Name: Visualizing חיידקים בנמטודות באמצעות מיקרוסקופיה פלורסנט (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: למד הדמיית חיידקים פלורסצנטיים בנמטודות באמצעות מיקרוסקופיה פלורסנטית. שיטה זו מאפשרת לחקור את היחסים הסימביוטיים בין Xenorhabdus לבין מארחיהן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות לאוג&#39;ניו Vivas, הקורט Heungens, אריק מרטינס, צ&#39;ארלס קאולס, דארבי סוכר, אריק Stabb, וטוד Ciche על תרומתם לפיתוח של פרוטוקול זה וכלים בשימוש. KEM וJMC נתמכו על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) בפרס לאומי לחקר שרותים T32 (AI55397 &quot;חיידקי מחלה ובריאות&quot;). המרכז למוסיקת ירושלים נתמך על ידי מלגת מחקר למוסמכי קרן לאומית למדע (NSF). עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהקרן הלאומי למדע (IOS-0920631 וIOS-0950873).

<ol><li>Holterman, M., van der Wurff, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylum-wide+analysis+of+SSU+rDNA+reveals+deep+phylogenetic+relationships+among+nematodes+and+accelerated+evolution+toward+crown+clades%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Evol%22%5BJournal%5D)">Phylum-wide analysis of SSU rDNA reveals deep phylogenetic relationships among nematodes and accelerated evolution toward crown clades.</a> Mol. Biol. Evol. 23, 1792-1800 (2006).</li>
<li>Lambshead, P. J. D., Boucher, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marine+nematode+deep-sea+biodiversity+-+hyperdiverse+or+hype%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biogeogr%22%5BJournal%5D)">Marine nematode deep-sea biodiversity - hyperdiverse or hype.</a> J. Biogeogr. 30, 475-485 (2003).</li>
<li>Poinar, G. O. J., Thomas, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance+of+Achromobacter+nematophilus+Poinar+and+Thomas+%28Achromobacteraceae%3A+Eubacteriales%29+in+the+development+of+the+nematode%2C+DD-136+%28Neoaplectana+sp.+Steinernematidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol%22%5BJournal%5D)">Significance of Achromobacter nematophilus Poinar and Thomas (Achromobacteraceae: Eubacteriales) in the development of the nematode, DD-136 (Neoaplectana sp. Steinernematidae).</a> Parasitol. 56, 385-390 (1966).</li>
<li>Herbert, E. E., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Friend+and+foe%3A+the+two+faces+of+Xenorhabdus+nematophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Friend and foe: the two faces of Xenorhabdus nematophila.</a> Nat. Rev. Microbiol. 5, 634-646 (2007).</li>
<li>Kaya, H. K., Gaugler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entomopathogenic+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Entomopathogenic nematodes.</a> Annu. Rev. Entomol. 38, 181-206 (1993).</li>
<li>Bird, A. F., Akhurst, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nature+of+the+intestinal+vesicle+in+nematodes+of+the+family+Steinernematidae%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">The nature of the intestinal vesicle in nematodes of the family Steinernematidae.</a> Int. J. Parasitol. 13, 599-606 (1983).</li>
<li>Martens, E. C., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Steinernema+carpocapsae+intestinal+vesicle+contains+a+subcellular+structure+with+which+Xenorhabdus+nematophila+associates+during+colonization+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The Steinernema carpocapsae intestinal vesicle contains a subcellular structure with which Xenorhabdus nematophila associates during colonization initiation.</a> Cell. Microbiol. 7, 1723-1735 (2005).</li>
<li>Snyder, H. A., Stock, S. P., Kim, S. K., Flores-Lara, Y., Forst, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+colonization+and+release+process+of+Xenorhabdus+nematophila+and+the+morphology+and+ultrastructure+of+the+bacterial+receptacle+of+its+nematode+host%2C+Steinernema+carpocapsae%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">New insights into the colonization and release process of Xenorhabdus nematophila and the morphology and ultrastructure of the bacterial receptacle of its nematode host, Steinernema carpocapsae.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73, 5338-5346 (2007).</li>
<li>Abebe, E., Abebe-Akele, F., Morrison, J., Cooper, V., Thomas, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+insect+pathogenic+symbiosis+between+a+Caenorhabditis+and+Serratia%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">An insect pathogenic symbiosis between a Caenorhabditis and Serratia.</a> Virulence. 2, 158-161 (2011).</li>
<li>Abebe, E., Jumba, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+entomopathogenic+Caenorhabditis+briggsae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">An entomopathogenic Caenorhabditis briggsae.</a> J. Exp. Biol. 213, 3223-3229 (2010).</li>
<li>Torres-Barragan, A., Suazo, A., Buhler, W. G., Cardoza, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+entomopathogenicity+and+bacterial+associates+of+the+nematode+Oscheius+carolinensis%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Control%22%5BJournal%5D)">Studies on the entomopathogenicity and bacterial associates of the nematode Oscheius carolinensis.</a> Biol. Control. 59, 123-129 (2011).</li>
