Name: שיטות מיקרוסקופית הקרינה לקביעת הכדאיות של חיידקים באיגוד עם תאי יונקים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: למדו שיטת מיקרוסקופיית פלואורסצנציה לבדיקת הכדאיות של חיידקים בודדים בתאי יונקים. השיטה מאפשרת זיהוי ישיר של חיידקים חיים ומתים במיקומים תוך-תאיים שונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לאסיה סמירנוב ולורה Gonyar לקריאה ביקורתית של כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH r00 TW008042 וR01 AI097312 לAKCMBJ נתמכים בחלקו על ידי NIH T32 AI007046.

1. הערכת הכדאיות בקטריאלי עם יודיד Propidium וSYTO9 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדביק תאים שאינם חסיד ל12 coverslips זכוכית העגול בקוטר מ&quot;מ ב24 גם צלחות עם חיידקים של עניין. אל תתקנו את התאים עם אלדהידים או ממסים אורגניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את תאי פעם אחת בעדינות ב0.1 M 3 - (N-morpholino) חומצת propanesulfonic (מגבים), pH 7.2, המכילה 1 מ&quot;מ MgCl 2 (מגבים / MgCl 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים עבור 10 דקות בחושך בטמפרטורת חדר עם נוגדן אלקסה פלואוריד 647 מצמיד או לקטינים אשר נקשר למיני חיידקים של עניין, במגבים / MgCl 2, כדי לזהות חיידקים חיצוניים. </li></ol> הערה: ניהול שולט עם חיידקי חיים ומתים, בהיעדרם של תאי מארח, כדי להראות כי לקטינים או נוגדנים של עניין מחייבים את כל החיידקים ללא קשר לכדאיות (איור 1). <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את תאים פעמיים עם מגבים / MgCl 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב מ &#39;עדיה מהתאים ולהוסיף 0.5 מיליליטר בשידור חי / המלח מכתים פתרון. בשידור חי / המלח מכתים פתרון הוא 5 SYTO9 מיקרומטר, 30 מיקרומטר יודיד propidium, וsaponin 0.1% (ריכוזים סופיים) במגבים / MgCl 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים עבור 15 דקות בטמפרטורת חדר בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את תאים פעמיים במגבים / MgCl 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> coverslips מרחב זה עם הפנים כלפי מטה על גבי שקופיות זכוכית ולאטום עם לק השקוף. אל תשתמשו בחומרי הרכבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונות בתוך 30 דקות, באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם מערכות סינון בקנה אחד עם רכישת תמונה ירוקה, אדום, ומרחיק אדומה. </li></ol> הערה: שני מיקרוסקופ פלואורסצנטי הקונבנציונלי וכן במיקרוסקופ לייזר confocal הסריקה ניתן להשתמש. לאחר 30 דקות צבעי הניאון מתחילים לדלוף מהחיידקים ואת הנתונים שנרכשו כבר לא מדויקים. תמונות מוצגות במאמר זה נרכשו על מיקרוסקופ פלואורסצנטי הזקוף Nikon Eclipse E800 עם מצלמה דיגיטלית האמאמטסו אורקה-ER באמצעות תוכנת OpenLab. הקרינה של אלקסה פלואוריד 647 זוהתה באמצעות מסנן עם גל עירור של 590-650 ננומטר ומסנן פליטה של ​​663-735 ננומטר, והוא שווא בצבע כחול. הקרינה מן יודיד propidium זוהתה באמצעות מסנן עם גל עירור של 540-580 ננומטר ומסנן פליטה של ​​600-660 ננומטר. הקרינה מן SYTO9 זוהתה באמצעות מסנן עם גל עירור של 465-495 ננומטר ומסנן פליטה של ​​515-555 ננומטר. <ol start="10" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרוטוקול זה יביא לתמונות שבו חיידקי nonviable חיצוניים מופיעים כחולים + אדומים, חיידקי nonviable פנימיים מופיעים אדום בלבד, חיידקי קיימא חיצוניים מופיעים כחולים + ירוקים, והחיידקים קיימא פנימיים מופיעים ירוקים בלבד. לספור לפי העין את המספרים של חיידקים, כי הם nonviable nonviable קיימא חיצוני, פנימי, חיצוני ובת קיימא, ופנימי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב אחוזים מחיידקי קיימא החיצוניים על ידי חלוקת מספר חיידקי קיימא חיצוניים על ידי המספר הכולל של חיידקים חיצוניים (קיימא תוספת nonviמסוגל). לחשב אחוזים מחיידקי קיימא הפנימיים על ידי חלוקת מספר חיידקי קיימא פנימיים במספר הכולל של חיידקים פנימיים (קיימא תוספת nonviable) (איור 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ישנם שני פקדים חיוניים לבצע עם פרוטוקול זה. ראשית, לאמת שכל חיידקי nonviable הם יודיד חיובי propidium וכל החיידקים חיים הם SYTO9 חיוביים. תרבות אמצע לוגריתמים של חיידקים (בהעדר כל תאי מארח) צריכה להיות&gt; SYTO9 חיובי 95%. שמוצגת באיור 2 היא תרבות אמצע לוגריתמים של נ &#39; gonorrhoeae (ב10 8 מושבה להרכיב יחידות למ&quot;ל) הודגרו עם בשידור חי / המלח מכתים פתרון. שנית, לאמת כי שני יודיד propidium וSYTO9 יכולים להיכנס permeabilized תאי מארח נגועים,. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ליצור אוכלוסייה של חיידקים מתים, לאסוף 2 x 10 8 מושבה חיידקים ויוצרת יחידות בצינור microfuge 1.5 מיליליטר, להוסיף isopropanol 70% ולשבת ל10 דקות. גלולה החיידקים בmicrofugend לשטוף את החיידקים פעמים PBS להסיר isopropanol שיורית. לאחר מכן בצע פרוטוקול צעדים 1.5-1.7. הוסף 5 μl של השעיה חיידקים לשקופית זכוכית וכיסוי עם coverslip. דגימות תמונה כמו בשלב פרוטוקול 1.9. בתנאים אלה, של האוכלוסייה 100% צריכים להיות יודיד החיובי propidium (איור 2). בחלק ממיני חיידקים, יודיד propidium לא יכול להכניע לחלוטין מכתים SYTO9, וחיידקים nonviable עשויים להופיע צהובים או כתום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתאי phagocytic כמו נויטרופילים, לחשוף את תאי חיידקים נהרג isopropanol ולהבטיח כי של החיידקים תאיים 100% יודיד החיובי propidium (איור 3). לתאים nonphagocytic שלא יכול להפנים חיידקים מתים, זה עשוי להיות מספיק כדי לטפל בתאים נגועים עם אזיד הנתרן או סוכני תא permeant אחרים מיקרוביאלית לפני הוספה בשידור חי / המלח מכתים פתרון. </li></ol></li></ol> 2. קטריאלי הכדאיות הערכה עם Sytox Green וDAPI <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיידקי תווית של עניין עם 10 מיקרוגרם / מיליליטר DAPI