כלי pial. כדי למנוע הטיה כימות, אנו לכמת מתגלגלת הידבקות באותם המקומות שהוגדרו מראש כדי למדוד את זרימת הדם. כימות של הידבקות לויקוציטים נעשית על ידי ספירת לויקוציטים באורך 100μm-כלי. רולינג היא לכמת ידי ספירת לויקוציטים נע במהירות איטית יותר באופן משמעותי את מהירות דם באורך 100μm זאת, במהלך 30 שניות. </li></ol> 3. נציג תוצאות <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig1.jpg" alt="איור 1"> באיור 1. (שלב 2.6) תמונות של רשת כלי הדם עכבר pial נגיש דרך החלון גולגולתי. <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig2.jpg" alt="איור 2"> איור 2. (שלבים 3.1-3.5) סכמטי התצוגה של הגדרת עבור מיקרוסקופיה intravital של microcirculation העכבר pial. 1: מיקרוסקופ intravital; 2: 20X טבילה במים אובייקטיבי; 3: מקור אור, 4a: דיגיטלי נמוך לאור מהירות גבוהה המצלמה; 4b: מצלמה אנלוגית: 5: עכבר במסגרת stereotaxic; 6: צג המחשב; 7: אנלוגי שירר צג מראה כיצד הגז תמונה (חץ) נעשה כדי למדוד קוטר כלי הדם. <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig3.jpg" alt="איור 3"> איור 3. (שלב 3.6-3.8) כלי הדם כדוריות דם אדומות מהירות מדידות על ידי מעקב התא גבוה הקלטות מהירות הקרינה וידאו. תמונות ל-F הם תמונות ברצף של כלי one pial, מראה RBC נע אחד חוצה את התחום בשדה מיקרוסקופי על ידי המצלמה. קביעה ידנית של מסגרת על ידי עמדות מסגרת של 15 תאים או יותר חוצה את השדה, עם המרחק מראש מכויל שלה, המאפשר חישוב מהירות RBC אומר בכלי זה בעזרת גיליון אלקטרוני של Excel. <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig4.jpg" alt="איור 4"> איור 4. (שלב 3.9) נתוני הניסוי נציג מראה את השינויים בזרימת הדם pial לאורך זמן Plasmodium berghei אנקה (PBA) עכברים נגועים (n = 5) ו בעכברים השליטה נגוע (n = 5). בעוד עכברים לשלוט על זרימת הדם pial יציב יחסית לאורך זמן, PBA נגועים עכברים להראות ירידה ניכרת בזרימת הדםבזמן התפתחות מלריה מוחית (יום 6). הנתונים הם ממוצע ± SEM. <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig5.jpg" alt="איור 5"> איור 5. (שלב 4.3) מספר רב של לויקוציטים חסיד לכלי pial של עכבר נגוע Plasmodium berghei אנקה, כפי שעולה מכתים עם אנטי-CD45 טקסס נוגדנים אדום ניאון.

<ol><li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+craniotomy+surgery+procedure+for+chronic+brain+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging.</a> J. Vis. Exp. (15), (2008).</li>
<li>Intaglietta, M., Tompkins, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+measurements+by+video+image+shearing+and+splitting%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Microvascular measurements by video image shearing and splitting.</a> Microvasc. Res. 5, 309-312 (1973).</li>
<li>Briceno, J. C., Cabrales, P., Tsai, A. G., Intaglietta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radial+displacement+of+red+blood+cells+during+hemodilution+and+the+effect+on+arteriolar+oxygen+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Radial displacement of red blood cells during hemodilution and the effect on arteriolar oxygen profile.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 286, 1223-1228 (2004).</li>
<li>Bishop, J. J., Nance, P. R., Popel, A. S., Intaglietta, M., Johnson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+erythrocyte+aggregate+size+and+flow+rate+in+skeletal+muscle+venules%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Relationship between erythrocyte aggregate size and flow rate in skeletal muscle venules.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 286, H113-120 (2004).</li>
<li>Baldwin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+hemoglobins+produce+venular+interendothelial+gaps+and+albumin+leakage+in+the+rat+mesentery%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Modified hemoglobins produce venular interendothelial gaps and albumin leakage in the rat mesentery.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 277, H650-H659 (1999).</li>
<li>Cabrales, P., Zanini, G. M., Meays, D., Frangos, J. A., Carvalho, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+cerebral+malaria+is+associated+with+a+vasospasm-like+microcirculatory+dysfunction%2C+and+survival+upon+rescue+treatment+is+markedly+increased+by+nimodipine%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Murine cerebral malaria is associated with a vasospasm-like microcirculatory dysfunction, and survival upon rescue treatment is markedly increased by nimodipine.</a> Am. J. Pathol. 176 (3), 1306-1315 (2010).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

