שימוש ברזולוציה גבוהה טומוגרפיה ממוחשבת כדי להמחיש את המבנה התל ממדים ופונקציה של הצמח vasculature

המטרה הכוללת של הליך זה היא להשתמש בטכנולוגיית מיקרו-טומוגרפיה רנטגן מבוססת סינכרוטרון כדי לחקור את המבנה והתפקוד של הובלת כלי דם בצמחים. זה מושג על ידי הכנת דגימות להתקנה במחזיק צ'אק או במחזיק הצמח החי, הבטחה שהחלק שיש לסרוק יהיה אנכי ככל האפשר וביצוע מדידות פיזיולוגיות מקדימות נחוצות. השלב השני הוא למקם את הדגימות המוכנות או הצמחים החיים לתוך צריף A LS Beamline 8.3 0.2, ולאבטח את הצריף לסריקה. הבא.

לאחר מיקום נכון של הדגימה, הסריקה מתחילה. השלב האחרון הוא להשתמש במחשבי תחנת העבודה כדי לנרמל, לשחזר ולהעריך את איכות הסריקה לפני העברת הנתונים ל-VISO לתהליך ההדמיה התלת מימדית. בסופו של דבר, מיקרו-טומוגרפיה של קרני רנטגן משמשת לחשיפת פרטים עדינים של הקשרים ההדדיים והמצב התפקודי של כלי הדם המוליכים מים בצמחים.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו חתך סדרתי ומיקרוסקופ אור, הוא שניתן לחקור רקמת צמח בכל כיוון ברזולוציה חסרת תקדים. שיטה זו יכולה לסייע לנו להבין שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של הצמח, החל מהיבטים בסיסיים של הובלת מים בצמחים ועד לבצורת, ועמידות להקפאה ועד לאופן שבו פתוגנים נעים באופן מערכתי בצמחים מארחים. פרוטוקול זה כמתואר, מיועד לעבודה במקור האור המתקדם.

8.3 0.2. ייתכן שיידרשו התאמות קו אלומה לעבודה במתקני סינכרוטרון אחרים. הקפד לעקוב אחר הכשרות הבטיחות והקרינה הנדרשות לשימוש במתקנים אלה כדי להתחיל בהכנת דגימות לצמחים חיים.

ראשית גדלו צמחים בעציצים בקוטר של כ-10 סנטימטרים, וודאו שהגבעול הראשי או חלק אחר של הצמח המיועד לסריקה יהיה מרוכז ככל האפשר ומכוון אנכית בעציץ. הממדים הפיזיים של מכשיר HRCT Hutch מגביל צמחים חיים לגובה של כמטר אחד. כתוצאה מכך, הדמיה של צמחים חיים מתבצעת בצורה הטובה ביותר על שתילים או שתילים.

גדל בעציצים קטנים השתמש במחזיק עציצים מאלומיניום קשיח בהתאמה אישית כדי להרכיב את העציצים החיים. יש לכוונן את גובה הצלחת העליונה כך שיתאים למגוון גבהי עציצים. כאן, החלק העליון של הצלחת נועד ליישר קו עם החלק העליון של פני האדמה והצמח בולט ממרכז הצלחת הדו-חלקית.

לאחר ההרכבה במחזיק, מדוד את פוטנציאל המים של הגבעול באמצעות תא לחץ בסגנון נחתת SHO או פרמטר עלה קליפס כדי לקבוע את המצב הפיזיולוגי של הצמח לפני הסריקה. סובב חתיכה קטנה של חוט נחושת סביב הגבעול כדי לשמש כנאמן כדי להבטיח מיקום סריקה עקבי על צמחים שייסרקו שוב ושוב. כעת, הנח גליל אקרילי דק עם קירות מעל הצמח על גבי מחזיק מפעל האלומיניום ואבטח אותו במקומו באמצעות ברגים כדי לייצב את הדגימה.

יש להשתמש במגבות נייר ניילון נוספות וסרט כדי למזער עוד יותר את הרטט והתנועה של חלקי הצמח, מה שעלול לגרום לעיוותי תמונה. חבר את מחזיק הסיר המותאם אישית לנושא האוויר tagה ונעל אותו במקומו הממוקם בין מקור הרנטגן לחיישן ההדמיה וציוד המצלמה. הקפד למקם את הגבעול בצורה אנכית ככל האפשר ולמרכז את הדגימה על בסיס הצ'אק המגנטי כדי להבטיח שהוא יישאר בשדה הראייה במהלך הסיבוב, ניתן לסרוק חומר צמחי טרי, בדרך כלל גבעולים או חיות מחמד לאחר הסרה מיידית מצמח חי.

אם כוונת הניסוי היא לדמיין את כל רשת הקסילם, יש לפנות תחילה את המים בתוך הכלים ולהחליפם באוויר. לשם כך, הרכיב את הדגימה בתא לחץ בסגנון לשון הרע ודחף אוויר דחוס או חנקן דרך הדגימה בלחץ נמוך למשך כחמש דקות. המינים יהיו שונים בזמן הנדרש לפינוי רשת כלי השיט.

אם הכוונה היא להעריך את מידת היווצרות התסחיף ברקמת הצמח הטרייה, כרתו דגימות מהצמח באמצעות סכין גילוח טרי שעושה את החתכים מתחת למים. לאחר מכן, עטפו את הדגימה בשכבת פרפורם כדי למנוע ייבוש במהלך הסריקה, הרכיבו את הדגימה בצ'אק מקדחה קבוע ללוחית מתכת המוברגת במרכז הבמה הנושאת את האוויר, וכוונו את הדגימה אנכית כפי שתואר קודם לכן על מנת להבטיח שהדגימה תישאר בשדה הראייה. להכנת דגימות מרקמת עץ מיובשת התחל בחיתוך דגימות לאורך של כשישה סנטימטרים.

