זיהוי מבוסס microarray של פרט HERV לוקוסים ביטוי: בקשה לגילוי סמן ביולוגי בסרטן הערמונית
2 בנובמבר 2013
רטרווירוסים אנושיים אנדוגני (HERV), אשר תופסים 8% של הגנום האנושי, לשמור על יכולות קידוד נדירות אבל מאה אלף חזרות ארוכות מסוף (LTRs). Microarray Affymetrix מותאם אישית תוכנן כדי לזהות ביטוי לוקוס HERV הבודד והיה בשימוש ברקמות סרטן ערמונית כהוכחה של מושג למחקרים קליניים בעתיד.
ניתוח טרנסקריפטומי זה של רקמות סרטן הערמונית האנושיות מזהה מיקומי ביטוי רטרו-וירוס אנדוגניים אנושיים בודדים כדי להעריך מיקרו-מערך מותאם אישית בצפיפות גבוהה ככלי סינון לגילוי סמנים ביולוגיים. לאחר שהמנתח הסיר את איבר הערמונית מהמטופל, הפתולוג מכין רקמות גידוליות ורקמות תקינות סמוכות בנפרד בתמצית המעבדה, מטהר ומכשיר MR. NA מהרקמות הנורמליות והגידוליות מגביר mRNAs באמצעות ערכת ביצועי טרנסקריפטום שלמה ולאחר מכן מבקע ומסמן את המוצרים המוגברים המתקבלים. לאחר מכן עבד ברצף את שני המיקרו-מערכים של H-E-R-V-V על ידי מילוי הכלאה, כביסה וסריקה.
בסופו של דבר באמצעות שיטות מחשוב ביולוגי ניתן לעקוב אחר ערכות בדיקה, המציגות אותות משמעותיים וביטוי דיפרנציאלי, מה שמוביל לזיהוי מיקומים בודדים פעילים מבחינת שעתוק. לפני שנים רבות חקרנו את ההתנהגות של משפחת IRV W בהקשרים שונים, כולל דגימות טרשת נפוצה. אשך שליה.
הרעיון של השיטה שלה עלה לי לראשונה כשהתחלנו להבין שבאים לידי ביטוי תת-קבוצות חופפות או לא חופפות של רכיבי IRV בתוך משפחה. תלוי בהקשר. השימוש בטכנולוגיית ספינות מאפשר חקירה מתואמת של כמה ממשפחותיה וניתוח סימולטני של אזורים שונים עבור כל לוקוס.
לדוגמה, US שלוש ותחום UF עבור LTR, שעשוי לתמוך בתפקיד ישיר בפתולוגיה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הסרטן, כגון לאבחון סרטן הערמונית, כאשר הסמנים הביולוגיים החלבונים הקיימים כמו PSA, חסרים ספציפיות ורגישות. בינתיים, RNA שאינו מקודד כמו PCA 3 נראה מבטיח יותר, המדגים את הליך הטיפול בערמונית ימכור למישל טכנאי מהמחלקה הפתולוגית.
פיליפ פר ידגים את הכנת וניתוח מטרת מיצוי ה-RNA בעוד שטכנאי ממעבדת יחידת ג'ון ידגים את הליך הספינה. הרכיבו את מסלול הרקמה הקפואה אנכית על תלולית קטנה של OCT בקריוסטט. קח קטע יחיד של חמישה מיקרון, צבע אותו ב-Blu udine, ולאחר מכן בצע בדיקה היסטולוגית מהירה כדי לבחון את אופי הרקמה לרקמת הגידול.
העריכו את כמות התאים הטורליים ובחרו רק ליבות עם יותר מ-80% תאים גידוליים. חותכים עוד קטע של חמישה מיקרון ומכתימים בהמאטין, אואין וזעפרן. כעת חותכים 15 חלקים בעובי 30 מיקרון ומעבירים אותם לצינור אורף ללא RNA.
לאחר מכן קח קטע אחרון של חמישה מיקרון לצביעה עם המאטין, אואין וזעפרן כדי לשלוט בכמות תאי הגידול. בסיום ההליך, הטרנס מעביר את הדגימות על קרח יבש למעבדה לביולוגיה מולקולרית. הומוגניזציה של הרקמה בתמיסת Triol על קרח, באמצעות מטחנת כף יד עד להמסה מלאה של הרקמה.