בינונית מוגדר של מורס 25 ל20 דקות בטמפרטורת חדר בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדביק תאים שאינם חסיד ל12 coverslips זכוכית העגול בקוטר מ&quot;מ ב24 גם צלחות עם חיידקים שכותרתו DAPI. אל תתקנו את התאים עם אלדהידים או ממסים אורגניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את תאי פעם עם מגבים / MgCl 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים עבור 10 דקות בטמפרטורת חדר בחושך עם נוגדן אלקסה פלואוריד 647 מצמיד או לקטינים אשר נקשר למיני חיידקים של עניין, במגבים / MgCl 2, כדי לזהות חיידקים חיצוניים. ראה הערה בשלב פרוטוקול 1.3 עבור פקדים שהציע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקשורת לשאוב מהתאים ולהוסיף 0.5 מיליליטר 0.4 מיקרומטר Sytox ירוק במגבים / MgCl 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים למשך 5 דקות בטמפרטורת חדר בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את תאים פעמיים במגבים / MgCl 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים פעם אחת במגבים / MgCl 2 למשך 5 דקות. </li><li&gt; לרכוש תמונות בתוך 30 דקות עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי. ראה שלב פרוטוקול 1.9 לתיאור של מיקרוסקופ, מצלמה דיגיטלית, ורכישת תוכנה. </li></ol> הערה: הקרינה מAlexa פלואוריד 647 זוהתה באמצעות מסנן עם גל עירור של 590-650 ננומטר ומסנן פליטה של ​​663-735 ננומטר, והוא שגוי בצבע אדום. הקרינה מן Sytox הירוק זוהתה באמצעות מסנן עם גל עירור של 465-495 ננומטר ומסנן פליטה של ​​515-555 ננומטר. הקרינה מן DAPI זוהתה באמצעות מסנן עם גל עירור של 355-375 ננומטר ומסנן מחסום 400 ננומטר. <ol start="10" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרוטוקול זה יביא לתמונות שבו חיידקי nonviable חיצוניים יופיעו אדום + ירוק, חיידקי nonviable פנימיים מופיעים ירוקים + כחולים, חיידקי קיימא חיצוניים מופיעים אדום + כחול, והחיידקים קיימא פנימיים מופיעים כחולים בלבד (איור 4). לכמת אחוז מחיידקים החיצוניים ופנימיים כמתואר בפרוטוקול STEp 1.11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבקרות מתוארות בשלב פרוטוקול 1.12 צריכה להתבצע עם שילוב הצבע DAPI / Sytox הירוק (איורים 2 ו -3). </li></ol> 3. הערכה בקטריאלי ליכולת הקיום לצד לוקליזציה subcellular <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיידקי תווית של עניין עם 10 מיקרוגרם / מיליליטר DAPI בינונית מוגדר של המורס ל20 דקות בטמפרטורת חדר בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדביק תאים שאינם חסיד ל12 coverslips זכוכית העגול בקוטר מ&quot;מ ב24 גם צלחות עם חיידקים שכותרתו DAPI. אל תתקנו את התאים עם אלדהידים או ממסים אורגניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את תאי פעם עם מגבים / MgCl 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 10 דקות בטמפרטורת חדר בחושך עם נוגדן אלקסה פלואוריד 647 מצמיד או לקטינים אשר נקשר למיני חיידקים של עניין, במגבים / MgCl 2, כדי לזהות חיידקים חיצוניים. ראה הערה בשלב פרוטוקול 1.3 עבור פקדים שהציע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקשורת לשאוב מהתאים ולשטוף תאים שני times במגבים / MgCl 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים עם נוגדנים נגד סמן subcellular של ריבית ל20 דקות 555 יחד-Alexa פלואוריד, במגבים / MgCl 2 המכיל saponin 0.2%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את תאים פעמיים במגבים / MgCl 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים פעם אחת במגבים / MgCl 2 למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקשורת לשאוב מהתאים ולהוסיף 0.4 מיקרומטר Sytox ירוק במגבים / MgCl 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים 5 דקות בטמפרטורת חדר בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את תאים פעמיים במגבים / MgCl 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים פעם אחת במגבים / MgCl 2 למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונות של שקופיות בתוך 30 דקות על מיקרוסקופ פלואורסצנטי. ראה שלב פרוטוקול 1.9 לתיאור של מיקרוסקופ, מצלמה דיגיטלית, ורכישת תוכנה. </li></ol> הערה: הקרינה מAlexa פלואוריד 647 זוהתה באמצעות מסנן עם גל עירור של 590-650 ננומטר ומסנן פליטה של ​​663-735 ננומטר, והוא שווא בצבע סגול. ו הקרינהrom אלקסה פלואוריד 555 זוהה באמצעות מסנן עם גל עירור של 540-580 ננומטר ומסנן פליטה של ​​600-660 ננומטר. הקרינה מן Sytox הירוק זוהתה באמצעות מסנן עם גל עירור של 465-495 ננומטר ומסנן פליטה של ​​515-555 ננומטר. הקרינה מן DAPI זוהתה באמצעות מסנן עם גל עירור של 355-375 ננומטר ומסנן מחסום 400 ננומטר. <ol start="14" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרוטוקול זה יביא לתמונות שבו חיידקי nonviable חיצוניים מופיעים סגולים + ירוקים, חיידקי nonviable פנימיים מופיעים ירוקים + כחולים, חיידקי קיימא חיצוניים מופיעים סגולים + כחולים, חיידקי קיימא פנימיים מופיעים כחולים בלבד, וחלבון subcellular מופיע אדום (איור 4). לכמת את perecent של חיידקי קיימא חיצוניים ופנימיים כמתואר בפרוטוקול הצעדים 1.11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבקרות מתוארות בשלב פרוטוקול 1.12 צריכה להתבצע עם שילוב הצבע DAPI / Sytox הירוק (איורים 2 ו -3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוךבנוסף לספירת חיידקי קיימא וnonviable, לסווג כל חיידקים כחיוביים או שלילי לcolocalization עם סמן subcellular של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב אחוזים מחיידקי קיימא colocalized עם סמן subcellular על ידי חלוקת מספר חיידקי קיימא colocalized במספר הכולל של חיידקים ובת קיימא. לחשב אחוזים מחיידקי nonviable colocalized עם סמן subcellular על ידי חלוקת מספר חיידקי colocalized nonviable במספר הכולל של חיידקי nonviable. </li></ol>

