Name: קביעת מבנה וקואורדינציה של קומפלקסים של פפטיד-מתכת באמצעות תמג 1D ו-2D 1H (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 44 s
Description: חקור את מבנה הקומפלקס של פפטיד-מתכת עם נחושת באמצעות ספקטרוסקופיית תמ"ג. הפרוטוקול כולל הכנת דגימה בסביבה נטולת חמצן, איסוף נתונים וניתוח מבני מפורט.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לתוכנית מדעי הגבול האנושי (מענק חוקר צעיר (RGY) 0068-2006) על התמיכה הכספית.

1. הכנת מדגם
<ol>
	<li>דגימת אפו: ממיסים כ-1-2 מ"ג של הפפטיד ב-450-500 מיקרוליטר של ממס בדרגת תמ"ג (הפתרונות המועדפים לדגימות ביולוגיות הם 10% D2O במים או d6-DMSO 11-12 אם הדגימה אינה מתמוססת במים או מגיבה איתם).</li>
	<li>דגימה מגיבה נחושת: ממיסים כ-1-2 מ"ג מהפפטיד עם כמות שווה ערך של מלח מתכת ב-450-500 מיקרוליטר של ממס ה-NMR.</li>
	<li>מסננים את התמיסה באמצעות זכוכית סינטר, נייר סינון או כל טכניקה אחרת המתאימה לתרכובות הנחקרות ואינה סופחת אותן. זה חיוני כדי להסיר חלקיקים מתכתיים, שישפיעו על ההומוגניות.</li>
	<li>העבירו את התמיסה לצינור NMR וסגרו אותו. ודא שאיכות הצינור מתאימה לחוזק המגנט בו נעשה שימוש (לפרטים נוספים ראה טבלת ציוד).</li>
	<li>אם הדגימה רגישה לחמצן, יש לבצע שלבים אלה בסביבה אינרטית ולאטום את הצינור כדי למנוע חמצון.</li>
</ol>
2. איסוף ועיבוד נתוני NMR13
<ol>
	<li>רשום ספקטרום 1D 1H של הדגימות המגיבות לאפו ונחושת והשוואה. ספקטרום הפפטידים המכיל נחושת אמור להראות שינוי משמעותי של שינוי כימי באזור האמיד והפסגות נפתרו מכיוון שהאפו-פפטיד גמיש ומראה ממוצע של קונפורמציות, אך בתגובה עם נחושת, לאמידים הקשורים לפפטיד יש מבנה יחיד (איור 2).
	<ol>
		<li>אם הספקטרום אינו משתנה, ההנחה היא שהתגובה נכשלה.</li>
		<li>אם הדגימה תהפוך לירוקה, הנחושת תחמצן באטמוספירה, מה שעלול לשנות את תכונות הקישור שלה.</li>
		<li>בשני המקרים הללו, יהיה צורך לבצע מחדש את הדגימה.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>מצא תנאי טמפרטורה אופטימליים למדידות NMR הנותנים חפיפה מינימלית של שאריות האמיד עם רוחב קו צר.</li>
	<li>הגדר ניסויי COSY14, TOCSY15 ו-NOESY16, או ROESY17 NMR בתנאים זהים (טמפרטורה, pH וכו') והפעל ברצף.