השיטה המתוארת כאן מיקרוסקופיה intravital מספק כלי ייחודי ורב עוצמה להתבוננות מפורטת של microcirculation pial בתוך העכבר. זה מאפשר בידודם arterioles הפרט venules ומדידת שינויים של מספר פרמטרים כגון קוטר כלי, מהירויות RBC, זרימת הדם, היצמדות וגלגול של לויקוציטים, טסיות הדם וגורמים אחרים, דליפת הדם, pH רקמות pO2 רבות אפשריות אחרות יישומים. בתגובה וסקולרית vivo ניתן להעריך באופן מיידי על התערבויות הממשל כגון תרופות, או במהלך תהליכים פתולוגיים. יתר על כן, התנהגות micr...

<table><tbody><tr><td>איזופלוראן</td><td>Baxter International Inc.</td><td>FDG9623</td><td></td></tr><tr><td>צבע קרבוציאנין DiI </td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>D306</td><td></td></tr><tr><td>Albumin-FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9771</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן Anti-CD45-TxR</td><td>Invitrogen</td><td>MCD4517</td><td></td></tr><tr><td>&lt;מיקרוסקופיה אלקטרונית&gt;*P. berghei*&lt;/em&gt; ANKA-GFP</td><td>MR4</td><td>MRA-865</td><td></td></tr></tbody></table>

מיקרוסקופית intravital של microcirculation המוח עכבר באמצעות חלון גולגולתי סגור

Intravital Microscopy of the Mouse Brain Microcirculation using a Closed Cranial Window

מודל זה הניסוי תוכנן לאמוד את microcirculation עכבר pial במהלך hemodynamic, אקוטי וכרוני פיזיולוגיים pathophysiological, התנאים דלקתיות מטבולית, באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ב vivo. חלון סגור גולגולתי ממוקמת מעל קליפת parieto-העורפית השמאלית של העכברים. Microcirculation מקומי נרשם בזמן אמת דרך החלון באמצעות EPI ו תאורה פלואורסצנטי, מדידות של קטרים ​​כלי שיט תא הדם האדומים (RBC) מהירויות מבוצעות. מהירות RBC נמדד בזמן אמת צולבות מתאם ו / או אריתרוציטים ניאון שכותרתו. דבקות ליקוציט ואת טסיות לכלי pial והערכה של זלוף ו דליפה של כלי הדם נעשים בעזרת סמנים פלואורסצנציה שכותרתו כגון אלבומין-FITC נוגדנים אנטי-CD45 TxR. Microcirculation ניתן וידאו מוקלט שוב ​​ושוב על פני כמה ימים. השתמשנו בפעם הראשונה את החלון קרוב המוח מיקרוסקופיה intravital ללמוד את microcirculation pial לעקוב אחרי שינויים דינמיים במהלך זיהום Plasmodium אנקה berghei בעכברים מראים ביטוי של CM קשורה בתפקוד microcirculatory מאופיין vasoconstriction, הירידה העמוקה בדם זרימת הדם ובסופו של דבר לקרוס.

מיקרוסקופיה Intravital לעקוב אחרי האירועים hemodynamic ו דלקתיות ומרחב ב microcirculation pial.