<li>Ye, W. M., Torres-Barragan, A., Cardoza, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oscheius+carolinensis+n.+sp+%28Nematoda%3A+Rhabditidae%29%2C+a+potential+entomopathogenic+nematode+from+vermicompost%5BTitle%5D)+AND+%22Nematology%22%5BJournal%5D)">Oscheius carolinensis n. sp (Nematoda: Rhabditidae), a potential entomopathogenic nematode from vermicompost.</a> Nematology. 12, 121-135 (2010).</li>
<li>Zhang, C., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterorhabditidoides+chongmingensis+gen.+nov.%2C+sp.+nov.+%28Rhabditida%3A+Rhabditidae%29%2C+a+novel+member+of+the+entomopathogenic+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invertebr.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Heterorhabditidoides chongmingensis gen. nov., sp. nov. (Rhabditida: Rhabditidae), a novel member of the entomopathogenic nematodes.</a> J. Invertebr. Pathol. 98, 153-168 (2008).</li>
<li>Martens, E. C., Heungens, K., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+colonization+events+in+the+mutualistic+association+between+Steinernema+carpocapsae+nematodes+and+Xenorhabdus+nematophila+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Early colonization events in the mutualistic association between Steinernema carpocapsae nematodes and Xenorhabdus nematophila bacteria.</a> J. Bacteriol. 185, 3147-3154 (2003).</li>
<li>Ciche, T. A., Ensign, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((For+the+insect+pathogen%2C+Photorhabdus+luminescens%2C+which+end+of+a+nematode+is+out%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">For the insect pathogen, Photorhabdus luminescens, which end of a nematode is out.</a> Appl. Environ. Microbiol. 69, 1890-1897 (2003).</li>
<li>Ciche, T. A., Kim, K. S., Kaufmann-Daszczuk, B., Nguyen, K. C., Hall, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+invasion+and+matricide+during+Photorhabdus+luminescens+transmission+by+Heterorhabditis+bacteriophora+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cell invasion and matricide during Photorhabdus luminescens transmission by Heterorhabditis bacteriophora nematodes.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74, 2275-2287 (2008).</li>
<li>Easom, C. A., Joyce, S. A., Clarke, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+genes+involved+in+the+mutualistic+colonization+of+the+nematode+Heterorhabditis+bacteriophora+by+the+bacterium+Photorhabdus+luminescens%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of genes involved in the mutualistic colonization of the nematode Heterorhabditis bacteriophora by the bacterium Photorhabdus luminescens.</a> BMC Microbiol. 10, 45(2010).</li>
<li>Somvanshi, V. S., Kaufmann-Daszczuk, B., Kim, K. S., Mallon, S., Ciche, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photorhabdus+phase+variants+express+a+novel+fimbrial+locus%2C+mad%2C+essential+for+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Photorhabdus phase variants express a novel fimbrial locus, mad, essential for symbiosis.</a> Mol. Microbiol. 77, 1021-1038 (2010).</li>
<li>Martens, E. C., Russell, F. M., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Xenorhabdus+nematophila+metabolic+mutants+yields+insight+into+stages+of+Steinernema+carpocapsae+nematode+intestinal+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Analysis of Xenorhabdus nematophila metabolic mutants yields insight into stages of Steinernema carpocapsae nematode intestinal colonization.</a> Mol. Microbiol. 51, 28-45 (2005).</li>
<li>Sugar, D. R., Murfin, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+variation+and+host+interactions+of+Xenorhabdus+bovienii+SS-2004%2C+the+entomopathogenic+symbiont+of+Steinernema+jollieti+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Env.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Phenotypic variation and host interactions of Xenorhabdus bovienii SS-2004, the entomopathogenic symbiont of Steinernema jollieti nematodes.</a> Env. Microbiol. 14, 924-939 (2012).</li>
<li>Cowles, C. E., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Xenorhabdus+nematophila+nilABC+genes+confer+the+ability+of+Xenorhabdus+spp.+to+colonize+Steinernema+carpocapsae+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The Xenorhabdus nematophila nilABC genes confer the ability of Xenorhabdus spp. to colonize Steinernema carpocapsae nematodes.</a> J. Bacteriol. 190, 4121-4128 (2008).</li>
<li>Heungens, K., Cowles, C. E., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Xenorhabdus+nematophila+genes+required+for+mutualistic+colonization+of+Steinernema+carpocapsae+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of Xenorhabdus nematophila genes required for mutualistic colonization of Steinernema carpocapsae nematodes.</a> Mol. Microbiol. 45, 1337-1353 (2002).</li>
<li>Goetsch, M., Owen, H., Goldman, B., Forst, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+PixA+inclusion+body+protein+of+Xenorhabdus+nematophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the PixA inclusion body protein of Xenorhabdus nematophila.</a> J. Bacteriol. 188, 2706-2710 (2006).</li>