	<ol>
		<li>ניסויי COSY (איור 3) ו-TOCSY (איור 4) יזהו אינטראקציות דרך קשרים של אינטראקציות פרוטון-פרוטון סמוכות וארוכות טווח, בהתאמה. ספקטרום COSY נותן מידע על מתאמים HN-Hα בעוד שספקטרום TOCSY נותן, בנוסף, מידע על HN ופרוטונים אליפטיים אחרים של H של שאריות מתואמות.</li>
		<li>ניסויי NOESY ו-ROESY (איור 5) מזהים קרבה דרך החלל ללא תלות בקשרים כדי לתת מידע מבני. הבחירה בין השניים היא על פי הגודל האפקטיבי של התרכובת וחוזק השדה. כמה שילובים כאלה נותנים אותות אפס תיאורטיים (איור 6) ויהיה צורך להריץ ניסוי ROESY כדי לזהות אינטראקציות NOE10,18.</li>
		<li>אם הדגימה נמצאת במים, הניסויים צריכים לכלול מרכיב של דיכוי מים. זה מושג בצורה היעילה ביותר באמצעות שיפועים19. במקרה זה, כדאי להריץ מחדש את הדגימה, לאחר שהוקצתה, ב-D2O טהור כדי להשיג אינטראקציות למימן Hα וביניהם.</li>
		<li>מטב את משך זמני הערבוב של TOCSY ו-NOESY או ROESY על ידי הפעלת מספר ניסויים קצרים כדי למצוא הצטברות אות מקסימלית עם אובדן מינימלי לדיפוזיה ספין. ודאו שזהו האזור הליניארי של עקומת ההצטברות. ערכים נפוצים עבור פפטידים בשדות MHz 600 כוללים זמני ערבוב של כ- msec 100 עבור TOCSY ו- msec 150 עבור ניסויי NOESY או ROESY.</li>
		<li>הריצו ניסויים חד-ממדיים בין כל ניסוי כדי לוודא שהרכב הדגימה נשאר קבוע לאורך כל רכישת הנתונים (איור 7).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>עבד את הספקטרום באמצעות פונקציות אפודיזציה מתאימות כדי להשיג רזולוציה מקסימלית עם אובדן מינימלי של עוצמת האות, תוך הוספת מילוי אפס בממד t1.
	<ol>
		<li>תקן עוד יותר את קו הבסיס בממד F2 ואז F1 עם פונקציה פולינומית ריבועית.</li>
		<li>כייל את ההסטה הכימית של הספקטרום בזהירות בהתאם לשיא המים הנותרים או DMSO בממיסים המתאימים בהתאם לסטייה שלהם מהתקנים הידועים (TMSP או TMS, בהתאמה).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. שיא הקצאה ואינטגרציה באמצעות SPARKY20
<ol>
	<li>הכינו קבוצה של ספקטרום COSY ו-TOCSY על ספקטרום NOESY או ROESY (איור 8).</li>
	<li>הקצה את כל פסגות ה-NOE בספקטרום על פי מתודולוגיית ההקצאה הרציפה שפותחה על ידי Wüthrich21.
	<ol>
		<li>התחל עם הקצאת פסגות החופפות לאותות TOCSY באזור טביעת האצבע, מכיוון שזה יקל על ערכי הקצאת שיא עוקבים עם תוכנית SPARKY (איור 9). רשום את ההסטה הכימית של ההקצאה (איור 10), ו-3 ערכי JHNHα (איור 11).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>תרגם פסגות לאילוצי מרחק וערכי 3 JHNHα לזוויות דיהדרליות.
	<ol>
		<li>ניתן לעשות זאת על ידי שילוב הפסגות מתוך התוכנית ותרגומם לאילוצי מרחק באמצעות אינטראקציה של מרחק ידוע (כגון המרחק בין שני פרוטונים מקבוצת מתילן או אטומי מימן ארומטיים של חומצת אמינו ארומטית).</li>
		<li>אם הפסגות חופפות, ולא ניתן להשתמש בשיטות אינטגרציה, ניתן לתייג אותן כחזקות-בינוניות-חלשות-חלשות מאוד על ידי הערכה חזותית, וניתן לתרגם את הכינויים הללו למרחקים של עד 2.5, 3.5, 4.5 ו-5.5 Å, בהתאמה. זה יהיה היעיל ביותר בעבודה עם פפטידים.</li>