<ol><li>Woolard, M. D., Frelinger, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outsmarting+the+host%3A+bacteria+modulating+the+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Res%22%5BJournal%5D)">Outsmarting the host: bacteria modulating the immune response.</a> Immunol. Res. 41, 188-202 (2008).</li>
<li>Johnson, M. B., Criss, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+of+Neisseria+gonorrhoeae+to+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Resistance of Neisseria gonorrhoeae to neutrophils.</a> Front Microbiol. 2, 77(2011).</li>
<li>Simons, M. P., Nauseef, W. M., Apicella, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+Neisseria+gonorrhoeae+with+adherent+polymorphonuclear+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Interactions of Neisseria gonorrhoeae with adherent polymorphonuclear leukocytes.</a> Infect. Immun. 73, 1971-1977 (2005).</li>
<li>Seib, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+oxidative+stress+defenses+of+Neisseria+gonorrhoeae+by+using+a+human+polymorphonuclear+leukocyte+survival+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Investigation of oxidative stress defenses of Neisseria gonorrhoeae by using a human polymorphonuclear leukocyte survival assay.</a> Infect. Immun. 73, 5269-5272 (2005).</li>
<li>Criss, A. K., Katz, B. Z., Seifert, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+of+Neisseria+gonorrhoeae+to+non-oxidative+killing+by+adherent+human+polymorphonuclear+leucocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Resistance of Neisseria gonorrhoeae to non-oxidative killing by adherent human polymorphonuclear leucocytes.</a> Cell Microbiol. 11, 1074-1087 (2009).</li>
<li>Edwards, A. M., Massey, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+of+human+cells+by+a+bacterial+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Invasion of human cells by a bacterial pathogen.</a> J. Vis. Exp. (49), e2693(2011).</li>
<li>Bozzola, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conventional+specimen+preparation+techniques+for+transmission+electron+microscopy+of+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Conventional specimen preparation techniques for transmission electron microscopy of cultured cells.</a> Methods Mol. Biol. 369, 1-18 (2007).</li>
<li>Dorward, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+analysis+of+bacteria-host+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural analysis of bacteria-host cell interactions.</a> Methods Mol. Biol. 431, 173-187 (2008).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+absolute%2C+and+simultaneous+quantification+of+specific+pathogenic+strain+and+total+bacterial+cells+using+an+ultrasensitive+dual-color+flow+cytometer%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Rapid, absolute, and simultaneous quantification of specific pathogenic strain and total bacterial cells using an ultrasensitive dual-color flow cytometer.</a> Anal. Chem. 82, 1109-1116 (2010).</li>
<li>Mueller, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibrio+cholerae+strains+possess+multiple+strategies+for+abiotic+and+biotic+surface+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Vibrio cholerae strains possess multiple strategies for abiotic and biotic surface colonization.</a> J. Bacteriol. 189, 5348-5360 (2007).</li>
<li>Shen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+inactivation+of+Salmonella+and+Pseudomonas+biofilms+on+stainless+steel+by+use+of+T-128%2C+a+fresh-produce+washing+aid%2C+in+chlorinated+wash+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Enhanced inactivation of Salmonella and Pseudomonas biofilms on stainless steel by use of T-128, a fresh-produce washing aid, in chlorinated wash solutions.</a> Appl. Environ. Microbiol. 78, 6789-6798 (2012).</li>
<li>Hoefel, D., Grooby, W. L., Monis, P. T., Andrews, S., Saint, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+of+water-borne+bacteria+using+viability+assays+and+flow+cytometry%3A+a+comparison+to+culture-based+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Enumeration of water-borne bacteria using viability assays and flow cytometry: a comparison to culture-based techniques.</a> J Microbiol Methods. 55, 585-597 (2003).</li>
<li>Oh, H., Siano, B., Diamond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+isolation+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp.%22%5BJournal%5D)">Neutrophil isolation protocol.</a> J. Vis. Exp.. (17), e745(2008).</li>
<li>Allen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+and+confocal+microscopy+of+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence and confocal microscopy of neutrophils.</a> Methods Mol Biol. 412, 273-287 (2007).</li>
<li>Kaplan, E. L., Chhatwal, G. S., Rohde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+ability+of+penicillin+to+eradicate+ingested+group+A+streptococci+from+epithelial+cells%3A+clinical+and+pathogenetic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Reduced ability of penicillin to eradicate ingested group A streptococci from epithelial cells: clinical and pathogenetic implications.</a> Clin. Infect. Dis. 43, 1398-1406 (2006).</li>
<li>Chow, O. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statins+enhance+formation+of+phagocyte+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Statins enhance formation of phagocyte extracellular traps.</a> Cell Host Microbe. 8, 445-454 (2010).</li>
<li>Thulin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viable+group+A+streptococci+in+macrophages+during+acute+soft+tissue+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Med%22%5BJournal%5D)">Viable group A streptococci in macrophages during acute soft tissue infection.</a> PLoS Med. 3, e53(2006).</li>
<li>Kubica, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+potential+new+pathway+for+Staphylococcus+aureus+dissemination%3A+the+silent+survival+of+S.+aureus+phagocytosed+by+human+monocyte-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A potential new pathway for Staphylococcus aureus dissemination: the silent survival of S. aureus phagocytosed by human monocyte-derived macrophages.</a> PLoS One. 3, (2008).</li>
<li>Swords, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+xenopi+multiplies+within+human+macrophages+and+enhances+HIV+replication+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Pathog%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium xenopi multiplies within human macrophages and enhances HIV replication in vitro.</a> Microb. Pathog. 40, 41-47 (2006).</li>
<li>Tamilselvam, B., Almeida, R. A., Dunlap, J. R., Oliver, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+uberis+internalizes+and+persists+in+bovine+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Pathog%22%5BJournal%5D)">Streptococcus uberis internalizes and persists in bovine mammary epithelial cells.</a> Microb. Pathog. 40, 279-285 (2006).</li>
<li>Martinez, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+determination+of+Mycobacterium+leprae+viability+by+use+of+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Molecular determination of Mycobacterium leprae viability by use of real-time PCR.</a> J. Clin. Microbiol. 47, 2124-2130 (2009).</li>
<li>Botha, M., Botes, M., Loos, B., Smith, C., Dicks, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactobacillus+equigenerosi+strain+Le1+invades+equine+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Lactobacillus equigenerosi strain Le1 invades equine epithelial cells.</a> Appl. Environ. Microbiol. 78, 4248-4255 (2012).</li>
<li>Allen, L. A., Schlesinger, L. S., Kang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulent+strains+of+Helicobacter+pylori+demonstrate+delayed+phagocytosis+and+stimulate+homotypic+phagosome+fusion+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Virulent strains of Helicobacter pylori demonstrate delayed phagocytosis and stimulate homotypic phagosome fusion in macrophages.</a> J. Exp. Med. 191, 115-128 (2000).</li>
<li>Smith, C. D., Berk, S. G., Brandl, M. T., Riley, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+characteristics+of+diarrheagenic+Escherichia+coli+pathotypes+and+Helicobacter+pylori+during+passage+through+the+free-living+ciliate%2C+Tetrahymena+sp%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Survival characteristics of diarrheagenic Escherichia coli pathotypes and Helicobacter pylori during passage through the free-living ciliate, Tetrahymena sp.</a> FEMS Microbiol. Ecol. 82, 574-583 (2012).</li>
<li>Morse, S. A., Bartenstein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purine+metabolism+in+Neisseria+gonorrhoeae%3A+the+requirement+for+hypoxanthine%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Purine metabolism in Neisseria gonorrhoeae: the requirement for hypoxanthine.</a> Can. J. Microbiol. 26, 13-20 (1980).</li>
<li>Johnson, M. B., Criss, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neisseria+gonorrhoeae+phagosomes+delay+fusion+with+primary+granules+to+enhance+bacterial+survival+inside+human+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Neisseria gonorrhoeae phagosomes delay fusion with primary granules to enhance bacterial survival inside human neutrophils.</a> Cell Microbiol. , (2013).</li>
<li>Stocks, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+and+use+of+the+commercially+available+viability+stain%5BTitle%5D)+AND+%22BacLight.+Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Mechanism and use of the commercially available viability stain.</a> BacLight. Cytometry A. 61, 189-195 (2004).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