מיקרוסקופית Intravital של microcirculation המוח עכבר באמצעות חלון גולגולתי סגור

מודל ניסיוני זה תוכנן להערכת המיקרו-סירקולציה הפיאלית בעכברים במהלך מצבים המודינמיים פיזיולוגיים ופתופיזיולוגיים, חריפים וכרוניים, ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לחקור מיקרוסירקולציה במוח של עכבר באמצעות מיקרוסקופיה אינטרה-ויטלית (intravital microscopy), המאפשרת מעקב אחר שינויים דינמיים במדדים המודינמיים ודלקתיים במיקרוסירקולציה של ה-pile לאורך פרקי זמן ממושכים. טכניקה זו פותחה ב-La Jolla Bioengineering Institute, שם היא שימשה למגוון סוגי מחקרים. לדוגמה, מעקב אחר שינויים המודינמיים במהלך זיהום ב-plasmodium burgi onca, ובזמן ביטוי של מלריה מוחית.דבר זה מושג תחילה על ידי השתלת חלון גולגולתי כרוני שבועיים לפני מחקרי המיקרוסקופיה האינטרה-ויטלית (intravital). השלב השני של הפרוצדורה הוא תיעוד המורפולוגיה הכללית של החלון הגולגולתי באמצעות תמונה דיגיטלית ברזולוציה גבוהה בהגדלה נמוכה. השלב השלישי של הפרוצדורה הוא רכישת תמונות מיקרוסקופיה אינטרה-ויטלית באמצעות תאורה קונבנציונלית ופלואורסצנטית, ובחירת אתרי מחקר ספציפיים למדידות מקוונות של קוטר כלי דם ומהירות RBC.השלב האחרון של הפרוצדורה הוא ביצוע אנליזה אינטרה-ויטלית (intravital) של היצמדות לוקוציטים וטסיות דם בכלי הדם ב-pile באמצעות נוגדנים ספציפיים המסומנים פלואורסצנטית. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות in vivo שינויים במיקרו-סירקולציה במוח המשקפים מצבים פיזיולוגיים, פתופיזיולוגיים או מחלתיים באמצעות מיקרוסקופיה אינטרה-ויטלית של המוח, כדי לבסס שינויים המודינמיים הקשורים למצבים אלה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאנו צופים במוח בסביבתו הפיזיולוגית מבלי לחשוף אותו לסוכנים חיצוניים או למצע מלאכותי; למיקרוסקופיה אינטרה-ויטלית יש רזולוציות מרחביות וזמניות גבוהות יותר בהשוואה ל-MRI ואנגיוגרפיה, והיא מאפשרת לנו לבחון את המוח מרמה מיקרוסקופית.שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בפיזיולוגיה ובפתופיזיולוגיה של המיקרוסירקולציה במוח, כגון שינויים המודינמיים ודלקתיים במהלך מחלה חריפה וכרונית. שבועיים עד שלושה שבועות לפני ביצוע המיקרוסקופיה בתוך החי (intravital microscopy), מבוצעת קרניאוטומי במוח של עכברים בני שמונה עד 10 שבועות, כפי שהודגם בעבר, למעט העובדה שאינו מושתל מוט טיטניום בראשו של בעל החיים. החלון הגולגולתי הכרוני הוא תכשיר יציב, המאפשר בחינה של המיקרוסירקולציה במוח גם חודשים לאחר השתלתו ביום הניסוי.ראשית, בדוק את טמפרטורת הגוף של בעל החיים לפני הצבתו במסגרת סטריאוטקסיקה, והזרק Erythrocytes המסומנים פלואורסצנטית שהוכנו מראש דרך וריד הזנב של העכבר. פעולה זו תאפשר מעקב אחר ה-Erythrocytes, כפי שיוצג בהמשך. לאחר מכן, הרדם קלות את העכבר באמצעות isof fluorine.4% להשראה, 1% עד 2% לתחזוקה. לאחר מכן, הנח את החיה במצב שכיבה על הבטן (prone position) בתוך מסגרת סטריאוטקסית על פד חימום. קבע את הראש בזהירות באמצעות מוטות האוזניים וכוון את הגובה באמצעות המנופים הימני והשמאלי.נקה בעדינות את לכיסוי הזכוכית (cover slip) על החלון הגולגולתי באמצעות מקלון צמר גפן טבול בשמן מינרלי. לאחר מכן, באמצעות מיקרוסקופ סטריאו המחובר למצלמה דיגיטלית, צלם מספר תצלומי פנורמה של כלי הדם מתחת לחלון. לאחר העברת תצלומי הפנורמה למחשב, בחר את התצלום הטוב ביותר להדפסה, זיהוי ותאריך.תמונה זו תשמש כמפה למדידות של קוטר כלי דם ומהירויות של תאי דם אדומים, אשר יודגמו בשלב הבא כדי להתחיל במיקרוסקופיה intravital. העבירו את העכבר לבמה מותאמת של מיקרוסקופ intravital. הניחו טיפת מים על החלון הגולגולתי, תוך ניצול השקע שנוצר על ידי האקריליק הדנטלי.