		<li>3ערכי JHNHα מצביעים על זוויות דיהדרליות על פי משוואת קרפלוס שבה רוב ערכי הצימוד הנתונים יכולים לנבוע מיותר מזווית דיהדרלית אחת. אלה יכולים להעיד על מבנה משני (סלילי או יריעות), סליל אקראי או ממוצעים קונפורמטיביים שלו. לכן, חשוב להשתמש באילוצים בזהירות, או להשתמש בהם כאישור לתוצאות קונפורמציה.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. חישובי מכניקה מולקולרית ליצירת אנסמבל מבנים באמצעות XPLOR22
<ol>
	<li>ייבא את אילוצי המרחק והזוויות הדיהדרליות עם הפורמט הנכון עבור XPLOR. (איור 12, אילוצים בין-שיוריים בלבד). XPLOR תחפש מרחב קונפורמציה כדי למצוא מבנים הנצמדים לאילוצים כימיים גיאומטריים קנוניים, כגון אורכי קשר, זוויות, כיראליות וכו', בנוסף לאילוצי המרחק שנמצאו בניסוי, כדי ליצור אנסמבל שבו אף אחד מהפרמטרים לעיל אינו מופר. זה יהווה את ההרכב הפותח.</li>
	<li>ריצת קביעת המבנה הראשונה תהיה ללא שימוש באילוצים כלשהם למתכת. זה יראה אילו שאריות משתתפות בכריכת מתכות ללא כל הטיה. דלג לשלב 4.4.</li>
	<li>בנוסף לאילוצי המרחק הנגזרים מ-NMR, הוסף אילוצי קשירת מתכת לשאריות שנקבעו.
	<ol>
		<li>הוסף פרמטרים מתאימים לתיאור יון המתכת והטופולוגיה שלו.</li>
		<li>יש להכניס את המידע הפיזיקלי המתאים (מסה, אורכי קשר עם אטומים אחרים, זוויות ופרמטרים של דחייה לא מקשרת) לקובץ הפרמטרים.</li>
		<li>הוסף את פרטי הכריכה לקובץ הטופולוגיה: אילו קשרים נוצרים ונשברים, ואילו מטענים צורניים משתנים כתוצאה מהכריכה.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>צור הרכב קטן של בדרך כלל 10 חברים.
	<ol>
		<li>הציגו את האילוצים בהדרגה, החל מאינטראקציות עמוד שדרה לעמוד השדרה, לאחר מכן עמוד שדרה לשרשרת צד, לאחר מכן אינטראקציות צד לשרשרת צד, ועברו מאינטראקציות תוך-שיוריות, רציפות לטווח ארוך יותר ויותר. זה מקל על זיהוי טעויות במשימה.</li>
		<li>הציגו את אנרגיית ה-NOE כפוטנציאל באר ריבועית עם קבוע כוח קבוע של 50 קק"ל/מול•Å 2. חישול מדומה צריך להיעשות עם 1,500 צעדים של 3 שניות ב-1,500 K ו-3,000 צעדים של 1 fsec במהלך הקירור ל-500 K. לבסוף, צמצם את המבנים באמצעות מזעור אנרגיית שיפוע מצומד עבור 4,000 איטרציות; אלו הם משתנים הניתנים לשינוי בתוך XPLOR.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>צור הרכב סופי של בדרך כלל 50 חברים. בצע שלבים משלב 4.4 על כל האנסמבל.
	<ol>
		<li>דווח על המספר של כל סוג של אינטראקציה NOE שנמצאה, כפי שמוצג באיור 13.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>צור אנסמבל של מבנים הנצמדים לגיאומטריה כימית קאנונית ולאילוצים האמפיריים הנגזרים מתמ"ג.
	<ol>
		<li>דווח על המספר הכולל של קונפורמציות, מספר אלה שיש להם הפרות של האילוצים הנגזרים מ-NMR, וה-RMSD של כל המכלול, הן עמוד השדרה, והן כל ערכי ה-RMSD של האטומים הכבדים.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. ניתוח מבנה
<ol>
	<li>ההרכב שנפתר מייצג את המרחב הקונפורמטיבי שאומץ על ידי הפפטיד במהלך מדידת ה-NMR. הגמישות המקומית עשויה להשתנות באזורים שונים של המולקולה וניתן לייחס זאת לסיבות מבניות או תפקודיות (מטרת הניתוח המבני היא לקבוע את הבסיס המבני ליציבות ומנגנון הפעולה).