מוצגים כאן הם שני פרוטוקולים המשתמשים DNA מחייב וצבעי כדאיות בשיתוף עם קטיני ניאון כדי לזהות חיידקים חיים ומתים מצורפים ובתוך תאים אנושיים. מכיוון ששני הפרוטוקולים ביעילות להפלות חיים מחיידקים מתים, הבחירה באיזה פרוטוקול של להשתמש תלויה במטרה הניסוי. הפרוטוקול הראשון משתמש יודיד propidium כדי לזהות חיידקים וSYTO9 כדי לזהות חיידקים בשלמות nonviable. שמוצג באיור 4 א היא תמונה מייצגת של פרוטוקול 1 תחול על נויטרופילים אנושיים נגועים בנ gonorrhoeae. צבעים אלה ...

יש אינטראקציה דינמית ואבולוציה משותפת בין חיידקים והמארחים שבו הם מתגוררים. חיידקים התפתחו האברונים דבקות, מערכות הפרשה, ו / או את היכולת לייצר רעלים המאפשרים זיהום הפורה של phagocytic המארח ותאים שאינם phagocytic. החיידקים חייבים גם להתמודד עם הכרה ופעילות מיקרוביאלית של מערכת החיסון המארחת. המערכת החיסונית של המארח מורכבת ממרכיבים מולדים ובעלי כושר הסתגלות, כולל מחסומים פיסיקליים וכימיים, תאי מערכת החיסון, מערכת המשלימה, ורכיבים אחרים של חסינות הלחות. בעוד חיידקים רבים רגישים להרג ולאישור על ידי התגובה חיסונית מארח רב שכבתית, כמה חיידקים פתוגניים ואופורטוניסטיים התפתחו מנגנונים להדביק מגוון רחב של תאי מארח ולחתור תחת אישור על ידי התגובה חיסונית מארח 1. Neisseria gonorrhoeae הוא דוגמא אחת לפתוגן חיידקים כי הוא מותאם מאוד להתמיד במארח האנושי שלה. N. gonorrhoeae קלות colonizes משטחי luminal של תאי האפיתל ברירית של דרכי השתן ואברי המין, לוע, לחמית, ופי טבעת. קולוניזציה מעוררת את גיוס שפע של נויטרופילים באתרים ברירית. הנויטרופילים הם phagocytes המקצועי שיש להם מגוון רחב של תהליכים מיקרוביאלית להרוג מיקרואורגניזמים, עם זאת, נ &#39; gonorrhoeae הוא מסוגל לשרוד בנוכחות של נויטרופילים 2-5. הבנה כיצד חיידקים פתוגנים, כגון נ gonorrhoeae לערער, ​​לדכא, ולחטוף את התגובה החיסונית כדי לשרוד סופו של דבר בסביבות מארח בדרך כלל עוינות הוא קריטי לפיתוח של טיפולים חדשים למאבק במחלות זיהומיות. פרוטוקולי ניסוי משמשים לעתים קרובות כדי לחקור הישרדות חיידקים בתאי מארח כוללים מבחני ספירת מושבה, מבחני הגנת גנטמיצין, ומיקרוסקופ אלקטרונים. במבחני ספירת מושבה, אוכלוסייה של תאים נגועים lysed (למשל, עם חומר ניקוי ל&quot;שich החיידקים עמידים) כדי לשחרר את החיידקים. Lysates הוא בדילול ומצופה על תקשורת מבוססת אגר, ומושבת יוצרי יחידות בlysates ממוספרת עבור כל נקודת זמן ו / או תנאי ניסוי. גישה זו מדווחת על יכולת הקיום של אוכלוסיית החיידקים כולה, אבל הוא לא מסוגל להבדיל בין תאיים והישרדות תאית. וריאציה על assay ספירת מושבה, assay הגנת גנטמיצין, במיוחד מודדת הישרדות חיידקים תאית, המבוסס על חוסר היכולת של גנטמיצין האנטיביוטיקה לחצות את קרום הפלזמה אוקריוטים 6. עם זאת, assay זה תלוי בחיידקים שרגישים להרג על ידי גנטמיצין (אנטיביוטי או אחר, כי הוא קרום impermeant דומה אוקריוטים) וחוסר היכולת של האנטיביוטיקה כדי לקבל גישה לחיידקים פנימיים. לכן, assay הגנת גנטמיצין לא יכול להיות יעיל לבדיקה