Microdissection לכידת לייזר - הפגנה של הבידוד של פרט דופמין נוירונים ופינת הגחון tegmental השלם

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד נוירונים של דופמין מקטעי רקמה בשקופיות. זה מושג על ידי חתך ראשון של רקמת מזנספלון גחונית קפואה על שקופיות מסוגננות או שקופיות קרום עט. לאחר מכן, נוירוני דופמין מסומנים באימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית מהירה.

לאחר מכן הרקמה מיובשת ונטענת במיקרוסקופ לכידת הלייזר. לאחר מכן נוירוני הדופמין המסומנים מחוברים לכובע ה-LCM באמצעות לייזר אינפרא אדום וה-RNA או המולקולה המעניינת מבודדים. התוצאות מדגימות כי ניתן להשיג RNA בכמות ובאיכות מספיקות למדידות PCR כמותיות באמצעות מיקרוסקופ לכידת לייזר.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון דיסקציה גסה או מיקרו פאנצ'ים, הוא שאוכלוסיות תאים בודדות יכולות להיות מבודדות או אזורי מוח נפרדים מאוד. כדי להתכונן לטבילה בבידוד RNA, או שקופיות הכנה לסלין או פוליאתילן מתילאט או זכוכית קרום עט מחליקות לתמיסת טיהור והשתמשו במים נטולי RNA כדי לשטוף אותם שלוש פעמים באמצעות סדרה מדורגת של אתנול ללא RNA, לייבש את השקופיות ולייבש בוואקום למשך 30 דקות עם קטעי רקמה חתוכים קריוסטט בעובי 10 מיקרון ולהרכיב על RNA מוכנים. שקופיות חופשיות שומרות על הדגימות קפואות במהלך החיתוך כדי לשמור על איכות ה-RNA.

הבא לבצע אימונוהיסטוכימיה. השתמש בעט הידרופובי כדי לשרטט רקמות ולאפשר להן להתייבש ואז בתמיסת מתנול אצטון אחד לאחד. תקן את הרקמה בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לאחר הוצאת הטישו מהמקפיא, כסו את החלקים ב-100 עד 200 מיקרוליטר נוגדן טירוזין הידרוקסילאז NPBS ו-1% טריטון למשך 10 דקות.

לאחר מכן השתמש ב-PBS עם 1% טריטון כדי לשטוף את השקופיות לפני כיסוי החלקים ב-100 עד 200 מיקרוליטר של IgG נגד ארנב עזים, המסומן ב-Alexa Fluor 4 88 incubate למשך חמש דקות ולאחר מכן השתמש ב-PBS כדי לשטוף את השקופיות פעמיים. לאחר מכן, ייבשו את הדגימות סדרות משולבות של אתנול ללא RNA למשך 30 שניות כל אחת כפי שהודגם קודם לכן בסרטון זה. דגירה בקסילן למשך דקה ושנייה, שטיפה במשך חמש דקות.

הסר את השקופיות מיד לפני השימוש ב-LCM ואפשר להן להתייבש באוויר. לאחר טעינת מכסי ה-LCM והשקופיות והגדרת מערכת ה-LCM בהתאם לפרוטוקול הטקסט, כוונן וכוון את לכידת לייזר ה-IR לחוזק. הנח את המכסה באזור של השקופית הרחק מהרקמה בסרגל הכלים של לייזר הלכידה.

בחר הפעל, כוונן את דופק הכוח ומספר הפגיעות של הלייזר. הפעל את לייזר ה-IR כאשר הכובע נמצא מעל חלק מהשקף ללא רקמה, ובדוק אם הלייזר ממיס מספיק את קרום מכסה ה-LCM. לאחר התאמת עוצמת לייזר ה-IR, לחץ לחיצה ימנית ובחר לייזר לכידה כאן כדי לכוון את הלייזר לביצוע LCM על נוירונים בודדים של דופמין מתוך שקופיות הכנה לקליין.

