שיטות מיקרוסקופית הקרינה לקביעת הכדאיות של חיידקים באיגוד עם תאי יונקים
5 בספטמבר 2013
מרכזי בתחום הפתוגנזה חיידקים הוא היכולת להגדיר אם וכיצד חיידקים לשרוד לאחר חשיפה לתאי אוקריוטים. מאמר זה מתאר פרוטוקולים לשימוש בצבעי ניאון החושפים את יכולת הקיום של חיידקים בודדים בפנים וקשור עם תאי מארח.
ניסוי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית זה מעריך את חיוניותן של חיידקים בודדים הקשורים לתאי מאח, וקובע את חיוניות החיידקים במיקומים תת-תאיים שונים. ראשית, כדי לזהות חיידקים חיצוניים, יש לחשוף את התאים המודבקים לריאגנט פלואורסצנטי הספציפי לפרמיאז החיידקים, ואת המאח המודבק לנוכחות של צבעים פלואורסצנטיים המבדילים בין חיידקים חיים לבלתי חיים על בסיס שלמות ממברנת החיידקים. לאחר מכן, כדי לציין היכן נמצאים החיידקים בתוך תאי המאח, יש לדגרה את התאים המודבקים עם נוגדן המצומד פלואורסצנטית לסמן רלוונטי.
ניתן להשתמש בתמונות האימונופלואורסצנציה המתקבלות כדי לקבוע את אחוז החיידקים החיוניים בתוך תאי המארח ומחוצה להם, ואת הלוקליזציה התת-תאית של חיידקים תוך-תאיים חיוניים לעומת לא-חיוניים. בניגוד לבדיקות ספירת מושבות, בדיקות הגנה בגנטמיצין ומיקרוסקופיה אלקטרונית, שיטה זו מאפשרת הערכה ישירה של החיוניות של חיידקים בודדים. היא יכולה גם לחשוף אם קיימים הבדלים בחיוניות של חיידקים הנמצאים במדורים תת-תאיים שונים.
את הפרוצדורה זו תדגים בריטני ג'ונסון, סטודנטית לתואר מתקדם מהמעבדה שלי. לתאים שגודלו על לטיות זכוכית עגולות בלוחות של 24 בארות, הוסיפו את החיידקים הרלוונטיים והדגירו למשך הזמן הרצוי. שטפו את התאים המודבקים פעם אחת בעדינות. לאחר מכן, הוסיפו נוגדן המשורשר ל-Alexa Fluor 647, או לקטין ספציפי לחיידקים כדי לזהות חיידקים חיצוניים, והדגירו למשך 10 דקות בחושך בטמפרטורת החדר.
לאחר שתי שטיפות, שאבו את המצע והוסיפו 0.5 milliliters של תמיסת צביעה לחיים למתים המכילה cyto nine ו-propidium iodine. דגרו את התאים למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בחשיכה, ולאחר מכן שטפו פעמיים ב-mops magnesium chloride. הפכו את לוחות הכיסוי כשהצד הפונה כלפי מטה מונח על משטחות זכוכית.
יש לאטום באמצעות לק שקוף. רכשו את התמונות בתוך 30 דקות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם סטים של פילטרים המפורטים בפרוטוקול הטקסט לסימון החיידקים. הוסיפו 10 µg/mL של DPI במצע mors defined והדגירו למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר בחשיכה.
כעת הדביקו את התאים הדבקים בחיידקים המסומנים ב-DPI. אין לקבע את התאים באמצעות אלדהידים או ממסים אורגניים. שטפו את התאים פעם אחת.
לאחר מכן, הוסיפו נוגדן או לקטין המצומדים ל-Alexa Fluor 647 והדגירו למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בחשיכה. לאחר שתי שטיפות עם MOPS buffer, הוסיפו נוגדן המצומד ל-Alexa Fluor 555 נגד הסמן התת-תאי הרלוונטי והדגירו למשך 20 דקות. לאחר שתי שטיפות עם MOPS buffer, שטפו את התאים פעם אחת עם MOPS magnesium chloride. לאחר מכן, שאבו את המדיום והוסיפו 0.4 µM Cyt Green; הדגירו את התאים למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר בחשיכה, ושטפו את התאים פעמיים ב-MOPS magnesium chloride.