של כל מיני החיידקים או כאשר בוחנים את הישרדות חיידקים במאודתאי pinocytic כגון נויטרופילים. אף אחת מהגישות הללו חושף את לוקליזציה subcellular או התנהגות של חיידקים בודדים אחרת (למשל, אם החיידקים ליצור אגרגטים או microcolonies שמתנהג בצורה שונה מתאי חיידקים בודדים). גישה בשימוש תכופה נוספת כדי לבחון את הכדאיות של חיידקים חיצוניים ופנימיים בודדים היא מיקרוסקופית אלקטרונים הילוכים דק סעיף (TEM). גישה זו יש יתרון בכך שהוא יכול לספק מידע לגבי מיקומם של החיידקים בתאי מארח (למשל phagosome, ציטופלסמה, autophagosome), אשר יכול להיחקר יותר על ידי מיקרוסקופ immunoelectron עם נוגדני מצמידים זהב נגד סמני subcellular. עם זאת, במיקרוסקופ אלקטרונים אינו רגיש במיוחד בהערכת כדאיות חיידקים. כאשר חלקים מוטבעים מגואלות אצטט uranyl, ציטראט עופרת, או חומרים כימיים אלקטרונים צפופים אחרים וצלמו על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים, חיידקי אלקטרונים צפופים נחשבים קיימא וelecטרון-Lucent 7,8 nonviable. עם זאת, הנחה זו מגזים בהערכת כדאיות חיידקים, שכן חיידקים מתים האלה רק עם קרומים ונטולי ציטופלסמה שיבשו קשות מופיעה אלקטרונים לוסנט. בנוסף, חלק ממיני חיידקים עשויים להציג מגוון של צפיפויות אלקטרונים בהתאם לשלב צמיחה שלהם, ולכן קשה לקבוע כדאיות. כחלופה או בנוסף לשיטות בשימוש נרחבת אלה, כאן אנו מספקים פרוטוקולים ורציונל לשימוש בצבעי ניאון שמצביעים על כדאיות בקטריאלי על מנת להעריך את ההישרדות של חיידקים מצורפים והפנימו על ידי תאי מארח. כדי לזהות חיידקים תאיים, תאים נגועים נחשפים ראשון למגיב ניאון, כגון קטינים או נוגדני חיידק ספציפי. לאחר מכן התאים הנגועים permeabilized ונחשפו לצבעי DNA ספציפי שהם באופן דיפרנציאלי נגישים לחיידקים עם שלם לעומת ממברנות מושפלים, כתחליף ליכולת קיום חיידקים. בעמ &#39;הראשונהrotocol, SYTO9 הצבע החדיר הקרום מזהה את אוכלוסיית חיידקים בסך הכל, בעוד יודיד propidium נגיש רק לאלה חיידקים שהתפשרו ממברנות ולכן הן נחשבות nonviable. Propidium יודיד וSYTO9 כבר משמשים להערכת כדאיות חיידקים בbiofilms, להפלות פתוגניים מחיידקי nonpathogenic, ולמנות את החיידקים שמקורן במי קיימא 9-12. בפרוטוקול השני, 4 &#39;, 6&#39;-diamidino-2-phenylindole (DAPI) מזהה חיידקי סך הכל, בעוד Sytox הירוק הוא נגיש רק לאוכלוסיית nonviable. ניתן לשלב זוגות צבע כדאיות אלה עם immunofluorescence כדי לקבוע את המיקום של כל חיידק ביחס לחלבון של עניין, למשל להגדרת לוקליזציה subcellular חיידקים. השימוש במבחנים אלה מספק תובנה מפתח לתוך האינטראקציות שתגרומנה להרג או להישרדות חיידקים במהלך ההדבקה של תאי מארח. הפרוטוקולים שתוארו במאמר זה שימשו להערכת הכדאיות שלנ gonorrhoeae המחובר ולבתוך נויטרופילים אנושיים ראשוניים, ובכלל זה באוכלוסיות שונות של phagosomes נויטרופילים 5,13,14. עם זאת, יכולים להיות מיושמים על פרוטוקולים אלה כדי להעריך את הכדאיות של חיידקי גרם חיוביים וגרמו שליליים בphagocytes המקצועי, phagocytes הלא מקצועי, ופרוטוזואה 15-24.