התחל במעבר לאזור העניין כדי ללכוד את התאים כדי ללכוד תאים בודדים מהצד של הכנה לקליין. בסרגל הכלים של מיקרו-דיסקציה, בחר בכרטיסייה LCM, ולאחר מכן בסמל הנקודה הבודדת. לאחר מכן בסרגל הכלים של המיקרוסקופ, השתמש בלשונית התריס כדי לעבור בין פלואורסצנטיות לשדה בהיר עם לשוניות מסנני פלואורסצנטיות כדי לבחור את המסננים המתאימים והשתמש בכרטיסיות המטרות כדי לשנות את ההגדלה.

לאחר שהתאים המעניינים גלויים בחלון הווידאו החי, התאם את גודל הנקודה המשמש לסימון תאים מעניינים לגודל המשוער של התאים. סמן את התאים המעניינים על ידי בחירה בסמל הנקודה הבודדת ולאחר מכן לחיצה על התאים. לאחר סימון התאים בסרגל הכלים של המיקרו-דיסקציה, בחר בכרטיסייה לחתוך וללכוד ולייזר ה-IR יורה אוטומטית על כל התאים המסומנים שנבחרו.

הרחק את המכסה מהקטע אל אזור פתוח של השקופית כדי לבדוק אם התאים נלכדים על מכסה ה-LCM. בסיום איסוף הרקמה, הזז את הכובע על ידי לחיצה ימנית על הכובע ובחירה העבר אל ולאחר מכן פרק כמתואר בפרוטוקול הטקסט, השתמש בשקופית המעובדת לאימונוהיסטוכימיה כמדריך לבחירת אזור העניין מהרקמה על קרום העט. בסרגל הכלים של מיקרו דיסקציה, בחר את הכרטיסייה גזירה ולכידה, ולאחר מכן בחר את לשונית קו החיתוך והשתמש בשקופית המסומנת באימונוהיסטוכימיה כמדריך, תאר את אזור העניין תחת המטרה 10x.

בדוק, ירה וכוון את לייזרי ה-IR וה-UV כפי שהודגם קודם לכן. בסרטון זה, בסרגל הכלים של מיקרו-דיסקציה, בחר בכרטיסייה ללכוד ולחתוך את הכרטיסייה. לאחר מכן הזז את מכסה ה-LCM מהרקמה כדי לקבוע אם הרקמה מוסרת מהקטע ומצמידה למכסה.

בסיום איסוף הרקמה להסרת המכסה, לחץ לחיצה ימנית על הכובע ובחר העבר כדי לפרוק את המיקרוגרפים באיורים אלה מדגימים כי LCM מסוגל לבודד נוירונים בודדים של דופמין טירוזין הידרוקסילאז באמצעות לייזר IR או לייזרי IR ו-UV מכיוון שהשימוש הנפוץ ביותר בתאים ברקמות המבודדות באמצעות LCM הוא ניתוח RNA. ההליכים שהוצגו עברו אופטימיזציה לשמירה על שלמות ה-RNA כפי שניתן לראות על ידי ירידה יחסית בגובה של שיא ה-RRNA 28 S בהשוואה לשיא של 18 S, איכות ה-RNA הופחתה בדגימות LCM עם שלמות נמוכה יותר לאחר אימונוהיסטוכימיה, ואחריה קיבוע אצטון בהשוואה ל-RNA של המוח כולו. כדי למדוד את כמות ה-RNA המתקבלת מתאי עצב שנרכשו באמצעות L-C-M-R-N-A מנוירונים של דופמין מאזור הגחון הירוק מחוץ להכנת מי מלח בודדו שקופיות על סמך העקומה הסטנדרטית שנוצרה בסך הכל 17.3, 24.8 ו-50.9 פיקוגרם למיקרוליטר בודדו מ-5, 100 ו-200 נוירונים של דופמין בהתאמה.

E באמצעות QPCR למדידת איכות RNA, טווח ריכוזים של RNA ו-RNA של מוח שלם מנוירוני הדופמין הועתקו וגן הבטא אקטין נמדד ממדידות אלה ריכוזים של שלוש נקודות 55, 6, 0.82 ו-20 נקודות 58 פיקוגרם למיקרוליטר חושבו מ-5, 100 ו-200 נוירונים של דופמין בהתאמה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש במיקרוסקופ לכידת הלייזר כדי לבודד נוירונים בודדים של דופמין או לבודד אזורים של נוירוני דופמין.