שיטות מיקרוסקופית הקרינה לקביעת הכדאיות של חיידקים באיגוד עם תאי יונקים
5 בספטמבר 2013
מרכזי בתחום הפתוגנזה חיידקים הוא היכולת להגדיר אם וכיצד חיידקים לשרוד לאחר חשיפה לתאי אוקריוטים. מאמר זה מתאר פרוטוקולים לשימוש בצבעי ניאון החושפים את יכולת הקיום של חיידקים בודדים בפנים וקשור עם תאי מארח.
ניסוי מיקרוסקופיה פלואורסצנטי זה מעריך את הכדאיות של חיידקים בודדים הקשורים לתאים מארחים וקובע את כדאיות החיידקים במיקומים תת-תאיים שונים. ראשית, כדי לזהות חיידקים חיצוניים, חשוף את התאים הנגועים למגיב פלואורסצנטי הספציפי לחיידקים, המארח הנגוע בנוכחות צבעים פלואורסצנטיים המבדילים בין חיידקים ברי קיימא לחיידקים שאינם ברי קיימא על סמך שלמות קרום החיידקים. לאחר מכן, כדי לציין היכן נמצאים חיידקים בתוך תאים מארחים, דגרו על התאים הנגועים עם נוגדן מצומד פלואורסצנטי לסמן מעניין.
תמונות אימונו-פלואורסצנטיות המתקבלות יכולות לקבוע את אחוז החיידקים ברי קיימא בתוך התאים המארחים ומחוצה להם ואת הלוקליזציה התת-תאית של חיידקים תוך-תאיים ברי קיימא לעומת חיידקים תוך-תאיים שאינם ברי קיימא. בניגוד למבחני ספירת מושבות, מבחני הגנה על גנטמיצין ומיקרוסקופ אלקטרונים, שיטה זו מאפשרת הערכה ישירה של כדאיות החיידקים הבודדים. זה גם יכול לגלות אם לחיידקים בתאים תת-תאיים שונים יש הבדלים בכדאיותם.
תדגים את ההליך הזה בריטני ג'ונסון, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלי, טורי לתאים שגודלו על החלקות כיסוי זכוכית עגולות ב -24, צלחות באר מוסיפות חיידקים מעניינים ודוגרות לזמן הרצוי. שטפו את התאים הנגועים פעם אחת בעדינות. לאחר מכן הוסף נוגדן מצומד Alexa Fluor 6 4 7, או לקטין ספציפי לחיידקים כדי לזהות חיידקים חיצוניים ולדגור במשך 10 דקות בחושך בטמפרטורת החדר.
לאחר שתי שטיפות, יש לשאוב את החומר ולהוסיף 0.5 מיליליטר תמיסת צביעה מתה חיה המכילה ציטו ניין ופרופידיום יוד. דגרו על התאים למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך, ואז שטפו פעמיים במגבים מגנזיום כלוריד. הפוך את החלקות הכיסוי עם הפנים כלפי מטה על שקופיות זכוכית.
יש לאטום עם לק שקוף. רכוש את התמונות תוך 30 דקות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם ערכות מסננים המפורטות בפרוטוקול הטקסט כדי לתייג את החיידקים. הוסף 10 מיקרוגרם למיליליטר DPI במדיום מוגדר מורס ודגר במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
כעת הדביקו את התאים הדבקים בחיידקים המסומנים ב-DPI. אין לתקן את התאים עם אלדהידים או ממיסים אורגניים. שוטפים את התאים פעם אחת.
לאחר מכן הוסיפו נוגדן או לקטין מצומדים של Alexa Fluor 6, 4, 7 ודגרו במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. לאחר שתי שטיפות עם מאגר מגבים, הוסף נוגדן מצומד Alexa Fluor 5 5, 5 כנגד הסמן התת-תאי המעניין ודגירה למשך 20 דקות לאחר שתיים, RINs עם מגבים מאגר, שוטפים את התאים פעם אחת עם מגבים מגנזיום כלוריד. לאחר מכן שואבים את המדיה ומוסיפים 0.4 תאים ירוקים של ציט מיקרו-מולרי למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר בחושך, מפעילים את התאים פעמיים במגבים, מגנזיום כלוריד.
ואז לשטוף תאים. פעם נוספת במגבים מגנזיום כלוריד למשך חמש דקות. הפוך את החלקות הכיסוי עם הפנים כלפי מטה על שקופיות זכוכית אטום עם לק שקוף, קבל תמונות של השקופיות תוך 30 דקות במיקרוסקופ הקרינה.
בניסוי זה, נויטרופילים אנושיים נדבקו בזיבה. לקטין פולי סויה מצומד Alexa Fluor 6 4 7 מזהה זיבה חוץ-תאית. ואז הכדאיות הפלואורסצנטית הירוקה מתה, ונוספו יודיד הפרופידיום הפלואורסצנטי האדום בנוכחות ספונין, המבודד כולסטרול כדי לחלחל באופן מועדף את ממברנות הפלזמה של התא המארח, אך אינו מחלחל לקרום הזיבה בתאים נגועים, גרעין התא האיקריוטי מכתים הן בציטו תשע והן בפרופידיום יודיד.
תמונות אלה של נויטרופילים נגועים בזיבה נוצרו באמצעות צבעי הכדאיות cyt talk screen ו-dpi. צבע הפרופידיום יודיד לא היה בשימוש מכיוון שהוא זוהר בתעלות אדומות ואולטרה סגולות במיקרוסקופ הקרינה. כל כתם זיבה עם dpi, אך רק חיידקים עם ממברנות שנפגעו מכתימים בירוק שור.