לאחר מכן יש לשטוף את התאים. פעם נוספת ב-mops magnesium chloride למשך חמש דקות. הפוך את כיסויי הזכוכית (cover slips) עם הפנים כלפי מטה על גבי שלשליות זכוכית, אטום בעזרת לק שקוף, וקנה תמונות של השלשליות בתוך 30 דקות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה.
בניסוי זה, נויטרופילים אנושיים הוחדרו בחיידקי גונוריאה. לקטין מסויה המשוייך ל-Alexa Fluor 647 מזהה גונוריאה חוץ-תאית. לאחר מכן, נוספו צבע חיוניות פלואורסצנטי ירוק ופרופידיום יודיד פלואורסצנטי אדום בנוכחות ספונין, אשר קושר כולסטרול כדי להחדיר צבעים באופן מועדף דרך ממברנות הפלזמה של תאי המאכסן, אך אינו חודר את ממברנת הגונוריאה בתאים מזוהמים; גרעין התא העקרי נצבע הן ב-cyto nine והן בפרופידיום יודיד.
תמונות אלו של נויטרופילים שנדבקו בגונוריאה הופקו באמצעות צבעי הבדיקה של חיוניות cyt talk screen ו-dpi. צבע ה-propidium iodide לא היה בשימוש מכיוון שהוא פולט פלואורסצנציה הן בערוץ האדום והן בערוץ העל-סגול במיקרוסקופ הפלואורסצנציה. כל חיידשי הגונוריאה נצבעים ב-dpi, אך רק חיידקים עם ממברנות פגומות נצבעים ב-ox green.
החיידק התוך-תאי שאינו חיוני מראה טבעת צביעה של CD 63 המקיפה את החיידק. טבעת זו מעידה על כך שגרנולות ראשוניות מועשרות בפגוזום זה. החיידק התוך-תאי החיוני חסר צביעה של CD 63, מה שמעיד על כך שגרנולות ראשוניות אינן מועשרות בפגוזום שלו.
יחד, הנתונים מראים מתאם בין החיוניות של הגונוקוקים לבין שהותם בפגוזום שלילי לגבי גרנולות ראשוניות. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להעריך את חיוניותם של חיידקים בתאי מאכסן. בנוסף, תוכלו לקבוע את חיוניותם של חיידקים הממוקמים במדורים שונים בתאי המאכסן באמצעות שימוש בנוגדנים המכוונים למדורים תת-תאיים אלו.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מפרט פרוטוקולים להערכת החיוניות של חיידקים בודדים הקשורים לתאי מאכסן באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. השיטות המפורטות מאפשרות קביעת חיוניות חיידקית במיקומים תת-תאיים שונים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- פתוגנזה בקטריאלית
- מיקרוסקופיה פלואורסצנטית
- אינטראקציות תאיות
רקע
- הבנת ההישרדות הבקטריאלית בתאי מאכסן היא קריטית למחקר של זיהומים.
- צבעים פלואורסצנטיים יכולים להבחין בין בקטריות חיות לבקטריות שאינן חיות.
- שיטות מסורתיות עשויות שלא לספק הערכות ישירות של חיוניות בקטריאלית בודדת.
- מחקר זה נועד לשפר את ההבנה של ההתנהגות הבקטריאלית בתוך תאי מאכסן.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה להערכת חיוניות חיידקים בתאי מאכסן.
- בחינת המיקום של חיידקים חיים לעומת חיידקים שאינם חיים.
- אספקת חלופה מדויקת יותר לשיטות קיימות להערכת חיוניות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- חשיפת תאים נגועים לרכיבים פלואורסצנטיים הספציפיים לפרמיאז חיידקי.
- שימוש בצבעים פלואורסצנטיים להבחנה בין חיידקים חיים לחיידקים שאינם חיים.
- דגירה עם נוגדנים המשוררים לפלואורסצנט כדי לזהות את מיקומי החיידקים.
- ניתוח של תמונות אימונופלואורסצנטיות לקביעת חיוניות החיידקים.
תוצאות עיקריות
- השיטה מאפשרת הערכה ישירה של חיוניות חיידקים בודדים.
- התוצאות מעידות על הבדלים בחיוניות בהתבסס על מיקום תת-תאי.
- דימות אימונופלואורסצנטי מספק ויזואליזציה ברורה של החיידקים.
