Microdissection לכידת ליזר אוכלוסיות מועשרות של הנוירונים או נוירונים יחידים לניתוח ביטוי גנים לאחר פגיעה מוחית טראומטית

המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים כיצד להשיג אוכלוסיות מועשרות של נוירונים בהיפוקמפוס ונוירונים בודדים מקטעי רקמה קפואים על ידי לכידת לייזר מיקרו-דיסקציה לניתוח ביטוי גנים לאחר מכן. זה מושג על ידי הרדמה ראשונה, חולדה בתא הרדמה. לאחר מכן החולדה מוחדרת, מאווררת מכנית ומונחת במחזיק ראש סטריאוטקסי כדי להכין את החולדה לפגיעה מוחית בכלי הקשה נוזליים, מבוצעת קרניוטומיה.

השלב השני הוא ניהול הפגיעה המוחית בכלי הקשה נוזליים. לאחר מכן חלקים עטרתיים של המוח נחתכים על קריוסטט ומוכתמים בעזרת פלורו, סמן לנוירונים מנוונים, או סגול אמיתי, כתם טיל. השלב האחרון הוא לבצע לכידת לייזר מיקרו דיסקציה ולאסוף נוירונים בודדים או בריכות נוירונים.

בסופו של דבר, ה-RNA הכולל מבודד מהתאים שנלכדו, מנותח לאיכות ומכומת באמצעות ביו-אנלייזר Agilent ומשמש ביישומים במורד הזרם כגון PCR כמותי בזמן אמת וניתוח מיקרו-מערך ממוקד מסלול או מיקרו-מערך גנומי. היתרון העיקרי של טכניקה זו של שיטות קיימות כמו מיקרו דיסקציה ידנית, הוא שאנו יכולים להשיג אוכלוסיות מועשרות של נוירונים או סוגי תאי מוח אחרים כגון גליה או תאים אימונומודולטוריים, או נוירונים בודדים מקטעי רקמות. זה מאפשר לנו לבצע ניתוח ביטוי גנים בסוגי תאים מזוהים שונים במוח וברקמות הטרוגניות אחרות המורכבות ממספר סוגי תאים, הדגמה שהליך זה יתפספס.

דבי בון, עמיתת מחקר בכירה במעבדה שלנו. ראשית שולפים את רקמת המוח שהתקבלה מחולדות עם כלי הקשה נוזליים, פגיעה מוחית טראומטית או פגיעה מזויפת מהמקפיא של מינוס 80 מעלות צלזיוס, ומעבירים למינוס 22 מעלות צלזיוס. קריוסטט למשך 10 דקות כדי להביא את המוח לטמפרטורת החיתוך בזמן שהמוח מפשיר.

נגב את הקריוסטט עם RNA zap המכיל אתנול ונקה את המברשות באתנול. לאחר 10 הדקות שחלפו, הוציאו את המוח מהצינור והניחו אותו עם הצד הגחוני כלפי מעלה על פיסת גזה בשלב הקריוסטט, השתמשו בסכין גילוח טרי וחתכו את המוח כדי להסיר את החלק האחורי של המוח. רק רוסטרל למוח הקטן ולחלק הקדמי בכיאזמה האופטית.

מלאו תבנית קריו במדיום הרכבה OCT והניחו את המוח לתוך התבנית כשהצד הקדמי כלפי מטה. הניחו לרקמת המוח לקפוא במדיום ההרכבה עד שהיא הופכת ללבנה. זה אמור לקחת בערך 10 דקות.

כעת הקפיאו את דיסק הדגימה למוח עם OCT. ואז הסר את התבנית. הכנס את הדיסק כשהמוח מחובר לראש הדגימה והדק את הברגים.

הכנס להב חד פעמי בעל פרופיל נמוך למחזיק הסכין והדק את הידית כלפי מטה. התחילו לחתוך את המוח בעובי של 20 מיקרון כדי להסיר את השכבה החיצונית של OCT. לאחר שמגיעים לאזור ההיפוקמפוס, הגדר את חוגת המיקרון ל-10.

אסוף חלקים סדרתיים עטרתיים על ידי הנחת מגלשת זכוכית או זכוכית פלוס. יש להחליק על חלק הטישו. הנח את השקופיות במתלה צביעה ללא RNA במינוס 20 מעלות צלזיוס עד להשלמת החיתוך.

לפני שתמשיך להכתים את החלקים, נגב את כל מיכלי הצביעה והצילינדרים המדורגים ב- ese ושטוף במי מילי Q. ודא שכל התמיסות הוכנו עם מים נטולי RNA וכי כתם הסגול והירקן הפלואורו עברו דרך מסנן של 0.2 מיקרון בעבר. השתמש בחלקי המוח של ת'ור בטמפרטורת החדר למשך 30 שניות וקבע אתנול של 75% למשך דקה אחת.