<table><tbody><tr><td>21 גרם 3/4 מחטי פרפר לאיסוף דם</td><td>בקטון דיקינסון</td><td>367251</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>צינורות איסוף דם עם נתרן הפרין 10 מ"ל</td><td>בקטון דיקינסון</td><td>366480</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>מים סטריליים להשקיה</td><td>בקסטר</td><td>07-09-64-070</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>דקסטרן 500</td><td>סיגמא</td><td>31392</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>S641</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>חברת דקסטרוז</td><td>ריקה כימיקלים</td><td>RDCD0200</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>PBS של Dulbecco no Ca2+ או Mg2+</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH3002802</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>פתרון Ficoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>חומצה אצטית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP2401</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>כיסויי זכוכית עגולים 12 מ"מ</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-545-80 12CIR-1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>צלחות 24 בארות</td><td>Corning Incorporated</td><td>3524</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>סרום אנושי מאגר</td><td>Sigma</td><td>S7023</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>רמ"י</td><td>מדיה-טק</td><td>15-040-CV</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH3007103</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>אינטרלוקין-8 אנושי</td><td>מו"פ די מערכות</td><td>208-IL/CF</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>סיגמא</td><td>M3183</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Propidium Iodide</td><td>Life Technologies</td><td>L7007 או L7012</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>SYTO9</td><td>Life Technologies</td><td>L7007 או L7012</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ספונין</td><td>פלוקה אנליטי</td><td>47036</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>לקטין פולי סויה מצומד Alexa Fluor 647</td><td>Life Technologies</td><td>L-32463</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>סיגמא</td><td>D8417</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>SYTOX Green</td><td>Life Technologies</td><td>S7020</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>עכבר אנטי-CD63</td><td>מחקרים התפתחותיים בנק היברידומה</td><td>H5C6</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ערכת תיוג נוגדנים Alexa Fluor 555</td><td>Life Technologies</td><td>A20187</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>המציטומטר קו בהיר</td><td>האוסר סיינטיפיק</td><td>1492</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>מלקחיים</td><td>EMS</td><td>78320</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>סורוול לג'נד RT + צנטריפוגה</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>75004377</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

שיטות מיקרוסקופית הקרינה לקביעת הכדאיות של חיידקים באיגוד עם תאי יונקים

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

מרכזי בתחום הפתוגנזה חיידקים הוא היכולת להגדיר אם וכיצד חיידקים לשרוד לאחר חשיפה לתאי אוקריוטים. פרוטוקולים הנוכחיים כדי לענות על שאלות אלה כוללים מבחני ספירת מושבה, מבחני הגנת גנטמיצין, ומיקרוסקופ אלקטרונים. מבחני ספירת מושבה והגנת גנטמיצין רק להעריך את הכדאיות של אוכלוסיית החיידקים כולה ואינם מסוגלים לקבוע כדאיות חיידקים בודדות. במיקרוסקופ אלקטרונים ניתן להשתמש כדי לקבוע את הכדאיות של חיידקים בודדים ולספק מידע לגבי הלוקליזציה שלהם בתאי מארח. עם זאת, לעתים קרובות חיידקים להציג מגוון רחב של צפיפויות אלקטרונים, ביצוע הערכה של יכולת קיום קשה. מאמר זה מתאר פרוטוקולים לשימוש בצבעי ניאון החושפים את יכולת הקיום של חיידקים בודדים בפנים וקשור עם תאי מארח. מבחני אלו פותחו במקור כדי להעריך הישרדות של Neisseria gonorrhoeae בנויטרופילים אנושיים ראשוניים, אבל צריך להיותpplicable לכל אינטראקציה תא חיידק מארח. פרוטוקולים אלה משלבים צבעי קרום חדיר ניאון (SYTO9 ו4 &#39;,6-diamidino-2-phenylindole [DAPI]), שמכתים את כל חיידקים, עם צבעי קרום בלתי חדיר ניאון (יודיד propidium וSytox ירוק), שהם נגישים רק ל חיידקי nonviable. לפני permeabilization תא אוקריוטים, נוגדן או מגיב ניאון מתווסף לזהות חיידקים תאיים. לכן מבחני אלה מפלים את הכדאיות של חיידקים חסידים ולבתוך תאי אוקריוטים. פרוטוקול הוא גם סיפק לשימוש בצבעי הכדאיות בשילוב עם נוגדני ניאון לסמני תא אוקריוטים, על מנת לקבוע את לוקליזציה subcellular של חיידקים בודדים. צבעי כדאיות החיידקים שנדונו במאמר זה הם מוצר משלים רגיש ו / או תחליף לטכניקות מיקרוביולוגיה מסורתיות כדי להעריך את הכדאיות של חיידקים בודדים ולספק מידע בדבר שבו חיידקים לשרוד בתא מארחs.

הפרוטוקולים שתוארו שימשו כדי לבחון קיומה של נ &#39; gonorrhoeae לאחר חשיפה לאדם עיקרי נויטרופילים 5,26. הנויטרופילים היו נגועים בנ gonorrhoeae ומעובד עם פרוטוקול 1, באמצעות SYTO9 צבע כדאיות ירוקת הניאון ויודיד אדום ניאון propidium (איור 4 א). הצבעים נוספו בנוכחות saponin, אשר מפרידה כולסטרול לpermeabilize מעדיף קרום פלזמה תא מארח, ולא נ קרומי gonorrhoeae. דטרגנטים אחרים ייתכן שיצטרכו להיבדק אם ממברנות של החיידק של עני...

