מיקרוסקופית Intravital של microcirculation המוח עכבר באמצעות חלון גולגולתי סגור

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לחקור מיקרוסירקולציה במוח של עכבר באמצעות מיקרוסקופיה אינטרה-ויטלית (intravital microscopy), המאפשרת מעקב אחר שינויים דינמיים במדדים המודינמיים ודלקתיים במיקרוסירקולציה של ה-pile לאורך פרקי זמן ממושכים. טכניקה זו פותחה ב-La Jolla Bioengineering Institute, שם היא שימשה למגוון סוגי מחקרים. לדוגמה, מעקב אחר שינויים המודינמיים במהלך זיהום ב-plasmodium burgi onca, ובזמן ביטוי של מלריה מוחית.

דבר זה מושג תחילה על ידי השתלת חלון גולגולתי כרוני שבועיים לפני מחקרי המיקרוסקופיה האינטרה-ויטלית (intravital). השלב השני של הפרוצדורה הוא תיעוד המורפולוגיה הכללית של החלון הגולגולתי באמצעות תמונה דיגיטלית ברזולוציה גבוהה בהגדלה נמוכה. השלב השלישי של הפרוצדורה הוא רכישת תמונות מיקרוסקופיה אינטרה-ויטלית באמצעות תאורה קונבנציונלית ופלואורסצנטית, ובחירת אתרי מחקר ספציפיים למדידות מקוונות של קוטר כלי דם ומהירות RBC.

השלב האחרון של הפרוצדורה הוא ביצוע אנליזה אינטרה-ויטלית (intravital) של היצמדות לוקוציטים וטסיות דם בכלי הדם ב-pile באמצעות נוגדנים ספציפיים המסומנים פלואורסצנטית. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות in vivo שינויים במיקרו-סירקולציה במוח המשקפים מצבים פיזיולוגיים, פתופיזיולוגיים או מחלתיים באמצעות מיקרוסקופיה אינטרה-ויטלית של המוח, כדי לבסס שינויים המודינמיים הקשורים למצבים אלה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאנו צופים במוח בסביבתו הפיזיולוגית מבלי לחשוף אותו לסוכנים חיצוניים או למצע מלאכותי; למיקרוסקופיה אינטרה-ויטלית יש רזולוציות מרחביות וזמניות גבוהות יותר בהשוואה ל-MRI ואנגיוגרפיה, והיא מאפשרת לנו לבחון את המוח מרמה מיקרוסקופית.

שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בפיזיולוגיה ובפתופיזיולוגיה של המיקרוסירקולציה במוח, כגון שינויים המודינמיים ודלקתיים במהלך מחלה חריפה וכרונית. שבועיים עד שלושה שבועות לפני ביצוע המיקרוסקופיה בתוך החי (intravital microscopy), מבוצעת קרניאוטומי במוח של עכברים בני שמונה עד 10 שבועות, כפי שהודגם בעבר, למעט העובדה שאינו מושתל מוט טיטניום בראשו של בעל החיים. החלון הגולגולתי הכרוני הוא תכשיר יציב, המאפשר בחינה של המיקרוסירקולציה במוח גם חודשים לאחר השתלתו ביום הניסוי.

ראשית, בדוק את טמפרטורת הגוף של בעל החיים לפני הצבתו במסגרת סטריאוטקסיקה, והזרק Erythrocytes המסומנים פלואורסצנטית שהוכנו מראש דרך וריד הזנב של העכבר. פעולה זו תאפשר מעקב אחר ה-Erythrocytes, כפי שיוצג בהמשך. לאחר מכן, הרדם קלות את העכבר באמצעות isof fluorine.

4% להשראה, 1% עד 2% לתחזוקה. לאחר מכן, הנח את החיה במצב שכיבה על הבטן (prone position) בתוך מסגרת סטריאוטקסית על פד חימום. קבע את הראש בזהירות באמצעות מוטות האוזניים וכוון את הגובה באמצעות המנופים הימני והשמאלי.

נקה בעדינות את לכיסוי הזכוכית (cover slip) על החלון הגולגולתי באמצעות מקלון צמר גפן טבול בשמן מינרלי. לאחר מכן, באמצעות מיקרוסקופ סטריאו המחובר למצלמה דיגיטלית, צלם מספר תצלומי פנורמה של כלי הדם מתחת לחלון. לאחר העברת תצלומי הפנורמה למחשב, בחר את התצלום הטוב ביותר להדפסה, זיהוי ותאריך.

תמונה זו תשמש כמפה למדידות של קוטר כלי דם ומהירויות של תאי דם אדומים, אשר יודגמו בשלב הבא כדי להתחיל במיקרוסקופיה intravital. העבירו את העכבר לבמה מותאמת של מיקרוסקופ intravital. הניחו טיפת מים על החלון הגולגולתי, תוך ניצול השקע שנוצר על ידי האקריליק הדנטלי.

נעשה שימוש בעדשה אובייקטיבית עם הגדלה של 20x בטבילה במים ועם מפתח מספרי (numerical aperture) של 0.5. תמונות מוקלטות באמצעות שתי מצלמות: מצלמה דיגיטלית לתאורה נמוכה ומהירות גבוהה המחוברת למחשב ולמסך, ומצלמה אנלוגית לתאורה נמוכה המחוברת למקלט וידאו (VCR), למסמן זמן ולמסך צבעוני. לפני בחירת כלי הדם למדידה, יש לבחון את כלי הדם כדי להעריך את איכות ההכנה; אם הדם זורם בכל כלי הדם, ניתן לבחור את כלי הדם למדידה. הבחירה צריכה לכלול ורידים ועורקים בקטרים שונים ולכסות מיקומים שונים בתוך השטח החשוף דרך החלון.