<li>Bhasin, A., Chaston, J. M., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+Analyses+Reveal+Overall+Topology+and+Functional+Regions+of+NilB%2C+a+Bacterial+Outer+Membrane+Protein+Required+for+Host+Association+in+a+Model+of+Animal-Microbe+Mutualism%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Mutational Analyses Reveal Overall Topology and Functional Regions of NilB, a Bacterial Outer Membrane Protein Required for Host Association in a Model of Animal-Microbe Mutualism.</a> J. Bacteriol. 194, 1763-1776 (2012).</li>
<li>Ciche, T. A., Goffredi, S. K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCiche%2C+TA+%22Methods+in+General+and+Molecular+Microbiology%22">Methods in General and Molecular Microbiology</a>. Reddy, C. A. , ASM Press. 394-419 (2007).</li>
<li>Goodrich-Blair, H., Clarke, D., Grewal, P. S., Ciche, T. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGoodrich-Blair%2C+H+%22Insect+Pathogens%2C+Molecular+Approaches+and+Techniques%22">Insect Pathogens, Molecular Approaches and Techniques</a>. Stock, S. P., Boemare, N., Vandenberg, J., Glazar, I. , CABI Publishing. 239-269 (2009).</li>
<li>Stock, S. P., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStock%2C+SP+%22Manual+of+Techniques+in+Invertebrate+Pathology%22">Manual of Techniques in Invertebrate Pathology</a>. Lacey, L. A. , Elsevier Press. 375-425 (2012).</li>
<li>Martens, E. C., Gawronski-Salerno, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenorhabdus+nematophila+requires+an+intact+iscRSUA-hscBA-fdx+locus+to+colonize+Steinernema+carpocapsae+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Xenorhabdus nematophila requires an intact iscRSUA-hscBA-fdx locus to colonize Steinernema carpocapsae nematodes.</a> J. Bacteriol. 185, 3678-3682 (2003).</li>
<li>Vivas, E. I., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenorhabdus+nematophilus+as+a+model+for+host-bacterium+interactions%3A+rpoS+is+necessary+for+mutualism+with+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Xenorhabdus nematophilus as a model for host-bacterium interactions: rpoS is necessary for mutualism with nematodes.</a> J. Bacteriol. 183, 4687-4693 (2001).</li>
<li>White, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+obtaining+infective+nematode+larvae+from+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A method for obtaining infective nematode larvae from cultures.</a> Science. 66, 302-303 (1927).</li>
<li>Ciche, T. A., Ensign, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((For+the+insect+pathogen+Photorhabdus+luminescens%2C+which+end+of+a+nematode+is+out%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">For the insect pathogen Photorhabdus luminescens, which end of a nematode is out.</a> Appl. Environ. Microbiol. 69, 1890-1897 (2003).</li>
<li>Sicard, M., Brun, N. L. e <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+native+Xenorhabdus+on+the+fitness+of+their+Steinernema+hosts%3A+contrasting+types+of+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol.+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of native Xenorhabdus on the fitness of their Steinernema hosts: contrasting types of interaction.</a> Parasitol. Res. 91, 520-524 (2003).</li>
<li>Lambertsen, L., Sternberg, C., Molin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mini-Tn7+transposons+for+site-specific+tagging+of+bacteria+with+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mini-Tn7 transposons for site-specific tagging of bacteria with fluorescent proteins.</a> Environ. Microbiol. 6, 726-732 (2004).</li>
<li>Miller, W. G., Leveau, J. H., Lindow, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+gfp+and+inaZ+broad-host-range+promoter-probe+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant+Microbe+Int%22%5BJournal%5D)">Improved gfp and inaZ broad-host-range promoter-probe vectors.</a> Mol. Plant Microbe Int. 13, 1243-1250 (2000).</li>
<li>Teal, T. K., Lies, D. P., Wold, B. J., Newman, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiometabolic+stratification+of+Shewanella+oneidensis+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Spatiometabolic stratification of Shewanella oneidensis biofilms.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72, 7324-7330 (2006).</li>
<li>Bao, Y., Lies, D. P., Fu, H., Roberts, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+Tn7-based+system+for+the+single-copy+insertion+of+cloned+genes+into+chromosomes+of+Gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">An improved Tn7-based system for the single-copy insertion of cloned genes into chromosomes of Gram-negative bacteria.</a> Gene. 109, 167-168 (1991).</li>
<li>Woodring, J. L., Kaya, H. K. Steinernematid and Heterorhabditid Nematodes: A Handbook of Biology and Techniques. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWoodring%2C+JL+%22Southern+Cooperative+Series+Bulletin+331%22">Southern Cooperative Series Bulletin 331</a>. , Arkansas Agricultural Experiment Station. (1988).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