	<ol>
		<li>ייבא את כל הקונפורמציות של המבנה לתוכנית MolMol23 כדי ליצור הרכב התחלתי (איור 14).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>לבחון את ההרכב כדי לקבוע את היציבות המקומית של המולקולה.
	<ol>
		<li>קבע את ערכי ה-RMSD של עמוד השדרה והשרשרת הצדדית על ידי בחירת אזורי ארבעת השאריות הבאים לאורך הרצף ובקשת התוכנית לחשב את ה-RMSD למבנה האנרגיה הנמוך ביותר או לממוצע.</li>
		<li>קבע אילו אזורים של המולקולה מראים יציבות מקומית (איור 15) על ידי התוויית ה-RMSD המקומי כפונקציה של רצף.</li>
		<li>שכבו את ההרכב לאורך אזור זה של המולקולה והשתמשו בהרכב זה לניתוח נוסף (איור 16).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>בחר קונפורמציות באנרגיה נמוכה הנצמדות לאילוצים הנגזרים מ-NMR (ללא הפרה). אלה יהוו את "הרכב האנרגיה הנמוכה".
	<ol>
		<li>דווח על מספר הקונפורמציות בהרכב, הקריטריונים לבחירתם וערכי RMSD כפי שהוגדרו בשלב 4.6.1.</li>
		<li>אם מצב כריכת המתכת כבר נקבע, המשך לשלב הבא. אחרת: נתח את מכלול האנרגיה הנמוכה וקבע אילו שרשראות צד של שאריות נמצאות בסמיכות נכונה זו לזו כדי להיות מסוגלים לקשור את יון המתכת. לאחר שנקבעו, חזור לשלב 3.3 ובצע מחדש את הניתוח כולל נתוני קשירת הנחושת (איור 17 עבור האנסמבל ואיור 18 עבור הקונפורמר באנרגיה נמוכה).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>לבחון את ההרכב ולקבוע את המבנה המשני המקומי בתוך המולקולה באמצעות פרמטרי החיפוש המוגדרים כברירת מחדל של תוכנית MolMol. מבנים משניים מוחזקים על ידי קשרי מימן ומציינים אזורים יציבים של המולקולה.
	<ol>
		<li>קבע את המבנה המשני של כל קונפורמטור (איור 19).
		<ol>
			<li>צור טבלה של אחוז הקונפורמרים של ההרכב המציג כל מבנה משני.</li>
			<li>קבע אם אזורי המבנה המשני חופפים את האזורים שנקבעו כאזורים היציבים על ידי מקומי-RMSD. זה קורה לעתים קרובות.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>קבע מרחקים וקשרי מימן בתוך המולקולה.
	<ol>
		<li>ייבא את האנסמבל ל-Chimera24.</li>
		<li>השתמש בכימרה כדי לקבוע מרחקים תוך-מולקולריים בין אטומים החשודים כקשירת מתכת. חשב את המרחקים הממוצעים בהרכב.</li>
		<li>השתמש בכימרה כדי לקבוע קשרי מימן תוך-מולקולריים בכל קונפורמטור של ההרכב (איור 20), תוך שימוש בפרמטרי ברירת המחדל של קשרי מימן רגועים (ב-20%) של התוכנית.</li>
		<li>צור טבלה של אחוז הקונפורמרים של ההרכב המציג כל קשר מימן. קשרי מימן החוזרים על עצמם ברוב הקונפורמציות מצביעים על קשר יציב המוסיף ליציבות המבנה.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>קבע אינטראקציות אלקטרוסטטיות בתוך המולקולה.
	<ol>
		<li>זהה אינטראקציות בין שרשראות צד טעונות.</li>
		<li>צור טבלה של אחוז הקונפורמרים של ההרכב המציג כל אינטראקציה אלקטרוסטטית.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>חשב את התפלגות הפוטנציאל האלקטרוסטטי באמצעות שדה הכוח Amber25 בתוכנית Delphi26.