מרכזי בתחום הפתוגנזה חיידקים הוא היכולת להגדיר אם וכיצד חיידקים לשרוד לאחר חשיפה לתאי אוקריוטים. מאמר זה מתאר פרוטוקולים לשימוש בצבעי ניאון החושפים את יכולת הקיום של חיידקים בודדים בפנים וקשור עם תאי מארח.

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

ניסוי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית זה מעריך את חיוניותן של חיידקים בודדים הקשורים לתאי מאח, וקובע את חיוניות החיידקים במיקומים תת-תאיים שונים. ראשית, כדי לזהות חיידקים חיצוניים, יש לחשוף את התאים המודבקים לריאגנט פלואורסצנטי הספציפי לפרמיאז החיידקים, ואת המאח המודבק לנוכחות של צבעים פלואורסצנטיים המבדילים בין חיידקים חיים לבלתי חיים על בסיס שלמות ממברנת החיידקים. לאחר מכן, כדי לציין היכן נמצאים החיידקים בתוך תאי המאח, יש לדגרה את התאים המודבקים עם נוגדן המצומד פלואורסצנטית לסמן רלוונטי.ניתן להשתמש בתמונות האימונופלואורסצנציה המתקבלות כדי לקבוע את אחוז החיידקים החיוניים בתוך תאי המארח ומחוצה להם, ואת הלוקליזציה התת-תאית של חיידקים תוך-תאיים חיוניים לעומת לא-חיוניים. בניגוד לבדיקות ספירת מושבות, בדיקות הגנה בגנטמיצין ומיקרוסקופיה אלקטרונית, שיטה זו מאפשרת הערכה ישירה של החיוניות של חיידקים בודדים. היא יכולה גם לחשוף אם קיימים הבדלים בחיוניות של חיידקים הנמצאים במדורים תת-תאיים שונים.את הפרוצדורה זו תדגים בריטני ג'ונסון, סטודנטית לתואר מתקדם מהמעבדה שלי. לתאים שגודלו על לטיות זכוכית עגולות בלוחות של 24 בארות, הוסיפו את החיידקים הרלוונטיים והדגירו למשך הזמן הרצוי. שטפו את התאים המודבקים פעם אחת בעדינות. לאחר מכן, הוסיפו נוגדן המשורשר ל-Alexa Fluor 647, או לקטין ספציפי לחיידקים כדי לזהות חיידקים חיצוניים, והדגירו למשך 10 דקות בחושך בטמפרטורת החדר.לאחר שתי שטיפות, שאבו את המצע והוסיפו 0.5 milliliters של תמיסת צביעה לחיים למתים המכילה cyto nine ו-propidium iodine. דגרו את התאים למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בחשיכה, ולאחר מכן שטפו פעמיים ב-mops magnesium chloride. הפכו את לוחות הכיסוי כשהצד הפונה כלפי מטה מונח על משטחות זכוכית.יש לאטום באמצעות לק שקוף. רכשו את התמונות בתוך 30 דקות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם סטים של פילטרים המפורטים בפרוטוקול הטקסט לסימון החיידקים. הוסיפו 10 µg/mL של DPI במצע mors defined והדגירו למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר בחשיכה.כעת הדביקו את התאים הדבקים בחיידקים המסומנים ב-DPI. אין לקבע את התאים באמצעות אלדהידים או ממסים אורגניים. שטפו את התאים פעם אחת.לאחר מכן, הוסיפו נוגדן או לקטין המצומדים ל-Alexa Fluor 647 והדגירו למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בחשיכה. לאחר שתי שטיפות עם MOPS buffer, הוסיפו נוגדן המצומד ל-Alexa Fluor 555 נגד הסמן התת-תאי הרלוונטי והדגירו למשך 20 דקות. לאחר שתי שטיפות עם MOPS buffer, שטפו את התאים פעם אחת עם MOPS magnesium chloride. לאחר מכן, שאבו את המדיום והוסיפו 0.4 µM Cyt Green; הדגירו את התאים למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר בחשיכה, ושטפו את התאים פעמיים ב-MOPS magnesium chloride.לאחר מכן יש לשטוף את התאים. פעם נוספת ב-mops magnesium chloride למשך חמש דקות. הפוך את כיסויי הזכוכית (cover slips) עם הפנים כלפי מטה על גבי שלשליות זכוכית, אטום בעזרת לק שקוף, וקנה תמונות של השלשליות בתוך 30 דקות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה.בניסוי זה, נויטרופילים אנושיים הוחדרו בחיידקי גונוריאה. לקטין מסויה המשוייך ל-Alexa Fluor 647 מזהה גונוריאה חוץ-תאית. לאחר מכן, נוספו צבע חיוניות פלואורסצנטי ירוק ופרופידיום יודיד פלואורסצנטי אדום בנוכחות ספונין, אשר קושר כולסטרול כדי להחדיר צבעים באופן מועדף דרך ממברנות הפלזמה של תאי המאכסן, אך אינו חודר את ממברנת הגונוריאה בתאים מזוהמים; גרעין התא העקרי נצבע הן ב-cyto nine והן בפרופידיום יודיד.תמונות אלו של נויטרופילים שנדבקו בגונוריאה הופקו באמצעות צבעי הבדיקה של חיוניות cyt talk screen ו-dpi. צבע ה-propidium iodide לא היה בשימוש מכיוון שהוא פולט פלואורסצנציה הן בערוץ האדום והן בערוץ העל-סגול במיקרוסקופ הפלואורסצנציה. כל חיידשי הגונוריאה נצבעים ב-dpi, אך רק חיידקים עם ממברנות פגומות נצבעים ב-ox green.החיידק התוך-תאי שאינו חיוני מראה טבעת צביעה של CD 63 המקיפה את החיידק. טבעת זו מעידה על כך שגרנולות ראשוניות מועשרות בפגוזום זה. החיידק התוך-תאי החיוני חסר צביעה של CD 63, מה שמעיד על כך שגרנולות ראשוניות אינן מועשרות בפגוזום שלו.יחד, הנתונים מראים מתאם בין החיוניות של הגונוקוקים לבין שהותם בפגוזום שלילי לגבי גרנולות ראשוניות. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להעריך את חיוניותם של חיידקים בתאי מאכסן. בנוסף, תוכלו לקבוע את חיוניותם של חיידקים הממוקמים במדורים שונים בתאי המאכסן באמצעות שימוש בנוגדנים המכוונים למדורים תת-תאיים אלו.

fluorescence-microscopy-methods-for-determining-viability-bacteria

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

אנו מתארים גישה חלופית כדי ספירה של...