הפרוטוקול המתואר כאן מספק שיטה לזיהוי האופטי של חיידקים בתוך מארח נמטודות (איור 1). שיטה זו מנצלת את השקיפות האופטית של נמטודות ויכולת fluorescently חיידקי תווית, מה שמאפשר בניתוח vivo של חיידקים בתוך פונדקאי נמטודות (איור 3). באופן ספציפי, גישה זו מזהה לוקליזציה חיידקים בתוך המארח שלו. על ידי ספירת אוכלוסיית נמטודות וניקוד לנוכחות חיידקים, התדירות של התישבות חיידקים על פני אוכלוסיית נמטודות ניתן לקבוע (טבלה 1). שיטה זו ה...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> אגר שומנים (עקר) </td><td></td><td></td><td> 8 גרם מרק מזין, 15 אגר גרם, שמרי תמצית 5 גרם, מים 890 מ&quot;ל, 10 מ&quot;ל 0.2 גר &#39;/ המ&quot;ל MgCl 2. 6H 2 0, * 96 מ&quot;ל סירופ תירס פתרון, 4 מיליליטר שמן תירס * מערבב תקשורת בעת שמזגה צלחות * להוסיף מרכיב עקר אחרי מעוקר </td></tr><tr><td> פתרון סירופ תירס (עקר) </td><td></td><td></td><td> סירופ תירס 7 מ&quot;ל, 89 מיליליטר מים תמהיל וחיטוי </td></tr><tr><td> פתרון ביצה </td><td></td><td></td><td> 16.6 מ&quot;ל 12% hypochlorite נתרן, 5 המ&quot;ל KOH 5M, מי 80 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> Lysogeny מרק (עקר) </td><td></td><td></td><td> 5 גרם תמצית שמרים, 10 גרם tryptone, 5 גרם מלח, 1 ליטר מים תמהיל וחיטוי </td></tr><tr><td> Microfuge </td><td> דיג </td><td> 13-100-675 </td><td> כל microfuge שמחזיק צינורות microfuge יעבוד </td></tr><tr><td> סרכזת </td><td> Beckman </td><td> 366802 </td><td> צנטריפוגה בראש הטבלה הגדולה שמחזיקה 15 מ&quot;ל ו 50 צינורות חרוטי מ&quot;ל </td></tr><tr><td> סטרילי 60 מ&quot;מ X 15 מ&quot;מ צלחת פטרי </td><td> דיג </td><td> 0875713 </td><td></td></tr><tr><td> 50 צינורות צנטריפוגות מ&quot;ל </td><td> דיג </td><td> 05-539-6 </td><td></td></tr><tr><td> 15 צינורות צנטריפוגות מ&quot;ל </td><td> דיג </td><td> 05-531-6 </td><td></td></tr><tr><td> 100 מ&quot;מ X 20 מ&quot;מ צלחת פטרי סטרילית </td><td> דיג </td><td> 0875711Z </td><td> עמוק יותר מצלחות פטרי הרגילות </td></tr><tr><td> צלחת 24 היטב </td><td> גריינר ביו אחד &lt;/ Td&gt; <td> 662000-06 </td><td></td></tr><tr><td> מיקרוסקופ </td><td></td><td></td><td> מיקרוסקופ צריך יכולות ניאון תואמות fluorophore </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים </td><td> 15710 </td><td></td></tr><tr><td> PBS (עקר) </td><td></td><td></td><td> 8 גרם NaCl 0.2 גרם KCL 1.44 גרם Na 2 HPO 4 0.24 גרם KH 2 PO 4 1 ליטר מים התאם לpH של 7.4 ליטר ומים עד 1 וחיטוי </td></tr><tr><td> צינורות Microfuge </td><td> דיג </td><td> 05-408-138 </td><td> 2 מ&quot;ל או 1.5 מ&quot;ל צינורות </td></tr><tr><td> מטרף </td><td></td><td></td><td> כל מביא שגורם לנוזל בעדינות להעביר יעבוד </td></tr><tr><td> חומצת Diaminopimelic </td><td> סיגמא </td><td&gt; D-1377 </td><td> במידת צורך, להוסיף מדיה לריכוז או 1 mM </td></tr></tbody></table>