- גישה זו עולה על שיטות מסורתיות בהערכת חיוניות חיידקים.
מסקנות
- השיטה שפותחה יעילה לבחינת חיוניות חיידקים בתאי מאחס.
- מיקרוסקופיית פלואורסצנציה יכולה לחשוף תובנות חשובות לגבי פתוגניזיות של חיידקים.
- מחקר זה משפר את ההבנה של אסטרטגיות הישרדות מיקרוביאליות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
כימות ישיר של חיוניות חיידקים בודדים בתוך תאי יונקים נותן מענה לפער קריטי במחקר של מחלות זיהומיות ובלימודי אינטראקציה בין מארח לפתוגן. תהליך עבודה זה של מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מאפשר מיפוי מדויק של חיידקים חיוניים לעומת לא חיוניים ברמה התת-תאית, ובכך תומך בהסרה של סיכונים מנגנוניים ובתיקוף מטרות בשלבים מוקדמים של הגילוי. גישה זו משפרת את הביטחון החזוי למחקר תרגומי ומספקת מידע לקבלת החלטות מותאמות סיכון בתיקי פיתוח ומחקר (R&D) של תרופות אנטי-אינפקטיביות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקר של מנגנוני הישרדות חיידקים בתוך מדורי תא מאח**.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של יעדים לאינטראקציה בין מאח{} לפתוגן.
- מסייע בהפחתת סיכונים מנגנוניים על ידי הבחנה בין חיידקים תוך-תאיים חיים לבלתי חיים.
- משפר את רמת הביטחון החזויה לצורך תיעדוף של יעדים למסמכים אנטי-זיהומיים.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מכין מערכי בדיקות דימות כמותיים ומתוכפשים עבור תהליכי סריקה המשכיים.
- מנקב את הערכת החיוניות ברמת החיידק הבודד לצורך הדירות (reproducibility).
- מאפשר השוואה חסונה של השפעות תרכובות על חיוניות חיידקים בהקשרי מאכסן.
- תומך בהתאמה ניתנת להרחבה למגוון מודלים של חיידקים ותאי מאחס.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה את קריאות החיוניות למערכות מאכסן-פתוגן הרלוונטיות למחלה.
- מספקת רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני של אסטרטגיות אנטי-אינפקטיביות.
- מאפשרת קידום מותאם-סיכון המבוסס על נתוני הישרדות ולוקליזציה סוב-סלולרית.
- תומכת בפיתוח ביומרקרים תרגומיים לתוצאות זיהום.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
שיטת מיקרוסקופיית הפלואורסצנציה הזו משתלבת ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני בתוכניות למחלות זיהומיות, ומגשרת בין מחקרים מכניסטיים מוקדמים לוולידציה תרגומית.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת השערות על הישרדות חיידקים ומנגנוני הגנה של המארח.
- סריקה: מספק תוצאות כמותיות וניתנות לשחזור של חיוניות לצורך הערכת תרכובות.
- אנליזה: מספק נתוני דימות בעלי תוכן גבוה להשוואה סטטיסטית של תנאי ניסוי.
- מחקר תרגומי: מקשר ממצאים in vitro למודלים תאיים רלוונטיים למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר וניתנת להתאמה למספר מיני חיידקים וסוגי תאי מארח.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מנגנונית במחקרי מאכסן-פתוגן.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של הערכת החיוניות ומשפר את השחזוריות בין ניסויים.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות לגבי המשך או הפסקת התהליך (go/no-go) וממקסם את הקצאת המשאבים בתיקי פיתוח של תרופות אנטי-אינפקטיביות.
- השפעה על תיק הפיתוח: מאפשר תעדוף של מטרות והתערבויות מועמדות תוך התחשבנות בסיכונים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרוסקופיה פלואורסצנטית ובניתוח תמונות כמותי.
- דורש גישה למכשור דימות מתקדם ולריאגנטים פלואורסצנטיים שעברו תיקוף.
- דורש סטנדרטיזציה של פרוטוקולי צביעה ופרמטרי דימות בין צוותים שונים.
- ניתן להתאמה למודלים שונים של תאי חיידקים ותאי יונקים באמצעות אופטימיזציה של הפרוטוקול.
- תלוי בתזמון מדויק ובטיפול זהיר כדי לשמור על מדדי החיוניות.