דגרו את הדגימות בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר מכן מוסיפים 300 מיקרוליטר כלורופורם ומערבולת למשך 15 שניות. לאחר שתי דקות בצנטריפוגה בטמפרטורת החדר ב 12, 000 גרם למשך 15 דקות בשתיים עד שמונה מעלות צלזיוס.
עבור ה- RNA, העבירו בזהירות את השלב המימי העליון לצינור חדש. מוסיפים 750 מיקרוליטר איזופרופנול, מערבבים בהיפוך ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. צנטריפוגה את הדגימות כדי לגלול את ה-RNA המשקע, לשטוף את כדור ה-RNA במיליליטר אחד של 80% אתנול.
לאחר מכן צנטריפוגה של הדגימות ב-7, 500 גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. הסר את הסופרנטנט בעזרת קצות P 1000 ו-P 10. הניחו לאתנול שנותר להתייבש באוויר.
לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר מים ללא RNA. מעבירים את הדגימות לגוש חום של 70 מעלות צלזיוס. כדי להמיס את הגלולה יש לבדוק את איכות ה-RNA ואת תקינות ה-RNA באמצעות ביו-אנלייזר ו-NanoDrop בהתאם להוראות היצרן.
במיצוי RNA אידיאלי, מספר שלמות ה-RNA הוא בדרך כלל שבע ומעלה. המשך עם כל הטרנסקריפטום, ערכת הגברת RNA בהתאם להוראות הספק. לאחר מכן טהר את מוצר ה-CD NA היחיד שנוצר.
בדוק את התפוקה והתפלגות הגודל של ה-CDNA החד-גדילי באמצעות ביו-אנלייזר ו-NanoDrop בהתאם להוראות היצרן. התפלגות הגודל של CD NA מוגבר צריכה להיות בדרך כלל באורך של בין 101, 500 בסיסים עם שיא בסביבות 600 בסיסים ובעלת התפלגות כוללת בצורת פעמון. לאחר פיצול ה-CDNA, הוסף 6.6 מיקרוליטר של תערובת פיצול לשני מיקרוגרם של CD NA בסיבוב של 30 מיקרוליטר ודגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
לאחר מכן השביתו את הדנ"א בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות והמשיכו להיות על הקרח. יש ליטר אחד של ה-CDNA המפוצל לאימות התפלגות גודל מבוססת Agilent. הטיפול היחיד של ה-DNA הופך את התפלגות גודל ה-CD NA להומוגניזציה לכ-100 נוקלאוטידים לפני הכלאה.
בדוק את התפלגות גודל ה-CD NA החד-גדילי באמצעות ביו-אנלייזר של פייזר רטוב מראש. שבב הגן HERV עם 200 מיקרוליטר של הכלאה מוקדמת. מערבבים ודוגרים בחום של 50 מעלות צלזיוס, 60 סל"ד למשך 10 דקות.
הוסף 131 מיקרוליטר של תערובת הכלאה ל-69 מיקרוליטר של CD NA מקוטע ומסומן בתערובת בטמפרטורת החדר ובטבע למשך שתי דקות ב-95 מעלות צלזיוס. לאחר מכן דוגרים בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות וצנטריפוגה במהירות מרבית למשך חמש דקות. כעת רוקנו את שבב הגן HERV שהורטב מראש וטענו את תכשיר המטרה של 200 מיקרוליטר.
מרחו כתמים קשים על שני ההיברידיות של SEPTA בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס, 60 סל"ד למשך 18 שעות. רוקן את שבב הגן HERV ומלא את הבדיקה. היה מערך עם 250 מיקרוליטר של מאגר כביסה, מקום 600 מיקרוליטר של תערובת תמיסות SAPE ו-600 מיקרוליטר של תערובת תמיסת נוגדנים במיקומים מספר אחת ומספר שתיים, מקם 800 מיקרוליטר של מערך מחזיק מאגר במיקום.
מספר שלוש, דחף את המחטים כלפי מטה. הקצה את השבב הנכון לכל מודול. בחר את פרוטוקול FS 4 5 0 0 0 4 והפעל כל מודול לפי הוראות התוכנה.
מרחו כתמים קשים על ה-SEPTA כדי למנוע דליפה. לאחר מכן טען את השבב לתוך הטוען האוטומטי או לחילופין ישירות לסורק. התחל לסרוק.
