חיים התא מיקרוסקופ פלורסצנטיות לבחון תהליכים חיוניים במהלך צמיחת תאים מיקרוביאלי

המטרה הכוללת של גישה מבוססת מיקרוסקופיה זו היא לצפות בתהליכים מרכזיים במהלך גדילת תאי חיידקים. שיטה זו מאפשרת לנו לענות על שאלות חשובות בבקטריולוגיה, כגון כיצד תהליכים חיוניים מתואמים במהלך גדילה וחלוקה של תאי חיידקים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאנו מסוגלים להשתמש בריאגנטים פלואורסצנטיים כדי לדמיין משטחי תאים ומבנים של חיידקים בתאים חיים.

כאן, אנו משתמשים בשיטה זו כדי לספק תובנה לגבי תהליכים חיוניים ב-Agrobacterium tumefaciens. עם זאת, ניתן לאמץ את התהליך הזה גם לחיידקים אחרים כדי לחקור את הגדילה שלהם. כדי להתחיל, השתמש במקל עץ סטרילי או בקצה פיפטה כדי לחסן שלושה מיליליטר של מדיום גידול ATGN, עם מושבה אחת של זן בר או מוטנטי של A.Tumifaciens.

גדל את התרבות ב-28 מעלות צלזיוס ו-225 סל"ד בן לילה. למחרת, השתמש בספקטרופוטומטר כדי למדוד את ה-OD600. לאחר מכן, יש לדלל את תרבית התאים ל-OD600 של כ-0.2 ולהמשיך לגדל את התאים ל-OD600 של 0.6.

הוצא מיליליטר אחד של תרבית אקספוננציאלית לשלושה צינורות מיקרופוגה. וגלול את התאים בצנטריפוגה שולחנית ב-7,000 x גרם למשך חמש דקות. השעו מחדש כל כדור תא במיליליטר אחד של PBS, ולאחר מכן הוסיפו מיקרוליטר אחד של תמיסת מלאי DMSO Orange או תמיסת מלאי DAPI.

מערבבים בעדינות על ידי פיפטינג, ודוגרים על התאים התלויים מחדש בחושך למשך חמש דקות. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ב-7,000 x גרם למשך חמש דקות, והשעיה מחדש של הגלולה במיליליטר אחד של PBS כדי להסיר עודף ריאגנט. לאחר מכן, שטפו את התאים פעמיים נוספות, והשעו מחדש את הגלולה ב-50 מיקרוליטר PBS או מדיום.

להדמיית זמן-lapse בו-זמנית, שלב עשרה מיקרוליטרים של תאים מכל טיפול בצינור מיקרופוגה חדש. כדי להכין רפידות אגרוז להדמיית תאים, השתמש בהחלקת כיסוי כמדריך, וחתוך ריבוע של 22 על 22 מילימטר של סרט מעבדה על ידי העברת אזמל סביב הקצוות. חותכים ריבוע ממרכז סרט המעבדה, ומשאירים גבול של שניים עד חמישה מילימטר שישמש כאטם לכרית האגרוז.

לאחר מכן, השליכו את החתך המרכזי. הנח את אטם הסרט על מגלשת זכוכית, מנוקה בעזרת חומר ניקוי ללא אמוניה ואלכוהול. והשתמש בגוש חום המוגדר ל-70 מעלות צלזיוס או בלהבה כדי לחמם את השקופית עד שהסרט נמס מעט על הזכוכית.

לאחר מכן, הכינו תמיסת אגרוז על ידי ערבוב של כ- 0.075 גרם אגרוז וחמישה מיליליטר בינוני בבקבוק קטן. מחממים את התמיסה במיקרוגל עם מערבולת תקופתית לערבוב, עד שהאגרוז מומס והתמיסה ברורה. שמור את תמיסת האגרוז בטמפרטורה של 55-70 מעלות צלזיוס והשתמש בה לבניית רפידות אגרוז מרובות תוך 48 שעות.

פיפטה את מדיום האגרוז החם למרכז האטם. לאחר מכן, הנח החלקת כיסוי מעל האטם כדי לפזר את האגרוז באופן שווה. הנח את השקופית על משטח ישר וקריר להתמצקות למשך כשתי דקות.