נעשה שימוש בעדשה אובייקטיבית עם הגדלה של 20x בטבילה במים ועם מפתח מספרי (numerical aperture) של 0.5. תמונות מוקלטות באמצעות שתי מצלמות: מצלמה דיגיטלית לתאורה נמוכה ומהירות גבוהה המחוברת למחשב ולמסך, ומצלמה אנלוגית לתאורה נמוכה המחוברת למקלט וידאו (VCR), למסמן זמן ולמסך צבעוני. לפני בחירת כלי הדם למדידה, יש לבחון את כלי הדם כדי להעריך את איכות ההכנה; אם הדם זורם בכל כלי הדם, ניתן לבחור את כלי הדם למדידה. הבחירה צריכה לכלול ורידים ועורקים בקטרים שונים ולכסות מיקומים שונים בתוך השטח החשוף דרך החלון.בניסוי שלנו, אנו בוחרים 12 כלי דם למדידה בעודכם בוחנים שדות שונים בתוך החלון הגולגולתי. כדי לבחור את כלי הדם, סמנו את המיקום המדויק של כל נקודה למדידה בתמונה של כלי הדם ב-PY שצולמה קודם לכן; עבור כל נקודה, קוטר כלי הדם נמדד באמצעות התקן לגזירת תמונות (image shear device). לאחר בחירת הנקודה, תמונת כלי הדם מיושרת במצב אנכי והתמונה נגזרת עד לצד המנוגד.הקצוות מיושרים והקריאה מתועדת. לצורך מעקב אחר תאי דם אדומים (erythrocytes), כל נקודה מוקלטת על ידי המצלמה הדיגיטלית למשך 30 שניות לפחות, ותמונות הווידאו מוקלטות בקצב של 150 פריימים לשנייה. קצב זה נקבע כדי להשיג תמונה אחת עד שש של תא בפריים וידאו אחד, לצורך קביעת מהירויות של עד שישה מילימטרים לשנייה.בסיום איסוף הנתונים, הוציאו את העכבר מהמסגרת הסטריאוטקסית והחזירו אותו לכלובו כדי להתאושש מההרדמה תוך שימוש בתוכנה המתאימה. תמונות הווידאו שנרכשו עוברות דיגיטציה ומתקבלים נתוני XY.Coordinate עבור כל תמונת תא. מיקומי התאים נקבעים באופן ידני ולא באמצעות ניתוח תמונה.בהינתן שעיינו של צופה מיומן מספקת הערכה טובה של מיקום מרכז התא, שבאופן כללי תואם למיקום הפלואורסצנציה המקסימלית שנצפתה. עבור רוב אוריינטציות התאים, קביעת המיקום והמהירות מבוצעת עבור 15 תאים בכל כלי דם. מחושב ממוצע כדי לקבל את מהירות ה-RBC הממוצעת לאחר שנתוני קוטר כלי הדם ומדידות מהירות ה-RBC זמינים.ניתן לחשב את זרימת הדם בכל כלי דם באמצעות הנוסחה Q שווה ל-(D חלקי 2) בריבוע כפול PI כפול V, כאשר Q מייצג את זרימת הדם, V מייצג את מהירות ה-RBC, ו-D מייצג את קוטר כלי הדם, לצורך הערכת הפרפוזיה וניתוח היצמדות לוקוציטים בכלי דם קפילריים. מיקרוסקופיה אינטרה-ויטלית (Intravital microscopy) מבוצעת בבעל חיים שהוזרקה לו תערובת של אלבומין המסומן ב-FSE ונוגדנים נגד הסמן הפאן-לוקוציטרי CD 45 המסומנים ב-Texas Red. האלבומין המסומן פלורסצנטית מאפשר ויזואליזציה משופרת של הרשת הווסקולרית, כולל כלי דם חודרים, והוא שימושי במיוחד במצבי מחלה כגון מלריה מוחית כדי לבדוק קיומם של כלי דם שאינם מקבלים פרפוזיה או מקבלים פרפוזיה נמוכה.הנוגדנים למסומנים פלואורסצנטית נגד CD 45 מקלים על זיהוי וכימות של גלגול (rolling) והיצמדות של לוקוציטים לכלי דם. כימות של היצמדות לוקוציטים מבוצע על ידי ספירת מספר הלוקוציטים לאורך כלי דם של 100 micron. גלגול מכומת על ידי ספירת מספר הלוקוציטים הנעים במהירות נמוכה משמעותית ממהירות הדם באותו אורך של 100 micron במהלך 30 שניות. מוצג.להלן דוגמה למדידות מהירות של תאי דם אדומים במיקרווסקולריקה באמצעות מעקב אחר תאים מתוך פלואורסצנציה במהירות גבוהה. הקלטות הווידאו בתמונות A עד F הן רצפי תמונות של המיקרוסירקולציה. כל תמונה מייצגת את מיקומו של תא דם אדום בודד בזרימה, אשר נלכד פריים אחר פריים על ידי המצלמה המהירה.גרף זה מניסוי מייצג מראה את השינויים בזרימת הדם בערך (pile blood flow) לאורך זמן. בעכברים שהודבקו ב-plasmodium, burgi, onca ובעכברי ביקורת שאינם מזוהמים, בעוד שבעכברי ביקורת, זרימת הדם בערך היא יציבה יחסית לאורך זמן. עכברים שהודבקו ב-PBA מראים ירידה ניכרת בזרימת הדם בזמן התפתחותה של מלריה מוחית.ביום השישי, צביעה עם נוגדנים פלואורסצנטיים מסוג Texas red נגד CD 45 חושפת מספר רב של לוקוציטים הנצמדים לכלי דם של עכבר שהודבק ב-plasmodium burgi onca. לנוהל זה מגוון רחב של יישומים מעבר למטרה המוצגת כאן היום. ניתן להתאים למודל זה כל טכניקה אופטית שניתן להשתמש בה in vivo, ובמודל זה ניתן לחקור פרמטרים כגון רקמה, רמת חמצן ברקמה, pH, מיני חמצן רעילים (reactive oxygen species) ואינטראקציה אנדותלייאלית עם לוקוציטים.