visualizing חיידקים בנמטודות באמצעות מיקרוסקופיה פלורסנט

Visualizing Bacteria in Nematodes using Fluorescent Microscopy

Symbioses, החיים משותפים של שניים או יותר אורגניזמים, הם נפוצים לאורך כל ממלכות חיים. כשתיים מכל מקום אורגניזמים ביותר על פני אדמה, נמטודות וחיידקים יוצרים מגוון רחב של עמותות סימביוטיים שנע בין מועיל לפתוגניים 1-3. עמותה אחת כזו היא מערכת היחסים הדדיים המועילה בין חיידקי Xenorhabdus ונמטודות Steinernema, שהתפתחה כמערכת מודל של סימביוזה 4. נמטודות Steinernema היא entomopathogenic, באמצעות חיידקי סימביונט להרוג חרקים 5. להעברה בין מארחי חרקים, החיידקים להתנחל המעי של שלב נעורי התולעת של נמטודות 6-8. לאחרונה, כמה מינים נמטודות אחרים הוכחו לנצל חיידקים להדברת חרקים 9-13, וחקירות שהחלו לבחון את יחסי הגומלין בין נמטודות והחיידקים במערכות אלה &lt;sup&gt; 9. אנו מתארים שיטה להדמיה של סימביונט חיידקים בתוך או על מארח נמטודות, מנצלים את השקיפות האופטית של נמטודות כאשר נצפו על ידי מיקרוסקופ. את החיידקים שהונדסו חלבון פלואורסצנטי, המאפשר ההדמיה שלהם על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. פלסמידים רבים זמינים שנושאים גני מקודדי חלבונים כי לזרוח באורכי גל שונים (כלומר ירוק או אדום), וצמיד של פלסמידים מזן חיידקי Escherichia תורם לסימביונט חיידקי נמען היא מוצלחת למגוון רחב של חיידקים. בשיטות המתוארות פותחו כדי לחקור את הקשר בין Steinernema carpocapsae וXenorhabdus nematophila 14. שיטות דומות שמשו כדי לחקור עמותות אחרות נמטודות-חיידק 9, 15-18 והגישה לכן היא באופן כללי. נפגשהוד מאפשר אפיון של נוכחות ולוקליזציה חיידקים בתוך נמטודות בשלבים שונים של פיתוח, לספק תובנה על טבעה של העמותה והתהליך של קולוניזציה 14, 16, 19. ניתוח מיקרוסקופי מגלה שכיחות הקולוניזציה בתוך אוכלוסייה ולוקליזציה של חיידקים לארח רקמות 14, 16, 19-21. זה יתרון על פני שיטות אחרות לניטור חיידקים בתוך אוכלוסיות נמטודות, כגון sonication 22 או טחינת 23, אשר יכול לספק רמות ממוצעות של התישבות, אבל לא יכול, למשל, להפלות אוכלוסיות עם שכיחות גבוהה של עומסי סימביונט נמוכים מאוכלוסיות עם תדירות נמוכה של עומסי סימביונט גבוהים. להפלות את התדירות והעומס של חיידקים מיישבים יכול להיות חשוב במיוחד כאשר הקרנה או אפיון מוטציות חיידקים לפנוטיפים קולוניזציה 21, 24. אכן, מיקרוסקופ פלואורסצנטי נעשה שימוש בהקרנת תפוקה גבוהה של מוטציות חיידקים לפגמים ב17 קולוניזציה, 18, ​​והוא פחות מייגע מאשר שיטות אחרות, כולל sonication 22, 25-27 ונתיחת פרט נמטודות 28, 29.

כדי ללמוד את ההדדיות בין<em&gt; Xenorhabdus</em&gt; חיידקים<em&gt; Steinernema</em&gt; נמטודות, שיטות פותחו כדי לפקח על נוכחות ומיקום בתוך נמטודות חיידקים. הגישה הניסויית, אשר יכול להיות מיושמת על מערכות אחרות, כרוכה בחיידקי הנדסה לבטא חלבון פלואורסצנטי הירוק והדמיה, באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי חיידקים בתוך נמטודות השקופה.

Visualizing חיידקים בנמטודות באמצעות מיקרוסקופיה פלורסנט

סימביוזות, חיים משותפים של שניים או יותר מאורגניזמים, נפוצות בכל ממלכות החיים. כשניים מהאורגניזמים הנפוצים ביותר ב...