לאחר סריקת קבצי ה-CEL של נקודות השבב נוצרים, בדוק את התמונה ויישר את הרשת לנקודה כדי לזהות את תאי הבדיקה. כמו כן, הכפיפו את השבבים למספר מדידות בקרת איכות. כעת נרמל את השבבים והחל גישת אשכולות היררכית כדי לחקור את מערך הנתונים לאחר נורמליזציה, בוצע ניתוח משמעותי לחיפוש גנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי מהליך המיקרו-מערך ואחריו תיקון שיעור גילוי שגוי בחמש דגימות גידול זוג התאמה ו-RNA ערמונית רגילה.
זה הוביל לזיהוי של 207 ערכות בדיקה של HERV עם ערכי ביטוי דיפרנציאליים. ניתוח נוסף של 35 דגימות זוגות התאמה נוספות מרקמות סרטן אחרות זיהה 44 ערכות בדיקות HERV ספציפיות לערמונית. אלו הם 10 מבני ה-HERV הרלוונטיים ביותר.
לבסוף, ניתן לבצע ניתוח פונקציונלי בממשק ייעודי המורכב מרצפים מוערים של עניין המומחשים על ידי אלמנט H-E-R-V-W אחד שנבחר ב-10 המבנים הפרו-ויראליים המזוהים המובילים המסומנים למעלה עם הבדיקות הספציפיות הייעודיות שלו הקיימות במערך H-E-R-V-V שני ומסומנות עם האזורים הרטרו-ויראלים הפונקציונליים LTR gag POLE N, ועם התמקדות בחמשת תת-הדומיינים הראשוניים של LTRU שלוש ו-U חמישה, והעיצוב הבא של פריימרים PCR לאימות RT PCR. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לשלוט בשלבים הקריטיים הכרוכים בהכנת דגימה ומטרה, שהם תנאים מוקדמים איכותיים להצלחה בשימוש במיקרו-קרניים לכדור הארץ, כמו גם גילוי סמנים ביולוגיים קונבנציונליים. עיצבנו מיקרו-מערך בצפיפות גבוהה בפורמט אמטרי, במטרה לאפיין בצורה אופטימלית ביטוי אינדיבידואלי של לוקוסים על מנת להבין טוב יותר אם הם יכולים להיות פעילים אם האזור היבש שאינו קון שעתוק NA או לווסת את ביטוי הגנים המקודדים.
טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחום המחלות הכרוניות והזיהומיות מכיוון שזיהוי שיטתי של קולות פעילים עשוי לאחד השערות גנטיות, ויראליות וסביבתיות כגורמים מעוררים בפתולוגיות שונות. עבודה עם מספר מוגבל של דגימות בניסוי הוכחת היתכנות טכני יכולה להיות מסובכת לגילוי מוצלח של סמנים ביולוגיים לנקוט באמצעי זהירות, כגון כיבוד זרימת עבודה מאומתת סטטיסטית, כולל חוסן השיטה, ודגימה מייצגת של אוכלוסיית המטופלים הממוקדת.
סקירה כללית
מחקר זה חוקר את הביטוי של רטרו-וירוסים אנדוגניים אנושיים (HERV) ברקמות של סרטן הערמונית באמצעות מיקרו-מערך בעל צפיפות גבוהה מותאם אישית. הממצאים שואפים לשפר את גילוי הביו-מארקרים לאבחון סרטן הערמונית.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- נוירולוגיה
- אונקולוגיה
- גנומיקה
רקע
- רטרו-וירוסים אנדוגניים אנושיים (HERV) מהווים 8% מהגנום האנושי.
- ל-HERVs יש יכולות קידוד מוגבלות אך מספר רב של חזרות סופיות ארוכות (LTRs).
- לביו-מארקרים קיימים לסרטן הערמונית, כמו PSA, חסרים ספציפיות ורגישות.
- רנ"א לא מקודד כמו PCA3 מראה הבטחה לשיפור האבחון.
מטרת המחקר
- לזהות מוקדי ביטוי אינדיבידואליים של HERV ברקמות של סרטן הערמונית.
- להעריך מיקרו-מערך מותאם אישית ככלי סינון פוטנציאלי לגילוי ביו-מארקרים.
- לחקור את התפקיד של HERVs בפתולוגיה של סרטן הערמונית.
שיטות ששימשו
- חילוץ RNA מרקמות גידול ומשורשרות רגילות של הערמונית.
- הגברה של mRNAs באמצעות ערכת תמלילים שלמה.