intravital-microscopy-mouse-brain-microcirculation-using-closed

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

קליפתיים זרימת הדם דינמיקה ניתן ללמוד in vivo על ידי הדמיה צבעי ניאון dextran מוזרק לווריד הזנב של מכרסמים עם מיקרוסקופיה 2-פוטון. סרט הווידאו הזה מראה כיצד דם תמונה הדינמיקה לזרום הניאוקורטקס של עכברים באמצעות הכנה זכוכית מכוסה, חלון גולגולתי.

שיטה הדמיה 2-פוטון של זרימת הדם הניאוקורטקס דרך חלון גולגולתי

אנו מציגים שיטה ליצירת חלון הדמיה בגולגולת העכבר החובקת מילימטרים והוא יציב במשך חודשים ללא דלקת של המוח. שיטה זו גם מתאים מחקרים ארוכי טווח של זרימת דם, דינמיקה סלולריים, ותא / מבנה כלי הדם באמצעות שני פוטונים במיקרוסקופ.

מלוטשת מחוזק דליל, הגולגולת חלון הדמיה לטווח ארוך של מוח עכבר

בסרטון זה אנו מבצעים הדמיה תוך-חיונית של תאי סרטן שהוזרקו מראש במודל עכבר דרך חלון גולגולת מושתל. טכניקת הדמיה זו ברזולוציה גבוהה של קיטועי זמן מאפשרת לחקור התנהגות דינמית של תאים סרטניים בעכבר החי.