המטרה הכללית של הליך זה היא לצפות בסימביוזה ביו-פלואורסצנטית של חיידקים בתוך הנמטודה המארחת שלהם. דבר זה מושג תחילה על ידי סימון החיידקים בחלבון פלואורסצנטי באמצעות קונז'וגציה. השלב השני הוא בידוד נמטודות AIC על ידי איסוף ביצים.בשלב הבא, נמטידות ה-AIC גדלות בשילוב עם הסימביונט החיידקי שלהן המסומן פלואורסצנטית, כדי לאפשר התאגשות טבעית ובסופו של דבר לוקליזציה של הסימביונט החיידקי בתוך הנמטידה המארחת. את שכיחות ההתאגשות הזו בקרב אוכלוסיית הנמטידות ניתן לקבוע באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הסימביוזה, כגון היכן ממוקמות החיידקים בתוך המארח שלהם, ומהי התפלגות הנשאות החיידקית בקרב אוכלוסיית מאוחדת?לאחר גידול בן לילה של זני החיידקים, בצעו תת-תרבית לזני התורם, המקבל והעזר בתוך מצע גידול עשיר בחומרים מזינים ללא אנטיביוטיקה, ביחס של 1 ל-100 של תרבית למצע, ולאחר מכן גדלו את התרביות בטמפרטורה המתאימה לכל זן עד להגעתם לשלב גידול לוגי בינוני. לאחר מכן, שילו את הזנים בתוך פרועת מיקרו-צנטריפוגה אחת וסבבו את התרביות המעורבבות במשך שתי דקות ב-17,900 Gs, שפכו את הנוזל העליון ותלו את המשקע ב-30 µL של מצע טרי. לאחר מכן, הנחתו את התליה על צלחת מצע עשירה בחומרים מזינים ללא אנטיביוטיקה, והמתינו לייבוש הנקודה לאחר שהתליה התייבשה.דגרו את הפלטה באופן הפוך למשך הלילה בטמפרטורה אופטימלית עבור החיידק המקבל ומותרת עבור התורם והעזר, אם רלוונטי. כעת, גרדו את הנקודה ובצעו מריחה לקבלת מושבות בודדות על פלטה סלקטיבית עם אנטיביוטיקה כדי להשיג תרבית טהורה של חיידקים, ובחרו מושבה בודדת לצורך בידוד.על ידי סריקה לאיתור פנוטיפים ספציפיים של המקבל. לדוגמה, ניתן להבדיל בין חיידקי cino abdi לבין e coli על ידי ביצוע בדיקת קטלאז; סריקה לאיתור הנוכחות של הפלסמיד תתבצע על ידי אישור פלואורסצנציה תחת אורך הגל המתאים לחלבון הפלסמיד הפלואורסצנטי. לאחר גידול של הסימביונט הבקטריאלי הטבעי למשך לילה, פזרו 600 µL של תרבית החיידקים על 8 עד 10 צלחות אגר ליפיד בקוטר 10 mm, ולאחר מכן דגרו את הצלחות בחושך ללא לחות בטמפרטורה של 25 °C.לאחר יומיים, הוסיפו 5,000 נמטודות בשלב juvenile זיהומי ב-500 microliters של מצע למשטחי החיידקים. לאחר דגירה של הפלטות בטמפרטורה של 25 degrees Celsius למשך שלושה ימים נוספים, הניחו 20 microliters של מים על תבנית מיקרוסקופ. לאחר מכן, השתמשו במקל סטרילי כדי לגרד כמות קטנה של נמטודות ממשטח החיידקים.הניחו את המקל בתוך המים כדי לאפשר לנמטודות לשחות החוצה. בחנו שקופית זו תחת הגדלה נמוכה. אם ביצים ונקבות נראות לעין, המשיכו כאשר הנקבות מכילות ביצים, שפכו מספר מיליליטרים של מים על פני השטח של הצלחות, סובבו בעדינות את הצלחות ולאחר מכן שפכו את המים למבחנה קונית בנפח 50 מיליליטר.הנמטודות צריכות להתרחק מהצלחות ולא להיות נראות יותר על פני השטח של הצלחת. יש להמתין עד שהנמטודות ישקעו לתחתית המבחנה, ולאחר מכן לשאוב את עודפי המים מהחלק העליון של המבחנה ולמלא אותה שוב במים נקיים. לאחר המתנה לשקיעת הנמטודות הבוגרות ושאיבה נוספת של עודפי המים, יש למלא את המבחנות הקוניות בתמיסת ביצים.לאחר מכן, ערבבו את המבחנות באמצעות היפוך עדין במשך 10 דקות בדיוק בטמפרטורת החדר. מיד לאחר הנעורה, סובבו את המבחנות הקוניות בצנטריפוגה למשך 10 דקות בדיוק ב-1,250 Gs ובטמפרטורת החדר, כאשר פונקציית הבלמים (break) מופעלת. לאחר מכן, שפכו במהירות את הנוזל העליון (supernatant), השעיקו מחדש את המשקע באמצעות תמיסת ביצים על ידי פיפטינג, ומלאו את המבחנה הקונית בתמיסת ביצים טרייה.ערבבו היטב את תמיסת הביצים על ידי היפוך השפופרת שלוש עד חמש פעמים, ולאחר מכן השקיעו מיד את הביצים והשפיכו את הנוזל העליון כפי שהודגם זה עתה. השעיכו מחדש את המשקע ב-misogyny, broth או LB באמצעות פיפוט, ולאחר מכן העבירו את תמיסת הביצים לשפופרת קונית של 15 מיליליטר. כעת מלאו את השפופרת של 15 מיליליטר ב-lb, שטפו את הביצים שלוש פעמים ב-broth תוך שימוש באותה טכניקה של שלבים מהירים שהודגמה זה עתה, ולאחר מכן דללו את ביצי נמטודת ה-P שהושעו מחדש לריכוז של לפחות 10 ביצים ל-µL.