- הכלאה של cDNA מסומן למיקרו-מערך HERV מותאם אישית.
- שיטות מחשוב ביולוגי לניתוח ביטוי דיפרנציאלי של מוקדי HERV.
תוצאות עיקריות
- זיהוי מוקדי HERV אינדיבידואליים פעילים תעתיקית בתוך רקמות של סרטן הערמונית.
- הוכחת יכולתו של המיקרו-מערך לזהות אותות ביטוי משמעותיים.
- תובנות לגבי דפוסי הביטוי של HERVs ביחס לפתולוגיה של סרטן.
מסקנות
- המיקרו-מערך המותאם אישית מזהה ביעילות את הביטוי של HERV בסרטן הערמונית.
- הממצאים עשויים לתרום לפיתוח ביו-מארקרים ספציפיים יותר לסרטן הערמונית.
- יש צורך במחקרים נוספים כדי לחקור את ההשלכות הקליניות של ביטוי HERV.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Prostate cancer biomarker discovery faces challenges due to the limited specificity and sensitivity of current clinical markers like PSA. This study introduces a high-density microarray platform designed to characterize individual HERV loci expression, offering a novel approach to identify transcriptionally active elements that may serve as disease-specific biomarkers. By enabling systematic detection of HERV-driven ncRNA transcription and coding gene modulation, the method supports mechanistic de-risking and target validation in oncology discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by identifying individual HERV loci with differential expression in tumor versus normal prostate tissues.
- Scientific Value: Supports biological de-risking through functional analysis of HERV loci, including LTR, gag, and pol regions, to assess regulatory potential in cancer pathways.
- Operational Value: Provides a standardized microarray workflow for reproducible detection of HERV expression across matched tumor-normal sample pairs.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative expression data from fragmented and labeled cDNA hybridized to HERV-specific probe sets, enabling biomarker screening.
- Operational Value: Facilitates assay standardization via biocomputing normalization, hierarchical clustering, and false discovery rate correction for differential expression analysis.
- Operational Value: Supports scalability through processing of multiple match pair samples (initial 5, expanded to 35) to identify prostate-specific HERV signatures.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links HERV expression patterns to cancer pathology by focusing on LTR subdomains (U3, U5) with potential roles in transcriptional regulation.
- Scientific Value: Enables follow-up validation via RT-PCR primer design targeting functionally annotated HERV structures identified on the microarray.
- Operational Value: Promotes translational continuity by connecting discovery-phase HERV locus identification to downstream functional and diagnostic applications.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis-driven target validation to lead identification, particularly in ncRNA-based biomarker exploration for prostate cancer.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by identifying transcriptionally active HERV loci that may drive ncRNA transcription or modulate coding gene expression in tumor contexts.
- Screening: Enables assay readiness through standardized RNA extraction, whole transcriptome amplification, cDNA fragmentation, and microarray hybridization steps.
- Analytics: Delivers quantitative differential expression measurements after normalization and FDR correction, allowing comparison of HERV loci expression between tumor and normal tissues.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through functional validation of top HERV hits using annotated sequences and PCR primer design for RT-PCR confirmation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for HERV expression profiling applicable across cancer types, as demonstrated by additional match pair samples from other tissues.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by resolving mechanistic ambiguity around HERV loci expression in prostate cancer.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized workflows for RNA extraction, amplification, labeling, and microarray processing.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing biomarker candidates with stronger disease association than PSA, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of HERV loci based on expression magnitude, specificity, and functional annotation for downstream investment.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology, RNA handling, and microarray hybridization techniques.
- Dependent on access to high-density microarray equipment, hybridization ovens, scanners, and biocomputing tools for data normalization and clustering.
- Necessitates cross-team standardization between pathology, molecular biology, and bioinformatics teams for sample processing and data interpretation.
- Involves adaptation considerations when applying the HERV microarray to different tissue types or cancer models beyond prostate cancer.
- Limited by the need for statistically validated workflows and representative patient sampling to ensure robustness in biomarker discovery, as noted in the study’s conclusion.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
2:42
Handling of Prostrate Tissues
4:03
RNA Extraction, Purification, and Quality Control
5:53
Target Preparation
7:33
Hybridization to the HERV Chip Microarray
9:24
Scanning and Data Analysis
10:14
Results: Identification of Active HERV Loci in Prostrate Tissues
11:49
Conclusion
