Visualizing חיידקים בנמטודות באמצעות מיקרוסקופיה פלורסנט

המטרה הכוללת של הליך זה היא לצפות בסימביה חיידקית המסומנת באופן פלואורסצנטי בתוך מארח הנמטודה שלהם. זה מושג על ידי תיוג החיידקים תחילה בחלבון פלואורסצנטי באמצעות צימוד. השלב השני הוא לבודד נמטודות AIC על ידי קצירת ביציות.

לאחר מכן, נמטודות ה-AIC גדלות בשילוב עם הסימביאנט החיידקי שלהן המסומן פלואורסצנטי כדי לאפשר אסוציאציה טבעית בסופו של דבר ללוקליזציה של הסימביאנט החיידקי בתוך מארח הנמטודה. ואת תדירות הקשר הזה בתוך אוכלוסיית הנמטודות ניתן לקבוע על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. שיטה זו יכולה לסייע לענות על שאלות מפתח בתחום הסימביוזה, כגון היכן חיידקים מתמקמים בתוך המארח שלהם, ומהי התפלגות ההובלה של חיידקים על פני אוכלוסייה מארחת?

לאחר גידול בן לילה של זני החיידקים, תת-התרבית, התורם המקבל והזנים המסייעים למצע גידול עשיר בחומרים מזינים חסרי אנטיביוטיקה ביחס של 1 ל-100 של תרבית למדיום, ואז מגדלים את התרביות בטמפרטורה המתאימה לכל זן עד שהם מגיעים לשלב הצמיחה האמצעי. לאחר מכן, שלבו את הזנים בצינור מיקרו צנטריפוגה יחיד וצנטריפוגה את התרביות המעורבות למשך שתי דקות ב-17, 900 גרם, שפכו את הסופרנטנט וסובבו את הגלולה ב-30 מיקרוליטר של מדיה טרייה. לאחר מכן הבחין בתרחיף על צלחת מדיה עשירה בחומרים מזינים ללא כל אנטיביוטיקה, והניח למקום להתייבש כאשר התרחיף התייבש.

דגרו את הצלחת הפוכה למשך הלילה בטמפרטורה אופטימלית עבור החיידק המקבל ומותר לתורם ולעוזר במידת הצורך. כעת, גרדו את המקום ופס למושבות בודדות על צלחת אנטיביוטיקה סלקטיבית כדי לקבל תרבית טהורה של פס חיידקים, מושבה אחת לבידוד. לבסוף, ודא שהמושבות המתקבלות הן הסימביאנט המקבל ולא הזן התורם.

על ידי סינון לנוכחות פנוטיפים ספציפיים לנמען. לדוגמה, ניתן להבחין בין חיידקי cino abdi לבין e coli על ידי ביצוע בדיקת זרז שנבדקה לנוכחות הפלסמיד על ידי אישור הקרינה מתחת לאורך הגל המתאים לחלבון הפלסמיד הפלואורסצנטי. לאחר גידול הסימביאנט החיידקי הטבעי בן לילה, פיזרו 600 מיקרוליטר מתרבית החיידקים על שמונה עד 10, 10 מילימטר שומנים מאווררים, ולאחר מכן דגרו את הצלחות בחושך ללא לחות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס.

לאחר יומיים, הוסף 5,000 נמטודות צעירות זיהומיות ב-500 מיקרוליטר מדיה למדשאות החיידקים. לאחר דגירה של הצלחות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך שלושה ימים נוספים, הניחו 20 מיקרוליטר מים על מגלשת מיקרוסקופ. לאחר מכן השתמש במקל סטרילי כדי לגרד כמות קטנה של נמטודות ממדשאת החיידקים.

הניחו את המקל במים כדי לאפשר לנמטודות לשחות. הסתכלו על השקופית הזו בהגדלה נמוכה. אם נראים ביצים ונקבות, המשיכו כאשר הנקבות מכילות ביצים, הניחו כמה מיליליטר מים על פני הצלחות, סובבו בעדינות את הצלחות ואז שפכו את המים לצינור חרוטי של 50 מיליליטר.

הנמטודות צריכות לרדת מהצלחות ולא להיות גלויות יותר על פני הצלחת. אפשר לנמטודות להתיישב בתחתית הצינור, ואז צנרת את עודפי המים מהחלק העליון של הצינור ומלאו את הצינור במים נקיים. לאחר שאפשרתם לנמטודות הבוגרות להתיישב והורידו את עודפי המים פעם נוספת, מלאו את הצינורות החרוטיים בתמיסת ביצים.

לאחר מכן מערבבים את הצינורות בהיפוך עדין למשך 10 דקות בדיוק בטמפרטורת החדר. לאחר ניעור מיד צנטריפוגה את הצינורות החרוטיים למשך 10 דקות בדיוק ב -1, 250 גרם וטמפרטורת החדר עם ההפסקה. לאחר מכן שפכו במהירות את הסופרנטנט, השעו מחדש את הגלולה בתמיסת ביצה על ידי פיפטינג ומלאו את הצינור החרוטי בתמיסת ביצה טרייה.