לחיידקים התוך-תאיים הלא ברי קיימא יש טבעת של צביעה ל-CD 63 המקיפה את החיידקים. טבעת זו מצביעה על גרגירים ראשוניים מועשרים בפאגוזום זה. החיידק התוך-תאי הבר-קיימא חסר צביעה ל-CD 63, מה שמצביע על כך שגרגירים ראשוניים אינם מועשרים בפאגוזום שלו. תפוס.
יחד, הנתונים מראים מתאם בין הכדאיות של זיבה לבין תושבים בפגוזום שלילי גרגיר ראשוני. אחרי הצפייה בסרטון הזה, אתם אמורים להבין היטב כיצד להעריך את הכדאיות של חיידקים בתאים מארחים. בנוסף, תוכל לקבוע את הכדאיות של חיידקים הממוקמים בתאים שונים בתאים מארחים על ידי שימוש בנוגדנים המכוונים כנגד תאים תת-תאיים אלה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר פרוטוקולים להערכת הכדאיות של חיידקים בודדים הקשורים לתאי מארח באמצעות מיקרוסקופיה פלואורוסצנטית. השיטות המפורטות מאפשרות קביעת כדאיות החיידקים במיקומים תת-תאיים שונים.
רכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- פתוגנזה חיידקית
- מיקרוסקופיה פלואורוסצנטית
- אינטראקציות תאיות
רקע
- הבנת הישרדות חיידקים בתאי מארח חיונית לחקר זיהומים.
- צבעים פלואורוסצנטיים יכולים להבדיל בין חיידקים ברי-קיימא ללא ברי-קיימא.
- שיטות מסורתיות עשויות שלא לספק הערכות ישירות של כדאיות חיידקים בודדים.
- מחקר זה נועד לשפר את ההבנה של התנהגות החיידקים בתוך תאי מארח.
מטרת המחקר
- לפתח שיטה להערכת כדאיות חיידקים בתאי מארח.
- לחקור את הלוקליזציה של חיידקים ברי-קיימא לעומת לא ברי-קיימא.
- לספק אלטרנטיבה מדויקת יותר לשיטות הערכת כדאיות קיימות.
שיטות ששימשו
- חשיפת תאים נגועים לחומרים פלואורוסצנטיים ספציפיים לפרמאז חיידקי.
- שימוש בצבעים פלואורוסצנטיים להבחנה בין חיידקים ברי-קיימא ללא ברי-קיימא.
- דגירה עם נוגדנים פלואורוסצנטיים זוגיים לזיהוי מיקומי החיידקים.
- ניתוח של תמונות אימונופלואורוסצנטיות לקביעת כדאיות החיידקים.
תוצאות עיקריות
- השיטה מאפשרת הערכה ישירה של כדאיות חיידקים בודדים.
- התוצאות מצביעות על הבדלים בכדאיות בהתבסס על לוקליזציה תת-תאית.
- דימות אימונופלואורוסצנטי מספק ויזואליזציה ברורה של החיידקים.
- גישה זו עולה על השיטות המסורתיות בהערכת כדאיות חיידקים.
מסקנות
- השיטה שפותחה יעילה לחקר כדאיות חיידקים בתאי מארח.
- מיקרוסקופיה פלואורוסצנטית יכולה לחשוף תובנות חשובות לגבי פתוגנזה חיידקית.
- מחקר זה משפר את ההבנה של אסטרטגיות הישרדות מיקרוביאליות.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Direct quantification of individual bacterial viability within mammalian cells addresses a critical gap in infectious disease research and host-pathogen interaction studies. This fluorescence microscopy workflow enables precise mapping of viable versus non-viable bacteria at the subcellular level, supporting mechanistic de-risking and target validation in early discovery. The approach enhances predictive confidence for translational research and informs risk-adjusted portfolio decisions in anti-infective R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of bacterial survival mechanisms within host cell compartments.
- Supports functional validation of host-pathogen interaction targets.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing viable from non-viable intracellular bacteria.
- Improves predictive confidence for prioritizing anti-infective targets.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, quantitative imaging assays for downstream screening workflows.
- Standardizes viability assessment at the single-bacterium level for reproducibility.
- Enables robust comparison of compound effects on bacterial viability in host contexts.
- Supports scalable adaptation to diverse bacterial and host cell models.
Translational & Preclinical Research
- Aligns viability readouts with disease-relevant host-pathogen systems.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of anti-infective strategies.
- Enables risk-adjusted advancement based on subcellular localization and survival data.
- Supports translational biomarker development for infection outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
This fluorescence microscopy method integrates into the discovery-to-preclinical continuum for infectious disease programs, bridging early mechanistic studies and translational validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on bacterial survival and host defense mechanisms.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible viability outputs for compound evaluation.
- Analytics: Provides high-content imaging data for statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Connects in vitro findings to disease-relevant cellular models.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform adaptable to multiple bacterial species and host cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in host-pathogen studies.
- Operational Value: Standardizes viability assessment and enhances reproducibility across experiments.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and optimizes resource allocation in anti-infective portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and candidate interventions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy and quantitative image analysis.
- Needs access to advanced imaging instrumentation and validated fluorescent reagents.
- Demands cross-team standardization of staining protocols and imaging parameters.
- Adaptable to various bacterial and mammalian cell models with protocol optimization.
- Dependent on careful timing and handling to preserve viability readouts.
