Visualizing חיידקים בנמטודות באמצעות מיקרוסקופיה פלורסנט

המטרה הכללית של הליך זה היא לצפות בסימביוזה בקטריאלית המסומנת פלואורסצנטית בתוך הנמטודה המארחת. דבר זה מושג תחילה על ידי סימון הבקטריות בחלבון פלואורסצנטי באמצעות קונג'וגציה. השלב השני הוא בידוד נמטודות AIC על ידי איסוף ביצים.

בשלב הבא, נמטודות AIC גודלות בשילוב עם הסימביונט החיידקי המסומן פלואורסצנטית שלהן, כדי לאפשר התאגשות טבעית ובסופו של דבר לוקליזציה של הסימביונט החיידקי בתוך הנמטודה המארחת. ניתן לקבוע את תדירות התאגשות זו בתוך אוכלוסיית הנמטודות באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הסימביוזה, כגון היכן החיידקים ממוקמים בתוך המארח שלהם, ומהי התפלגות הנשיאה החיידקית בקרב אוכלוסיית מארחים?

לאחר גידול בן לילה של זני החיידקים, בצעו תת-תרבית של זני התורם, המקבל והעזר לתוך מצע גידול עשיר בחומרי הזנה ללא אנטיביוטיקה ביחס של 1 ל-100 של תרבית למצע, ולאחר מכן גדלו את התרביות בטמפרטורה המתאימה לכל זן עד להגעה לשלב צמיחת log אמצעי. לאחר מכן, שלבו את הזנים במבחנה אחת למיקרו-צנטריפוגה וסובבו את התרביות המעורבבות במשך שתי דקות ב-17,900 Gs, שפכו את הנוזל העליון ותלו את המשקע ב-30 µL של מצע טרי. לאחר מכן, טפטפו את התרחיף על צלחת מצע עשירה בחומרי הזנה ללא אנטיביוטיקה, והמתינו לייבוש הנקודה עד שהתרחיף יתייבש.

דגרו את הפלטה במצב הפוך למשך לילה בטמפרטורה אופטימלית עבור החיידק המקבל ומותרת עבור התורם והעזר, במידת הצורך. כעת, גרדו את הנקודה ובצעו מריחה להשגת מושבות בודדות על פלטת אנטיביוטיקה סלקטיבית כדי לקבל תרבית טהורה של חיידקים; בצעו מריחה של מושבה בודדת לצורך בידוד. לבסוף, ודאו שהמושבות שהתקבלו הן הסימביאנט המקבל ולא זן התורם.

באמצעות סריקה לאיתור פנוטיפים ספציפיים למקבל. לדוגמה, ניתן להבחין בין חיידקי cino abdi לבין e coli על ידי ביצוע מבחן קטלאז. סריקה לאיתור הפלסמיד תבוצע על ידי אישור פלואורסצנציה תחת אורך הגל המתאים לחלבון הפלסמידי הפלואורסצנטי. לאחר גידול של הסימביונט הבקטריאלי הטבעי במהלך הלילה, פזרו 600 µL של תרבית הבקטריה על 8 עד 10 צלחות אגר לליפידים בקוטר 10 מילימטר, ולאחר מכן דגרו את הצלחות בחושך, ללא לחות, בטמפרטורה של 25 °C.

לאחר יומיים, הוסיפו 5,000 נמטודות בשלב הזחילה הזיהומי ב-500 microliters של מצע למשטחי החיידקים. לאחר דגירה של הצלחות בטמפרטורה של 25 degrees Celsius למשך שלושה ימים נוספים, הניחו 20 microliters של מים על זכוכית כיסוי למיקרוסקופ. לאחר מכן, השתמשו במקל סטרילי כדי לגרד כמות קטנה של נמטודות ממשטח החיידקים.

הניחו את המקל בתוך המים כדי לאפשר לנמטודות לשחות החוצה. התבוננו בפסיה זו תחת הגדלה נמוכה. אם נראים ביצים ונקבות, המשיכו כאשר הנקבות מכילות ביצים, העבירו מספר מיליליטרים של מים לפני השטח של הצלחות, סובבו את הצלחות בעדינות ולאחר מכן שפכו את המים לשפופרת קונית של 50 מיליליטר.

על הנמטודות לרדת מהצלחות ולא להיות נראות יותר על פני השטח שלהן. יש להמתין עד שהנמטודות ישקעו לתחתית המבחנה, ולאחר מכן לשאוב בעזרת פיפט את עודפי המים מחלקו העליון של המבחנה ולמלא אותה שוב במים נקיים. לאחר המתנה לשקיעת הנמטודות הבוגרות ושאיבה נוספת של עודפי המים, יש למלא את המבחנות הקוניות בתמיסת ביצים.

לאחר מכן, ערבבו את המבחנות על ידי היפוך עדין למשך 10 דקות בדיוק בטמפרטורת החדר. מיד לאחר הנעירה, צנטריפוגו את המבחנות הקוניות למשך 10 דקות בדיוק ב-1,250 Gs ובטמפרטורת החדר, כאשר הבלם (break) מופעל. לאחר מכן, שפכו במהירות את הנוזל העליון (supernatant), השביו את המשקע (pellet) בתמיסת ביצים באמצעות פיפוט, ומלאו את המבחנה הקונית בתמיסת ביצים טרייה.