בחר דגימות ישרות ככל האפשר באזור הסריקה הממוקד ובקוטר של כסנטימטר אחד. השלב הבא הוא לייבש לאט את כל הדגימה כדי להבטיח הדמיה אופטימלית של דגימת רקמות וניגודיות תמונה. הכניסו את דגימת הרקמה העצית לתנור ייבוש בטמפרטורה נמוכה כדי לייבש את הדגימה באיטיות מבלי לגרום לסדקים או פיצול של הרקמה.

במצבים מסוימים, ייתכן שיהיה רצוי להצמיד סמן נאמנות לדגימה. זה מבטיח שניתן לכוון את החיתוך וההדמיה הבאים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק לנקודות ספציפיות בתמונת HRCT. לשם כך הדביקו חרוז או חוט מתכת או זכוכית לחלק החיצוני של הגבעול באמצעות בושם.

לבסוף, התקן את הדגימה בבדיקת המקדחה ובמרכז כמתואר לעיל לפני הסריקה. קבע את ההגדלה שתעבוד בצורה הטובה ביותר עבור היישום שלך. ל- A LS Beamline 8.3 0.2 המשמש כאן יש את היכולת לסרוק עם עדשות עם הגדלות של שתיים x חמש x ו- 10 x.

הגדר את אנרגיית הרנטגן ל-15 קילו וולט אלקטרונים. זמני החשיפה תלויים בדרך כלל בעובי ובצפיפות הדגימה ונעים בין 100 ל-1000 אלפיות השנייה. בחר מרווח זוויתי המתאים ליישום שלך.

הדגימות מסתובבות ב-180 מעלות במהלך סריקה, ולמספר התמונות שצולמו במהלך הסיבוב יכולה להיות השפעה משמעותית על גודל מערך הנתונים, אורך מרווח הסריקה ואיכות התמונה הסופית. סריקות טיפוסיות מבוצעות במרווחים של 0.25 מעלות, ומניבות 513 תמונות לסריקה. ניתן להשיג מרווחי סריקה קצרים יותר באמצעות הגדרת הטומוגרפיה הרציפה שבמהלכה הדגימה מסתובבת ברציפות בזמן שהתמונות נלכדות עבור כל סריקה, יש לאסוף גם תמונות Brightfield ו-Darkfield.

תמונות Brightfield הן תמונות ללא הדגימה בקורה. אלה נאספים לעתים קרובות לפני ואחרי סריקת הדגימה על ידי תרגום אופקי של הדגימה. שדות כהים נאספים על ידי סגירת תריס הרנטגן.

זה מודד את כמות האות שהמצלמה מציגה ללא צילומי רנטגן. לאחר השלמת הסריקה, העבר את תמונות ה-TIFF הדו-ממדיות הגולמיות ממחשב הרכישה לשרת קבצים ולאחר מכן ייצא למחשב שישמש לעיבוד נתונים. לאחר מכן, יש להמיר את התמונות לסולם שידור באחוזים.

ל- Beamline 8.3 0.2 יש תוסף נורמליזציה מותאם אישית שניתן להוריד ולהשתמש בו עם חבילות התוכנה הזמינות בחינם. תמונה J או פיג'י טוענים את התמונות המנורמלות בחבילת התוכנה של התמנון, ולאחר מכן משחזרים מערך נתונים תלת-ממדי מקובצי התמונה הגולמיים הדו-ממדיים TIFF באמצעות שלבי העיבוד המיועדים. לאחר מכן, ניתן להמחיש את ערימת התמונות באחת ממגוון חבילות תוכנה.

כאן נעשה שימוש בחבילת התוכנה aviso, טען מערכי נתונים לזיכרון המערכת והצג את המדגם בכיווני פרוסה רוחביים, אורכיים או רדיאליים וירטואליים בגלל התכונות התלת-ממדיות של מערך הנתונים, ניתן לסובב פרוסות וירטואליות דרך הדגימה בכל מישור כדי ליישר קו עם אזורי העניין. לאחר השלמת הפילוח, ניתן לכמת את מבני מפעל היעד או שינויים תפקודיים בנפח, אורך, רוחב, נוכחות או היעדר מים, אוויר וכו'. סריקות HRCT של סינכרוטרון יושמו בהצלחה על מגוון רחב של רקמות ומינים של צמחים באמצעות Beamline 8.3 0.2, וסיפקו תובנות חדשות לגבי המבנה והתפקוד של קסילם צמחי ברזולוציה חסרת תקדים בתלת מימד.

יכולות ההדמיה והחקירה המסופקות על ידי השחזורים התלת-ממדיים כפי שניתן לראות כאן מאפשרות קביעה מדויקת של מיקום וכיוון של מבנים עם רשתות Xylem הן בדגימות בלו והן בצמחים חיים. כאן אנו רואים שחזור תלת מימדי של גזע סקויה הנתון ללחץ בצורת ומציג גם אוויר וגם קנה נשימה מלא במים לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך דקות אם היא נעשית כראוי בעקבות הליך זה. שיטות אחרות כמו מיקרוסקופ אלקטרונים סורק יכולות לשמש כדי לאמת את המבנים שאנו רואים בתוך הצמחים ולהגיע לספי גודל, שמוזנים לאחר מכן לתוכניות העיבוד שבהן אנו משתמשים לניתוח הנתונים.