העבירו את הביצים לצלוחית פטרי בקוטר שישה סנטימטרים המכילה חמישה מיליליטר של LB ואנטיביוטיקה נגד חיידקים קולוניזטורים. ניתן לאחסן את הצלחת עטופה בנייר נצמד למשך עד ארבעה ימים לאחר גידול לילה וברירה של החיידקים הפלואורסצנטיים. השתמשו במקל סטרילי כדי לפרוס 600 microliters של תרבית החיידקים על גבי דיסקיות ליפיד של 10 millimeter, והדגרירו את התרבית בטמפרטורה של 25 degrees Celsius.לאחר יומיים, העבירו בין 500 ל-5,000 ביצי נמטודות לכל צלחת ליפיד. אם הצלחת אוחסנה, שטפו את הביצים ב-15 milliliters של LB כפי שהודגם זה עתה, לפחות פעם אחת, לפני הזרקת הביצים על מדשאי החיידקים שהוכנו מראש. לאחר מכן, דגרו את תרביות השיתוף של הנמטודות והחיידקים בחושך, ללא לחות, בטמפרטורה של 25 degrees Celsius עד להופעת בני juvenil infective כטבעת לבנה וסבכית בשולי הצלחת.כאשר נצפו הגלמיים המדבקים (infective juveniles), הסיר את המכסה של צלחת אגר הליפידים והנח את תחתית הצלחת בתוך תחתיתה של פטריה ריקה בגודל 100 מילימטר על 20 מילימטר. לאחר מכן, מלא את הפטריה במים בכמות שתגיע לכמחצית מגובהה של הצלחת הקטנה יותר, והדגר את מלכודת המים עד שצאו הגלמיים המדבקים של הדור הבא אל המים.לאחר איסוף הנמטודות מהמים או משלב החיים הרצוי ממסביבת גידול בקטריאלית מתאימה, המיסו מספר גרגירים של ole ב-30 µL של מים, והוסיפו 1 עד 2 µL מחומר השיתוק הזה לכל 50 µL של דגימת נמטודות. לאחר מכן, העבירו כ-20 עד 30 µL מדגימת הנמטודות המשותקות לזכוכית כיסוי של מיקרוסקופ והניחו לוחית כיסוי מעל לדגימה. בחנו את הנמטודות באמצעות מיקרוסקופ אור כדי לוודא שהן נמצאות בשדה הראייה.כדי לזהות את מיקום החיידקים, צלם את הנמטודות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנציה בנוסף להגדרת מיקרוסקופיית אור, ולאחר מכן הֶחפֵל את התמונות. ייתכן שיהיה צורך לנסות מספר הגדלות וזוויות ראייה של הנמטודה כדי לאתר את החיידקים.אוכלוסיית נמטודות משני מצעים נספרה ודורגה לפי התנחלות של הסימביונט הבקטריאלי. לצורך סטטיסטיקה רהוטה, מומלץ לספור לפחות 100 נמטודות לדגימה, כאשר לפחות 30 מהן נופלות לכל קטגוריה, כפי שמופיע בטבלה. נמטודות אלו מולבשות ברמה של כ-14.6% כאשר הן גדלות על אגר ליפידים ו-68.6% כאשר הן גדלות על אגר כבד וכליות.הוכח כי למינים אחרים של נמטודות וחיידקים יש רמות התנחלות שונות. סכימה זו מדגימה את המראה הכללי של נקבות Steiner NEMA. התמונה המוכנסת מציגה תמונת ניגוד הפרעה דיפרנציאלית (differential interference contrast) של נקבת S fot בהגדלה של 20x.החץ השחור בתמונה המוגדלת מצביע על הוולבה, בעוד שהחצים הלבנים מצביעים על ביצים גלויות. תמונה זו מראה ביצה מפותחת אך לא בבקעה של נמטודה מסוג volt בהגדלה של 40x, וביצים אלו, שבודדו מנמטודות s Volta, צולמו תחת הגדלה של 10x. כאן, בתמונה הראשונה, מוצגות תמונות מיקרוסקופיות מייצגות של נמטודות Steiner Nima הקשורות לחיידקי Xeno aptus.הנמטודות של אלבין הוצמדו לסמביונט החיידקי שלהן המבטא GFP כדי ליצור תמונה מורכבת זו. תמונת ניגודיות פאזה הונחה מעל תמונה פלואורסצנטית. החץ מצביע על החיידקים הנוכחים בתוך נמטודה בשלב juvenile זיהומי.תמונה זו מציגה נמטודה צעירה מסוג S carpa capsi עם GFP המבטא X nla. התמונה הוכנה באופן דומה לתמונה הקודמת ומציגה את הנמטודה הצעירה כאשר חיידקים המסומנים בחלבון פלואורסצנטי ירוק נראים כמו מוטות ירוקים הממוקמים לאורך כל lumen של מעי הנמטודה. בנוסף להליך המתואר, ניתן לשלב שיטות נוספות כגון מניפולציה גנטית של הסימביונט החיידקי לפני ההתחברות למארח הנמטודה, כדי לענות על שאלות נוספות כגון מהם המנגנונים המולקולריים הדרושים להתחברות בין המארח למיקרובה.