הדמיה תוך-חיונית מבוססת חלון גולגולת במודל עכבר: טכניקת הדמיה לחקר ההתנהגות של תאי סרטן שהוזרקו מראש במוח של מודל מורין

מקור: Sweeney, A. M., et al. הדמיה in vivo של הובלת נוזל מוחי שדרתי דרך גולגולת העכבר השלמה באמצעות מקרוסקופיה פלואורסצנטית. J. Vis. Exp. (2019)סרטון זה מדגים את תהליך הדמיית זרימת נוזל המוח השדרתי (CSF) במוח עכבר באמצעות הדמיה פלואורסצנטית. עוקב פלואורסצנטי מוזרק לתוך בור המים (CM), ומאפשר לעקוב אחר תנועתו עם CSF דרך החללים התת-עכבישיים והפרי-וסקולריים. הדמיית זמן-lapse לוכדת את מסעו של העוקב, ומדגישה את התפשטותו לרקמת המוח דרך העורקים.

הדמיה in vivo של הובלת נוזל מוחי שדרתי במוח עכבר באמצעות מקרוסקופיה פלואורסצנטית

חסימה כירורגי של ענף עורק דיסטלי באמצע המוח (MCAo) היא מודל משמש לעתים קרובות במחקר שבץ ניסיוני. כתב יד זה מתאר את הטכניקה הבסיסית של MCAo קבע, בשילוב עם הכניסה של חלון גולגולתי לרוחב, אשר מציעה את ההזדמנות עבור מיקרוסקופיה intravital אורך בעכברים.

הכנת חלון גולגולת כרוני לרוחב מאפשרת In vivo תצפית בעקבות העורקים התיכון ספיגה מוחין דיסטלי של עכברים

כתב יד זה מתאר הליך לעקוב אחר השיפוץ של cerebrovasculature במהלך הצטברות פלאק עמילואיד in vivo באמצעות שני פוטונים במיקרוסקופ אורך. הכנה הגולגולת דליל מאפשר הדמיה של צבעי ניאון כדי להעריך את התקדמות הנזק כלי דם במוח במודל של עכברים של מחלת אלצהיימר.

אֹרכִּי<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של Cerebrovasculature: רלוונטיות למחלות של מערכת העצבים המרכזית

Transcranial הדמיה אופטית מאפשרת הדמיה בשדה רחב של הובלה נוזל מוחי שדרתי בקליפת עכברים חיים דרך הגולגולת שלם.

ב Vivo הדמיה של התחבורה נוזל שדרתי דרך הגולגולת העכבר ללא שינוי באמצעות זריחה מאקרוסקופיה

במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול המשלב הזרקת וירוסים הקשורים באדנו עם השתלת חלון גולגולתי לצורך הדמיה סימולטנית של דינמיקה מיקרוגליאלית ופעילות עצבית בעכברים ערים.

הדמיה סימולטנית של דינמיקה מיקרוגליאלית ופעילות עצבית בעכברים ערים

מחקר זה מדגים העברה של פגיעה מוחית טראומטית חוזרת ונשנית לעכברים והשתלה סימולטנית של חלון גולגולתי לצורך הדמיה תוך-חיונית עוקבת של EGFP המתבטא בנוירונים באמצעות מיקרוסקופ של שני פוטונים.

הדמיה תוך חיונית של ביטוי חלבון פלואורסצנטי בעכברים עם פגיעה מוחית טראומטית בגולגולת סגורה וחלון גולגולת באמצעות מיקרוסקופ דו-פוטוני

פרוטוקול זה מכיל תיאור מקיף של גישה שלב אחר שלב למודל עכבר חלון גולגולתי כרוני ותסחיף מיקרווסקולרי מותאם להדמיה מיקרוסקופית דו-פוטונית בתוך ה-vivo באמצעות מיקרוספירות פוליסטירן פלואורסצנטיות.

מודל עכבר של תסחיף מיקרווסקולרי למיקרוסקופיה דו-פוטונית בחיים באמצעות מיקרוספירות פוליסטירן פלואורסצנטיות

למדו מיקרוסקופיה אינטרוויטלית של מיקרו-מחזור הדם במוח עכבר באמצעות חלון גולגולתי כרוני. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר שינויים המודינמיים ותגובות דלקתיות בזמן אמת לאורך זמן.

מיקרוסקופית Intravital של microcirculation המוח עכבר באמצעות חלון גולגולתי סגור

גלה סרטונים נוספים