לאחר מכן המשך לכתם הנגדי המתאים ל-LCM של רצועות נוירונים או נוירונים בודדים עבור LCM של רצועות נוירונים לאחר קיבוע, שטוף שקופיות במים נטולי RNA למשך דקה אחת עם סגול פסגה של 1% למשך דקה אחת. יש לשטוף במים נטולי RNA שלוש פעמים למשך דקה אחת כל אחת, לייבש עם 95% אתנול פעמיים למשך 30 שניות כל אחת. לאחר מכן 100% אתנול פעמיים למשך 30 שניות וקסילן פעמיים למשך שלוש דקות כל אחד.

לאחר הצביעה באוויר יבש את כל החלקים במכסה אדים למשך 15 דקות ולאחר מכן המשך ל-LCM.כאן. LCM מבוצע. באמצעות מיקרוסקופ תא P שני E עם לייזר דיודה אינפרא אדום התאם תחילה את הג'ויסטיק המרכזי למצב האנכי.

לאחר מכן סובב ונעל את מטרת המט"ח למקומה. הניחו שקופית עם קטעי היפוקמפוס מוכתמים במרכז שלב המיקרוסקופ והתאימו ידנית עד שאזור ההיפוקמפוס נראה לעין. השתמש במסלול ומצא התאמות מיקוד.

כדי להביא את הקטע למיקוד, הפעל את צ'אק הוואקום על ידי לחיצה על כפתור הוואקום בבקר. לאחר מכן סובב ונעל את המטרה פי 10 למקומה. התמקד שוב עם קורס והתאמות עדינות.

טען את המכסים של מכסי ה-LCM של המאקרו שלך לתוך המכסים, מודול הקסטה שלך, ומקם מכסה במיקום קו העומס. סובב את זרוע הנחת הכובע ומקם סביב המכסה. לאחר מכן הרם את זרוע מיקום הכובע כדי להסיר את המכסים שלך ממודול הקלטת.

סובב את זרוע מיקום הכובע מעל המגלשה ולאחר מכן הורד אותה כלפי מטה מעל המגלשה כדי להניח את הכובע על המגלשה. כוונן את המיקוד העדין והזז את הג'ויסטיק כדי לבדוק אם התאים נמצאים בתוך העיגול השחור שעל המכסה. כל התאים שיש ללכוד צריכים להיות בתוך העיגול השחור הזה.

כעת הגדר את פרמטרי הלייזר. לחץ תחילה על כפתור הפעלת הלייזר בבקר. נקודת המטרה של הלייזר תיראה בצבע ורוד.

בשדה הראייה על צג המחשב. הגדר את גודל נקודת הלייזר לקטן כדי למקד את הלייזר והתאם את ההספק ומשך הזמן ל-65 עד 75 מילי-וואט למשך אלפית שנייה עד שתיים לפי הצורך ללכידת תאים אופטימלית. כדי לבדוק את הלייזר, השתמש בג'ויסטיק כדי להזיז את נקודת הלייזר לאזור שבו אין תאים להרים.

הפעל את הלייזר באמצעות מתג האגודל. לאחר מכן השתמש בג'ויסטיק כדי להרחיק את נקודת הלייזר מנקודת הפולימר המומסת ובדוק אם יש טבעת כהה גלויה המקיפה אזור ברור שבו נורה הלייזר. כדי ללכוד תאים, השתמש בג'ויסטיק כדי להזיז את נקודת הלייזר מעל אזור התאים כדי ללכוד ולירות את הלייזר.

באמצעות מתג האגודל, הזז את הג'ויסטיק תוך כדי ירי הלייזר כדי ללכוד שטח גדול של תאים. לאחר ירי כל התאים המעניינים, הרם את זרוע מיקום הכובע. התאים שנלכדו ייפרדו מקטע הרקמה וייצמדו למכסה.

הכובע שלך, הרקמה הנותרת והתאים החסרים יהיו גלויים בשדה הראייה. ניתן להציג את התאים על הכובע גם על ידי הנחת הכובע על חלק ריק של השקופית. הרם את זרוע הצבת המכסה וסובב אותה לתחנת פריקת המכסה.

הורד את המכסה לתוך התחנה וסובב את זרוע מיקום הכובע בחזרה למקומה הקודם. החליקו את הכובע לאורך הפלטפורמה ועל המכסה. הרם את הכלי כשהמכסה מחובר מהפלטפורמה.

גע קלות במכסה בחלק הדביק של פתק פוסט-איט כדי לנקות רקמות לא רצויות. הנח את המכסה לתוך צינור נטול RNA של 0.5 מיליליטר מלא ב-100 מיקרוליטר של מאגר ליזה המתקבל מערכת בידוד מיקרו מימית RN. מערבל מיד את הכובע למשך 30 שניות לשקרים.

התאים דוגרים על הדגימות בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות וקופאים במינוס 80 מעלות צלזיוס עד לבידוד RNA. הליך הצביעה של LCM של נוירונים פגועים בודדים לאחר קיבוע דומה להליך עבור רצועות של נוירונים. עם זאת, חלק מזמני הדגירה שונים והחלקים נשמרים עם פלואוריד במשך ארבע דקות לפני שטיפה והתייבשות, עיין בחלק הטקסט של הפרוטוקול לפרטים לאחר הצביעה.