ערבבו היטב את תרחיף הביצים על ידי הפיכת המבחנה שלוש עד חמש פעמים, ולאחר מכן השקיעו מיד את הביצים בצנטריפוגה ושפכו את העלייה, כפי שהודגם כעת. השעיכו מחדש את המשקע ב-misogyny broth או ב-LB באמצעות פיפוט, ולאחר מכן העבירו את תרחיף הביצים למבחנה קונית של 15 מיליליטר. כעת מלאו את המבחנה של 15 מיליליטר ב-LB, שטפו את הביצים שלוש פעמים במצע בעזרת אותה טכניקה מהירה שהודגמה כעת, ולאחר מכן דללו את ביצי ה-P nematode שהושעו מחדש לפחות ל-10 ביצים ל-µL.

העבירו את הביצים לצלחת פטרי בקוטר שישה סנטימטרים המכילה 5 mL של LB ואנטיביוטיקה נגד חיידקים קולוניזטורים. ניתן לשמור את הצלחת עטופה בניילון נצמד למשך עד ארבעה ימים לאחר גידול לילה וברירה של החיידקים הפלואורסצנטיים. השתמשו במקל סטרילי כדי לפרוס 600 µL של תרבית החיידקים על גבי דיסקיות ליפיד של 10 מ"מ, והדגירו את התרבית בטמפרטורה של 25 °C.

לאחר יומיים, פזרו בין 500 ל-5,000 ביצי נמטודות על כל פלטת ליפיד. אם הפלטה אוחסנה, שטפו את הביצים ב-15 milliliters של LB, כפי שהודגם זה עתה, לפחות פעם אחת לפניe הזרקת הביצים אל מעל שטיחי החיידקים שהוכנו מראש. לאחר מכן, הדגירו את תרביות השיתוף של הנמטודות והחיידקים בחושך ללא לחות בטמפרטורה של 25 degrees Celsius, עד להופעת צעירים זיהומיים (infective juveniles) כטבעת לבנה וסמיכה בשולי הפלטה.

לאחר שנצפו הילבנים המדבקים (infective juveniles), הסיר את המכסה של צלחת האגר השומני והנח את תחתית הצלחת בתוך תחתיתה של צלחת פטרי ריקה בגודל 100 מילימטר על 20 מילימטר. לאחר מכן, מלא את צלחת הפטרי בכמות מים שתגיע לכ-מחצית מגובה הצלחת הקטנה, והדגר את מלכוד המים עד אשר ילבני הדבקה צאצאים יצאו אל המים.

לאחר איסוף הנמטודות מהמים או בשלב החיים הרצוי ממצע החיידקים המתאים, המיסו מספר גרגירים של ole ב-30 µL של מים, והוסיפו 1 עד 2 µL מסוכן השיתוק הזה לכל 50 µL של דגימה של נמטודות. לאחר מכן, העבירו כ-20 עד 30 µL מדגימת הנמטודות המשותקות לזכוכית כיסוי והניחו לוחית כיסוי מעל הדגימה. בחנו את הנמטודות באמצעות מיקרוסקופ אור כדי לוודא שהן נמצאות בשדה הראייה.

כדי לזהות את מיקום החיידקים, צלם את הנמטודות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי בנוסף להגדרות המיקרוסקופ האור, ולאחר מכן חלפם את התמונות אחת על השנייה. ייתכן שיהיה צורך לנסות מספר הגדלות וזוויות ראייה של הנמטודה כדי למצוא את החיידקים.

אוכלוסייה של נמטודות משני מצעים נספרה ונבדקה לצורך הערכת הקולוניזציה על ידי הסימביונט הבקטריאלי. לצורך סטטיסטיקה מהימנה, מומלץ לספור לפחות 100 נמטודות לדגימה, כאשר לפחות 30 מהן נכללות בכל קטגוריה, כפי שמוצג בטבלה. נמטודות אלו מאוכלסות ברמה של כ-14.6% כאשר הן גדלות על אגר ליפיד, ו-68.6% כאשר הן גדלות על אגר כבד וכליה.

הוכח כי למינים אחרים של נמטודות וחיידקים יש רמות התנחלות שונות. תרשים זה ממחיש את המראה הכללי של נקבי Steiner NEMA. התמונה המוכנסת מציגה תמונת ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית (DIC) של נקבת S fot בהגדלה של 20x.

החץ השחור בתמונה המוגדלת מצביע על הוולבה (vulva), בעוד שהחצים הלבנים מצביעים על ביצים גלויות. תמונה זו מראה ביצה מפותחת אך לא בבקעה של נמטודה מסוג volt בהגדלה של 40x, וביצים אלו, שהופרדו מנמטודות s Volta, צולמו תחת הגדלה של 10x. כאן מוצגות תמונות מיקרוסקופיות מייצגות של נמטודות Steiner Nima הקשורות לחיידקי Xeno aptus בתמונה הראשונה זו.

הנמטודות של Alvin הוצמדו לסמביונט החיידקי שלהן המבטא GFP כדי ליצור תמונה מורכבת זו. תמונת ניגודיות שלבים (phase contrast) הונחה על גבי תמונה פלואורסצנטית. החץ מצביע על החיידקים הנוכחים בתוך הנמטודה השבבית הזוהרת (infective juvenile nematode).

תמונה זו מראה נמטודה צעירה מהמין S carpa capsi עם X nla המבטא GFP. התמונה הוכנה באופן דומה לתמונה הקודמת והיא מציגה את הנמטודה הצעירה עם חיידקים המסומנים בחלבון פלואורסצנטי ירוק, הנראים כמו מוטות ירוקים הממוקמים לאורך חלל המעי של הנמטודה. בנוסף להליך המתואר, ניתן לשלב שיטות אחרות, כגון מניפולציה גנטית של הסימביונט החיידקי לפני ההתחברות למארח הנמטודה, כדי לענות על שאלות נוספות, כגון מהם המנגנונים המולקולריים הדרושים להתחברות בין המארח למיקרוביום.