visualizing-bacteria-in-nematodes-using-fluorescent-microscopy

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מציגים שיטה לחזות לציפורן ב...

ויזואליזציה של Caenorhabditis elegans לציפורן מבנים באמצעות דיי ויטל lipophilic, DiI

מקור: צ'טריט, ד. ואחרים. יישום הדמיית תאים חיים וטומוגרפיית קריואלקטרונים לפתרון תכונות מרחב-זמן של מערכת ההפרשה Legionella pneumophila dot/ICM. J. Vis. Exp. (2020).הווידאו הזה מדגים את ההכנה וההדמיה של חיידקים פתוגניים מסומנים בפלואורסצנטית. כריות אגרוז מוכנות וממוקמות תחילה בתוך מסגרת דבק. תלייה של חיידקים מהונדסים גנטית המבטאים חלבון פלואורסצנטי מוחל על הפד כדי לייצב את התאים. המסגרת נאטמת באמצעות כיסוי ונצפית תחת מיקרוסקופ כדי ללכוד תמונות פלואורסצנציה של חיידקים.

הכנת דגימה והדמיה של חיידקים מסומנים פלואורסצנטית

סרטון זה מדגים הערכת ההשפעות הנוירודגנרטיביות של כימיקל בדיקה על Caenorhabditis elegans עם נוירונים מתויגים פלואורסצנטית. נוירונים נורמליים מראים פלואורסצנטיות בהירה של סומא ותהליכים שלמים, בעוד פלואורסצנטיות מופחתת, סומה נפוחה ותהליכים מנוקדים מצביעים על ניוון עצבי.

חקר ההשפעה של חומרי הדברה על Caenorhabditis elegans נוירונים

שקופים C. elegans המעי יכול לשמש"ויוו הרקמה תא" ללמוד apicobasal להן קרום ו לומן ברמה תא בודד, subcellular במהלך multicellular tubulogenesis. פרוטוקול זה מתאר כיצד לשלב תיוג סטנדרטי, אובדן-של-פונקציה גנטית/RNAi וגישות מיקרוסקופיים לנתח תהליכים אלה ברמה המולקולרית.

C. elegans המעי כמו המודל עבור המערכת לומן מורפוגנזה ו Vivo ב מקוטב ממברנה להן ברמה תא בודד: תיוג על ידי נוגדנים מכתים, ניתוח אובדן RNAi-של-פונקציה והדמיה

הדמיה של מסכי החיים של הקרינה הפלואורסצנטית, כימות ומבדיל את נטיות הצבירה של חלבונים בחיים, הזדקנות, והדגיש מודלים של מחלות C.

אפיון מבני עמילואיד בהזדקנות C. אלגיה באמצעות הדמיה של תקופת החיים הפלואורסצנטית

מוצג כאן הוא פרוטוקול כדי לפקח על השפלה של החלבון huntingtin התמזגו הפוטוורידים פלואורואופפור Dendra2.

ב Vivo פיקציה של מחזור החלבון בהזדקנות C. אלגיה באמצעות Photoconvertible המרה Dendra2

פרוטוקול להדמיית המיקרוטובולות הדינמיות ב-vivo באמצעות חלבון מחייב קצה עם תווית פלואורסצנטית הוצג. תיארנו את השיטות לתיוג, תמונה וניתוח המיקרוטובולות הדינמיות בתאי העצב של מיקרוטובול לרוחב אחורי (PLM) של C. elegans.

In vivo הערכה של מיקרוטובולה דינמיקה והתמצאות ב Caenorhabditis elegans נוירונים

בוגרים צעירים Caenorhabditis elegans נמטודות נחשפים לריכוזים שונים של חומרי הדברה מסחריים או חומרים רעילים אחרים במשך 2-24 שעות. לאחר מכן, ניתן לדמיין נוירונים שונים באמצעות זנים המבטאים פלואורסצנטיות. מאמר זה מדגים כיצד לחשוף נמטודות לחומרי הדברה ולהעריך את הנזק לתאי העצב.

בחינת ההשפעה של חומרי הדברה על נוירונים Caenorhabditis elegans

חיידקי מעיים, כולל חיידקים חוץ-תאיים ופתוגנים תוך-תאיים כמו נגיף אורסיי ומיקרוספורידיה (פטריות), קשורים לעתים קרובות לנמטודות פראיות של Caenorhabditis . מאמר זה מציג פרוטוקול לאיתור וכימות מיקרובים המאכלסים ו/או מדביקים נמטודות C. elegans , ולמדידת עומס פתוגנים לאחר זיהומים מבוקרים במעבדה.

RNA פלואורסצנטי באתרו הכלאה (FISH) כדי לדמיין התיישבות מיקרוביאלית וזיהום במעיים Caenorhabditis elegans

פרוטוקול זה מתאר שיבוש של 96 קידוחים של קאנורהבדיטיס אלגאן (Caenorhabditis elegans ) המיושבים בחיידקים בעקבות שיתוק קר והלבנת פני השטח כדי לסלק חיידקים חיצוניים. התרחיף המתקבל מצופה על לוחות אגר כדי לאפשר כימות מדויק בתפוקה בינונית של עומס חיידקים במספר גדול של תולעים בודדות.

שימוש בנתונים של תולעת בודדת כדי לכמת את ההטרוגניות באינטראקציות של Caenorhabditis elegans-Bacterial

המאמר מתאר אופטימיזציה של פרמטרים לרכישת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי להמחיש את ההובלה האקסונלית של מטענים מסומנים אנדוגניים ברזולוציה של נוירון יחיד בנמטודה חיה.

אופטימיזציה של ויזואליזציה של הובלה אקסונלית של מטען אנדוגני על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי ב Caenorhabditis elegans חי

למד הדמיית חיידקים פלורסצנטיים בנמטודות באמצעות מיקרוסקופיה פלורסנטית. שיטה זו מאפשרת לחקור את היחסים הסימביוטיים בין Xenorhabdus לבין מארחיהן.

Visualizing חיידקים בנמטודות באמצעות מיקרוסקופיה פלורסנט

גלה סרטונים נוספים