שיטות מיקרוסקופית הקרינה לקביעת הכדאיות של חיידקים באיגוד עם תאי יונקים

ניסוי מיקרוסקופיה פלואורסצנטי זה מעריך את הכדאיות של חיידקים בודדים הקשורים לתאים מארחים וקובע את כדאיות החיידקים במיקומים תת-תאיים שונים. ראשית, כדי לזהות חיידקים חיצוניים, חשוף את התאים הנגועים למגיב פלואורסצנטי הספציפי לחיידקים, המארח הנגוע בנוכחות צבעים פלואורסצנטיים המבדילים בין חיידקים ברי קיימא לחיידקים שאינם ברי קיימא על סמך שלמות קרום החיידקים. לאחר מכן, כדי לציין היכן נמצאים חיידקים בתוך תאים מארחים, דגרו על התאים הנגועים עם נוגדן מצומד פלואורסצנטי לסמן מעניין.

תמונות אימונו-פלואורסצנטיות המתקבלות יכולות לקבוע את אחוז החיידקים ברי קיימא בתוך התאים המארחים ומחוצה להם ואת הלוקליזציה התת-תאית של חיידקים תוך-תאיים ברי קיימא לעומת חיידקים תוך-תאיים שאינם ברי קיימא. בניגוד למבחני ספירת מושבות, מבחני הגנה על גנטמיצין ומיקרוסקופ אלקטרונים, שיטה זו מאפשרת הערכה ישירה של כדאיות החיידקים הבודדים. זה גם יכול לגלות אם לחיידקים בתאים תת-תאיים שונים יש הבדלים בכדאיותם.

תדגים את ההליך הזה בריטני ג'ונסון, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלי, טורי לתאים שגודלו על החלקות כיסוי זכוכית עגולות ב -24, צלחות באר מוסיפות חיידקים מעניינים ודוגרות לזמן הרצוי. שטפו את התאים הנגועים פעם אחת בעדינות. לאחר מכן הוסף נוגדן מצומד Alexa Fluor 6 4 7, או לקטין ספציפי לחיידקים כדי לזהות חיידקים חיצוניים ולדגור במשך 10 דקות בחושך בטמפרטורת החדר.

לאחר שתי שטיפות, יש לשאוב את החומר ולהוסיף 0.5 מיליליטר תמיסת צביעה מתה חיה המכילה ציטו ניין ופרופידיום יוד. דגרו על התאים למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך, ואז שטפו פעמיים במגבים מגנזיום כלוריד. הפוך את החלקות הכיסוי עם הפנים כלפי מטה על שקופיות זכוכית.

יש לאטום עם לק שקוף. רכוש את התמונות תוך 30 דקות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם ערכות מסננים המפורטות בפרוטוקול הטקסט כדי לתייג את החיידקים. הוסף 10 מיקרוגרם למיליליטר DPI במדיום מוגדר מורס ודגר במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.

כעת הדביקו את התאים הדבקים בחיידקים המסומנים ב-DPI. אין לתקן את התאים עם אלדהידים או ממיסים אורגניים. שוטפים את התאים פעם אחת.

לאחר מכן הוסיפו נוגדן או לקטין מצומדים של Alexa Fluor 6, 4, 7 ודגרו במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. לאחר שתי שטיפות עם מאגר מגבים, הוסף נוגדן מצומד Alexa Fluor 5 5, 5 כנגד הסמן התת-תאי המעניין ודגירה למשך 20 דקות לאחר שתיים, RINs עם מגבים מאגר, שוטפים את התאים פעם אחת עם מגבים מגנזיום כלוריד. לאחר מכן שואבים את המדיה ומוסיפים 0.4 תאים ירוקים של ציט מיקרו-מולרי למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר בחושך, מפעילים את התאים פעמיים במגבים, מגנזיום כלוריד.

ואז לשטוף תאים. פעם נוספת במגבים מגנזיום כלוריד למשך חמש דקות. הפוך את החלקות הכיסוי עם הפנים כלפי מטה על שקופיות זכוכית אטום עם לק שקוף, קבל תמונות של השקופיות תוך 30 דקות במיקרוסקופ הקרינה.

בניסוי זה, נויטרופילים אנושיים נדבקו בזיבה. לקטין פולי סויה מצומד Alexa Fluor 6 4 7 מזהה זיבה חוץ-תאית. ואז הכדאיות הפלואורסצנטית הירוקה מתה, ונוספו יודיד הפרופידיום הפלואורסצנטי האדום בנוכחות ספונין, המבודד כולסטרול כדי לחלחל באופן מועדף את ממברנות הפלזמה של התא המארח, אך אינו מחלחל לקרום הזיבה בתאים נגועים, גרעין התא האיקריוטי מכתים הן בציטו תשע והן בפרופידיום יודיד.

תמונות אלה של נויטרופילים נגועים בזיבה נוצרו באמצעות צבעי הכדאיות cyt talk screen ו-dpi. צבע הפרופידיום יודיד לא היה בשימוש מכיוון שהוא זוהר בתעלות אדומות ואולטרה סגולות במיקרוסקופ הקרינה. כל כתם זיבה עם dpi, אך רק חיידקים עם ממברנות שנפגעו מכתימים בירוק שור.

לחיידקים התוך-תאיים הלא ברי קיימא יש טבעת של צביעה ל-CD 63 המקיפה את החיידקים. טבעת זו מצביעה על גרגירים ראשוניים מועשרים בפאגוזום זה. החיידק התוך-תאי הבר-קיימא חסר צביעה ל-CD 63, מה שמצביע על כך שגרגירים ראשוניים אינם מועשרים בפאגוזום שלו. תפוס.

יחד, הנתונים מראים מתאם בין הכדאיות של זיבה לבין תושבים בפגוזום שלילי גרגיר ראשוני. אחרי הצפייה בסרטון הזה, אתם אמורים להבין היטב כיצד להעריך את הכדאיות של חיידקים בתאים מארחים. בנוסף, תוכל לקבוע את הכדאיות של חיידקים הממוקמים בתאים שונים בתאים מארחים על ידי שימוש בנוגדנים המכוונים כנגד תאים תת-תאיים אלה.