כעת, החלק בזהירות את החלקת הכיסוי מכרית האגרוז, ולאחר מכן אפשר לכרית האגרוז להתייבש באוויר למשך דקה עד שתיים בטמפרטורת החדר, עד שפני השטח של הרפידה נראים יבשים. בנייה נכונה של כרית האגרוז היא חיונית לרכישת תמונות באיכות גבוהה. אל תנסה לצלם על פנקס גרוע.

אם כרית האגרוז מתייבשת, אדוות או נקרעת, עדיף לא להתעצל ובמקום זאת, להכין כרית חדשה. לאחר מכן, בעזרת אזמל, הסר רצועה קטנה של אגרוז ליצירת כיס אוויר בערך שניים על שבעה עד עשרה מילימטרים. תאי Tumefacien נוטים לגדול בצורה הטובה ביותר ליד כיס האוויר.

הבחין ב-0.8 עד 1 מיקרוליטר של תאים על כרית האגרוז. לאחר מכן הניחו בעדינות החלקת כיסוי מעל החלק העליון של כרית האגרוז כדי לפזר את התאים על פני השטח של הכרית. להדמיית זמן-lapse לטווח ארוך, השתמש ב-Valap מומס כדי לאטום את הקצוות של החלקת הכיסוי.

הקפד לאטום לאורך כל הקצוות והפינות של החלקת הכיסוי בעזרת Valap. אי ביצוע זה עלול לגרום להיסחפות במהלך הדמיית ה-time-lapse של כרית האגרוז. כדי לבצע מיקרוסקופיה אפיפלואורסצנטית, הנח שמן טבילה על המטרה הרצויה והנח את השקופית ההפוכה לתוך מחזיק השקופיות על הבמה.

השתמש בכפתורי המיקוד כדי להביא את התאים למיקוד. רכוש תמונות ב-Phase, או DIC ו-fluorescence, באמצעות מסנן הקרינה הרצוי לתמונות פלואורסצנטיות. לחלופין, רכוש מספר מיקומי x, y על ידי בחירה אקראית של עשרה שדות תאים בסמיכות לכיס האוויר של רפידות האגרוז.

הגדר את רכישת רצף הזמן לתמונה בשלב, או DIC, במרווח הזמן הרצוי. כפי שמוצג כאן, תאים צולמו ישירות מהתרבית לאחר שטיפה על ידי צנטריפוגה ולאחר דגירה של התאים עם 0.1 אחוז DMSO, התוצאות הראו ש-DMSO לבדו אינו משפיע על מורפולוגיה של התא. גם Orange וגם DAPI סימנו DNA בתוך תאי A.Tumefaciens חיים.

בתאים טרום-חלוקה מאוחרים, נצפים שני נוקלאולואידים נפרדים עם צביעה כתומה, בעוד שתיוג DNA נראה מפוזר יותר עם צביעת DAPI. בניסוי זמן-lapse זה עם שיעור שווה של A.Tumefaciens לא מסומנים, מסומנים ב-DAPI וכתומים מסומנים ב-A.Tumefaciens, כל התאים גדלו כאשר צולמו במיקרוסקופ ניגודיות פאזה, מה שמצביע על כך שאף אחד מהכתמים לא פגע בצמיחת התאים. התאים גדלו גם תחת ניגודיות פאזה במיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי באמצעות מסנן TRITC.

עם זאת, כאשר צולמו עם מסנן DAPI, התאים הפסיקו לגדול תוך שעה. בעקבות שיטות דומות, ניתן להשתמש גם בריאגנטים פלואורסצנטיים אחרים כדי לדמיין את דופן התא או הממברנות של החיידקים. יתר על כן, ניתן לשלב רבים מהצבעים הפלואורסצנטיים הללו כדי לספק תמונה מקיפה של פני התא החיידקי.

הדמיה של תהליכים חיוניים בחיידקים חיים היא מרגשת, מכיוון שהיא פותחת את האפשרות לחקור תהליכים אלה במוטציות מותנות או בחיידקים שאינם מודלים. זה מאפשר לנו לשפר את המחקרים שלנו על מיני חיידקים מגוונים.