Assay פונקציונלית הדם כולו כדי למדוד את הכדאיות של mycobacteria, באמצעות הכתב-Gene Tagged BCG או מ Tb (BCG לוקס / מ Tb לוקס)

Visualizing חיידקים בנמטודות באמצעות מיקרוסקופיה פלורסנט

Source: Calatayud Arroyo, M., et al. Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface. J. Vis. Exp. (2018)The video demonstrates a method to evaluate the viability of anaerobic oral bacteria using fluorescent dyes and flow cytometry. It begins with culturing bacteria in oxygen-free broth, followed by resuspending a single colony from a blood agar plate. After incubation and dilution, the culture is stained with membrane-permeable and...

Fluorescence-Based Viability Assessment of Oral Anaerobic Bacteria

מתוארת שיטה מבוססת חלבון פלואורסצנטי של תאים חיים להארת ואקואולים תאיים (תכלילים) המכילים כלמידיה. אסטרטגיה זו מאפשרת קביעה מהירה ואוטומטית של זיהום כלמידיה בדגימות וניתן להשתמש בה כדי לחקור כמותית את דינמיקת הצמיחה של הכללה.

שימוש בחלבוני ניאון כדי לחזות ולכמת<em&gt; כלמידיה</em&gt; חלולית דינמיקת צמיחה בתאים חיים

מחקרים של ביומולקולות in vivo חיוניים להבנת תפקוד מולקולרי בהקשר ביולוגי. כאן אנו מתארים שיטה חדשה המאפשרת הפנמה של ביומולקולות פלואורסצנטיות, כגון DNA או חלבונים, למיקרואורגניזמים חיים. ניתוח נתונים in vivo שנרשמו על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מוצג ונדון גם כן.

הפנמה והתבוננות של פלורסנט מולקולות ביולוגיים במיקרואורגניזמים שחיים דרך Electroporation

מאמר זה מציג שני פרוטוקולים: האחד למדידת חיידקים אנאירוביים שיכולים לפלוש ולשרוד בהצלחה בתוך המארח, והשני לדמיין חיידקים אנאירוביים מקיימים אינטראקציה עם תאים מארחים. ניתן ליישם מחקר זה על כל אנאירובי הניתן לעיבוד וכל סוג תא אוקריוטי.

gingivalis Porphyromonas כאורגניזם מודל להערכת אינטראקציה של חיידקים אנאירוביים עם תאי מארח

שיטה מתוארת כאן לקביעת אסוציאציה ותחרות בין-ממלכה (חיידקים ופטריות) על היצמדות לחד-שכבות של תאי HeLa נגועים בנגיף. ניתן להרחיב פרוטוקול זה למספר שילובים של פרוקריוטים, איקריוטים ווירוסים.

קביעת Biofilm ייזום על תאים נגועים בנגיף על ידי חיידקים ופטריות

הבנת תפקידה של תהליכים חיוניים של חיידקים הוא מאתגר. קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ עם צבעי במטרה יכול לספק תובנות מפתח לתוך התא מיקרוביאלי התקדמות וצמיחה של מחזור התא. כאן, Agrobacterium tumefaciens משמש חיידק דגם כדי לסמן שיטות הדמיה תא חי פלואורסנציה לאפיון תהליכים חיוניים.

חיים התא מיקרוסקופ פלורסצנטיות לבחון תהליכים חיוניים במהלך צמיחת תאים מיקרוביאלי

מאמר זה מספק מדריך צעד אחר צעד כדי לחקור את הדינמיקה לוקליזציה של חלבון subcellular ולנטר שינויים מורפולוגיים באמצעות מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית ברזולוציה גבוהה ב subtilis מקרתגו ו סטיילוולוקוקוס.

מיקרוסקופ הקרינה הפלואורסצנטית החיה כדי לחקור את הלוקליזציה של חלבון Subcellular ושינויי מורפולוגיה של תאים בחיידקים

פרוטוקול הדמיה זה של תאים חיידקיים חיים מאפשר הדמיה של אינטראקציות בין מינים חיידקיים מרובים ברמת תא יחיד לאורך זמן. הדמיה של זמן-לשגות מאפשרת להתבוננות של כל מין חיידקי במונוקולטורה או coculture לחקור אינטראקציות בין מינים בקהילות חיידקים מרובי מינים, כולל תנוענות תאים בודדים וכדאיות.

הדמיה קינטית של אינטראקציות חיידקים בין-מינים חד-תאיים

כתב יד זה מתאר שיטה לשימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית חד-תאית כדי לדמיין ולתמת תחרות חיידקים בקוקולטורה.

כימות של תחרות בין-בקטריאלית באמצעות הדמיית פלואורסצנטיות חד-תאית

למדו שיטת מיקרוסקופיית פלואורסצנציה לבדיקת הכדאיות של חיידקים בודדים בתאי יונקים. השיטה מאפשרת זיהוי ישיר של חיידקים חיים ומתים במיקומים תוך-תאיים שונים.

שיטות מיקרוסקופית הקרינה לקביעת הכדאיות של חיידקים באיגוד עם תאי יונקים

גלה סרטונים נוספים