מערבבים היטב את תרחיף הביצים על ידי היפוך הצינור שלוש עד חמש פעמים ולאחר מכן מיד לאחר כדור הביצים וניקוי הסופרנטנט כפי שהוצג זה עתה. השעו מחדש את הגלולה במיזוגניה, מרק או LB על ידי פיפטינג, ולאחר מכן העבירו את תרחיף הביצה לצינור חרוטי של 15 מיליליטר. כעת מלאו את צינור ה-15 מיליליטר ב-lb, שטפו את הביצים שלוש פעמים במרק באותה טכניקת צעד מהיר כפי שהודגמה זה עתה, ולאחר מכן דללו את ביצי נמטודות ה-P התלויות לפחות ל-10 ביצים למיקרוליטר.

העבירו את הביצים לצלחת פטרי של שישה סנטימטרים המכילה חמישה מיליליטר LB ואנטיביוטיקה נגד חיידקים מתיישבים. ניתן לאחסן את הצלחת עטופה בפרפיל עד ארבעה ימים לאחר גידול לילה ובחירת החיידקים הפלואורסצנטיים. השתמש במקל סטרילי כדי לפזר 600 מיקרוליטר מתרבית החיידקים על מאווררי שומנים של 10 מילימטר, וכדי לדגור את התרבית ב-25 מעלות צלזיוס.

לאחר יומיים, חלקו 500 עד 5,000 ביצי נמטודה על כל צלחת שומנים. אם הצלחת אוחסנה, שטפו את הביצים ב -15 מיליליטר LB כפי שהודגם זה עתה לפחות פעם אחת לפני חיסון הביצים על מדשאות החיידקים שהוכנו בעבר. לאחר מכן דגרו על תרביות חיידקי הנמטודות בחושך ללא לחות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס עד שצעירים זיהומיים מופיעים כטבעת לבנה מטושטשת בקצה הצלחת.

כאשר נצפו הצעירים המדבקים. הסר את המכסה של צלחת אגר השומנים והנח את תחתית הצלחת בתחתית צלחת פטרי ריקה בגודל 100 מילימטר על 20 מילימטר. לאחר מכן מלאו את צלחת הפטרי במספיק מים כדי להגיע לגובה של כמחצית מהצלחת הקטנה יותר ודגרו על מלכודת המים עד שהצאצאים הצעירים המדבקים הגיחו למים.

לאחר איסוף הנמטודות מהמים או בשלב החיים הרצוי ממדשאת החיידקים המתאימה, ממיסים כמה גרגרי אולה ב -30 מיקרוליטר מים, ובמיקרוליטר אחד עד שניים של חומר משתק זה לכל 50 מיקרוליטר דגימת נמטודה. לאחר מכן העבירו כ-20 עד 30 מיקרוליטר מדגימת הנמטודה המשותקת לשקופית מיקרוסקופ והניחו פתק כיסוי על גבי הדגימה. צפו בנמטודות באמצעות מיקרוסקופ אור כדי לוודא שהנמטודות נמצאות בשדה הראייה.

לזהות לוקליזציה של חיידקים. צלם את הנמטודות במיקרוסקופ פלואורסצנטי בנוסף להגדרת מיקרוסקופ האור, ולאחר מכן הצב את התמונות. ייתכן שיהיה צורך לנסות מספר הגדלות ותצוגות של הנמטודה כדי למצוא את החיידקים.

אוכלוסייה של נמטודות משני מדיות נספרו ודורגו להתיישבות על ידי סימביאנט החיידקים. לסטטיסטיקה חזקה, עדיף לספור לפחות 100 נמטודות לדגימה, כאשר לפחות 30 נופלות לכל קטגוריה כפי שניתן לראות בטבלה. נמטודות אלה מושבות ברמה של כ-14.6% בגידול על אגר שומנים ו-68.6% בגידול על כבד, אגר כליות.

הוכח כי למיני נמטודות וחיידקים אחרים יש רמות שונות של קולוניזציה. סכימה זו ממחישה את המראה הכללי של נקבות שטיינר NEMA. הכניסה מציגה את תמונת ניגודיות ההפרעות הדיפרנציאלית של נקבה גרפית S fot בהגדלה של פי 20.

החץ השחור בשיבוץ מציין את הפות, ואילו החצים הלבנים מציינים ביצים גלויות. תמונה זו מציגה ביצת נמטודת וולט מפותחת אך לא בקעה בהגדלה של פי 40, וביצים אלה שבודדו מנמטודות וולטה צולמו בהגדלה של פי 10. כאן, תמונות מיקרוסקופ מייצגות של נמטודות שטיינר נימה הקשורות לחיידקי Xeno aptus מוצגות בתמונה הראשונה הזו.

הנמטודות של אלווין היו קשורות לתערוכת הסימביאנט החיידקי שלהן המבטא GFP ליצירת תמונה מורכבת זו. תמונת ניגודיות פאזה הוצגה בתמונה פלואורסצנטית. החץ מציין את החיידקים הקיימים בתוך הנמטודה הצעירה המזהמת.

תמונה זו מציגה נמטודה צעירה של S carpa capsi עם GFP המבטא X nla. התמונה נבנתה באופן דומה לתמונה הקודמת ומתארת את הנמטודה הצעירה עם חלבון פלואורסצנטי ירוק המסומן בחיידקים המוצגים כמוטות הירוקים הממוקמים לאורך לומן המעי של הנמטודה. בנוסף להליך המתואר, ניתן לשלב שיטות אחרות כמו מניפולציה גנטית של הסימביאנט החיידקי לפני הקשר עם מארח הנמטודה על מנת לענות על שאלות נוספות כגון מהם המנגנונים המולקולריים הדרושים לקשר של חיידק המארח.