בניסוי שלנו, אנו בוחרים 12 כלי דם למדידה בעודכם בוחנים שדות שונים בתוך החלון הגולגולתי. כדי לבחור את כלי הדם, סמנו את המיקום המדויק של כל נקודה למדידה בתמונה של כלי הדם ב-PY שצולמה קודם לכן; עבור כל נקודה, קוטר כלי הדם נמדד באמצעות התקן לגזירת תמונות (image shear device). לאחר בחירת הנקודה, תמונת כלי הדם מיושרת במצב אנכי והתמונה נגזרת עד לצד המנוגד.

הקצוות מיושרים והקריאה מתועדת. לצורך מעקב אחר תאי דם אדומים (erythrocytes), כל נקודה מוקלטת על ידי המצלמה הדיגיטלית למשך 30 שניות לפחות, ותמונות הווידאו מוקלטות בקצב של 150 פריימים לשנייה. קצב זה נקבע כדי להשיג תמונה אחת עד שש של תא בפריים וידאו אחד, לצורך קביעת מהירויות של עד שישה מילימטרים לשנייה.

בסיום איסוף הנתונים, הוציאו את העכבר מהמסגרת הסטריאוטקסית והחזירו אותו לכלובו כדי להתאושש מההרדמה תוך שימוש בתוכנה המתאימה. תמונות הווידאו שנרכשו עוברות דיגיטציה ומתקבלים נתוני XY.Coordinate עבור כל תמונת תא. מיקומי התאים נקבעים באופן ידני ולא באמצעות ניתוח תמונה.

בהינתן שעיינו של צופה מיומן מספקת הערכה טובה של מיקום מרכז התא, שבאופן כללי תואם למיקום הפלואורסצנציה המקסימלית שנצפתה. עבור רוב אוריינטציות התאים, קביעת המיקום והמהירות מבוצעת עבור 15 תאים בכל כלי דם. מחושב ממוצע כדי לקבל את מהירות ה-RBC הממוצעת לאחר שנתוני קוטר כלי הדם ומדידות מהירות ה-RBC זמינים.

ניתן לחשב את זרימת הדם בכל כלי דם באמצעות הנוסחה Q שווה ל-(D חלקי 2) בריבוע כפול PI כפול V, כאשר Q מייצג את זרימת הדם, V מייצג את מהירות ה-RBC, ו-D מייצג את קוטר כלי הדם, לצורך הערכת הפרפוזיה וניתוח היצמדות לוקוציטים בכלי דם קפילריים. מיקרוסקופיה אינטרה-ויטלית (Intravital microscopy) מבוצעת בבעל חיים שהוזרקה לו תערובת של אלבומין המסומן ב-FSE ונוגדנים נגד הסמן הפאן-לוקוציטרי CD 45 המסומנים ב-Texas Red. האלבומין המסומן פלורסצנטית מאפשר ויזואליזציה משופרת של הרשת הווסקולרית, כולל כלי דם חודרים, והוא שימושי במיוחד במצבי מחלה כגון מלריה מוחית כדי לבדוק קיומם של כלי דם שאינם מקבלים פרפוזיה או מקבלים פרפוזיה נמוכה.

הנוגדנים למסומנים פלואורסצנטית נגד CD 45 מקלים על זיהוי וכימות של גלגול (rolling) והיצמדות של לוקוציטים לכלי דם. כימות של היצמדות לוקוציטים מבוצע על ידי ספירת מספר הלוקוציטים לאורך כלי דם של 100 micron. גלגול מכומת על ידי ספירת מספר הלוקוציטים הנעים במהירות נמוכה משמעותית ממהירות הדם באותו אורך של 100 micron במהלך 30 שניות. מוצג.

להלן דוגמה למדידות מהירות של תאי דם אדומים במיקרווסקולריקה באמצעות מעקב אחר תאים מתוך פלואורסצנציה במהירות גבוהה. הקלטות הווידאו בתמונות A עד F הן רצפי תמונות של המיקרוסירקולציה. כל תמונה מייצגת את מיקומו של תא דם אדום בודד בזרימה, אשר נלכד פריים אחר פריים על ידי המצלמה המהירה.

גרף זה מניסוי מייצג מראה את השינויים בזרימת הדם בערך (pile blood flow) לאורך זמן. בעכברים שהודבקו ב-plasmodium, burgi, onca ובעכברי ביקורת שאינם מזוהמים, בעוד שבעכברי ביקורת, זרימת הדם בערך היא יציבה יחסית לאורך זמן. עכברים שהודבקו ב-PBA מראים ירידה ניכרת בזרימת הדם בזמן התפתחותה של מלריה מוחית.

ביום השישי, צביעה עם נוגדנים פלואורסצנטיים מסוג Texas red נגד CD 45 חושפת מספר רב של לוקוציטים הנצמדים לכלי דם של עכבר שהודבק ב-plasmodium burgi onca. לנוהל זה מגוון רחב של יישומים מעבר למטרה המוצגת כאן היום. ניתן להתאים למודל זה כל טכניקה אופטית שניתן להשתמש בה in vivo, ובמודל זה ניתן לחקור פרמטרים כגון רקמה, רמת חמצן ברקמה, pH, מיני חמצן רעילים (reactive oxygen species) ואינטראקציה אנדותלייאלית עם לוקוציטים.