שוב, יבש את כל החלקים באוויר במכסה אדים למשך 15 דקות. לפני שתמשיך ל-LCM כדי ללכוד עומס תאים בודדים, לכידת עומס מכסי HS LCM לתוך הכובע או מודול הקלטת, תוך שימוש באותו הליך כמו עבור מכסה המאקרו LCM. שוב, הגדר את גודל נקודת הלייזר לקטן כדי למקד את הלייזר, אך הפעם התאם את עוצמת הלייזר ומשך הזמן ל-65 עד 75 מילי-וואט למשך 0.45 עד 0.5 אלפיות השנייה ללכידת תאים אופטימלית של תאים בודדים.

סובב את זרוע מיקום הכובע מעל המגלשה והורד את הזרוע כלפי מטה לכיוון המגלשה. כדי למקם את המכסה מעל השקופית, משטח מכסה ה-HS של הלכידה יושב מוגבה מהדגימה. במהלך LCM, השתמש בג'ויסטיק כדי להזיז את הלייזר על תאים חיוביים בודדים של פלואור.

כל התאים שנלכדים חייבים להיות בתוך הטבעת השחורה הקטנה על הכובע לירות את הלייזר באמצעות מתג האגודל. כאשר כל התאים באזור העיגול השחור נורו עם הרמת הלייזר, זרוע מיקום הכובע, התאים שנלכדו ייפרדו מקטע הרקמה וייצמדו לכובע hs לכידה. כעת הניחו שקופית נוספת על שלב המיקרוסקופ ואספו תאים חיוביים לסיוע פלורו עד שמכסה ה-HS מלא.

לאחר מכן הכניסו את המכסה לתוך צינור נטול RNA של 0.5 מיליליטר מלא ב-40 עד 50 מיקרוליטר של ליזה, חיץ ומערבולת וחממות לפני שקפאו שוב במינוס 80 מעלות צלזיוס. אם לא מבצעים מיד בידוד RNA לפי ההוראות בחלק הטקסט של הפרוטוקול. התמונות הבאות מציגות לכידת לייזר מיקרו-דיסקציה של רצועות של אוכלוסיות תאים ספציפיות ממוח החולדה שהוקפאו ב-10 מיקרון של מוח החולדה.

הוכנו על פי פרוטוקול זה והוכתמו בסגול קרסטלי וכתם טיל. התמונה הזו מציגה תאי עצב פרמטאליים מתת-השדות ca1 עד ca 3 של ההיפוקמפוס של החולדה. כאן נלכדו תאי גרגיר בפיתול השן של ההיפוקמפוס.

לבסוף, אנו מראים רצועות של נוירונים שנלכדו מגרעיני הסופרה כיאזמה הדו-צדדיים הממוקמים משני צידי החדר השלישי ומעל הכיאזמה האופטית. ה-SCN מכיל את השעון הביולוגי הראשי השולט במקצבים הצירקדיים בכל הגוף. התמונות הבאות מראות מיקרו-דיסקציה של לכידת לייזר של נוירונים בודדים מההיפוקמפוס של חולדות.

מוצגים כאן היפוקמפוס חיובי פלואוריד מנוון כשלושה נוירונים כאן שורדים סיוע פלורו שלילי ca שלושה נוירונים לפני ואחרי LCM מוצגים תאים שנלכדו מוצגים על כובע LCM. התמונות הבאות הראו ניתוח ביטוי גנים של RNA כולל, שבודד מתאי עצב שנלכדו בלייזר. תמונה זו מציגה נתוני PCR כמותיים בזמן אמת של ביטוי גנים של שעון ביולוגי ב-SCN.

מפת חום זו של ביטוי גנים בתאי עצב גוססים ושורדים בהיפוקמפוס מציגה פרופיל ביטוי של גנים הקשורים לאפופטוזיס באמצעות מערכי PCR ממוקדים. לבסוף, אנו מראים דוגמה למפת חום שנוצרה מניתוח מיקרו-מערך של גנום שלם של אף אוזן גרון של ביטוי גנים ב-ca-1 עד ca שלושה נוירונים מחולדות שקיבלו פגיעה דמה TBI או TBI בתוספת נגיף siRNA הקשור לאדנו-שכיבה שנועד להפיל ביטוי של תחמוצת חנקן עצבית, סינטאז או גלוטתיון פרוקסידאז אחד, שניהם גנים הנגרמים על ידי פגיעה מוחית לאחר התפתחותה. טכניקות אלה סללו את הדרך למדענים בתחומי מחקר רבים, כולל פגיעות מוח וסרטן, המשתמשים במודלים של בעלי חיים של הפרעות אלה כדי לבצע פרופיל גנומי פרוטאומי ומטבולי של אוכלוסיות תאים ספציפיות.

לדוגמה, אנו משתמשים כיום בשיטות אלה כדי ללכוד בלייזר אוכלוסיות תאים ספציפיות מקליפת המוח הקדם-מצחית ומאזורי המוח של גרעין האקומבנס שידועים כמעורבים בהתמכרות.