	<ol>
		<li>בחר קונפורמציה מייצגת אחת מהאנסמבל שעליה ניתן לבצע את חישובי הפוטנציאל האלקטרוסטטי.</li>
		<li>להפיק פוטנציאל אלקטרוסטטי באמצעות משוואת פואסון-בולצמן וחישוב קולומבי מלא. הפרמטרים הנדרשים כוללים את החוזק היוני של התמיסה, הערכים הדיאלקטריים של התמיסה (80 למים; 40 ל-DMSO); הפפטיד הפנימי (בדרך כלל בסביבות 5.0); גודל הגריד (בדרך כלל 65'65'65 נקודות); והמרחק המינימלי בין הפפטיד לקצה הרשת (10 Å). התוצאות בדרך כלל חזקות למדי ביחס לערכים אלה מכיוון שהתוצאה העיקרית נשלטת על ידי הפפטיד עצמו (איור 21).</li>
		<li>בחנו את הפוטנציאל האלקטרוסטטי הממופה על פני השטח של הפפטיד (איור 22).</li>
		<li>בחן את משטחי האיזו פוטנציאל האלקטרוסטטיים, המתארים מיקומים בעלי אותו פוטנציאל. מצא איזו-משטחים המרמזים על רלוונטיות ביולוגית, כגון משטחים חיוביים או שליליים מורחבים שעשויים למשוך או לדחות חלבונים או ליגנדים אחרים, או התפלגויות המצביעות על משמעות, כגון התפלגות אמפיפתית או טלאים בעלי תכונות שונות (איור 23).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>סכם את כל הממצאים המבניים כדי לראות כיצד הם מחזקים זה את זה.</li>
	<li>חזור על שלבים 4.3-5.7.4 כאשר רלוונטי.</li>
</ol>

<ol><li>Robinson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+epitope+mimetics+as+anti-infectives%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein epitope mimetics as anti-infectives.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 15, 379-386 (2011).</li>
<li>Huffman, D. L., Function O'Halloran, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((structure%2C+and+mechanism+of+intracellular+copper+trafficking+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">structure, and mechanism of intracellular copper trafficking proteins.</a> Annu. Rev. Biochem. 70, 677-701 (2001).</li>
<li>Tapiero, H., Townsend, D. M., Tew, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trace+elements+in+human+physiology+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Copper.+Biomed.%2C+%26+Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">Trace elements in human physiology and pathology.</a> Copper. Biomed., & Pharmacotherapy. 57, 386-398 (2003).</li>
<li>Boal, A. K., Rosenzweig, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Biology+of+Copper+Trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Structural Biology of Copper Trafficking.</a> Chem. Rev. 109, 4760-4779 (2009).</li>
<li>Rubino, J. T., Franz, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+chemistry+of+copper+proteins%3A+How+nature+handles+a+toxic+cargo+for+essential+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Inorg.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Coordination chemistry of copper proteins: How nature handles a toxic cargo for essential function.</a> J. Inorg. Biochem. 107, 129-143 (2012).</li>
<li>Wernimont, A. K., Huffman, D. L., Lamb, A. L., O'Halloran, T. V., Rosenzweig, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+copper+transfer+by+the+metallochaperone+for+the+Menkes%2FWilson+disease+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural basis for copper transfer by the metallochaperone for the Menkes/Wilson disease proteins.</a> Nat. Struct. Biol. 7, 766-771 (2000).</li>
<li>Singleton, C., Hearnshaw, S., Zhou, L., Le Brun, N. E., Hemmings, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+insights+into+Cu%28I%29+cluster+transfer+between+the+chaperone+CopZ+and+its+cognate+Cu%28I%29-transporting+P-type+ATPase%2C+CopA%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Mechanistic insights into Cu(I) cluster transfer between the chaperone CopZ and its cognate Cu(I)-transporting P-type ATPase, CopA.</a> Biochem. J. 424, 347-356 (2009).</li>
<li>Hearnshaw, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Tetranuclear+Cu%28I%29+Cluster+in+the+Metallochaperone+Protein+CopZ%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">A Tetranuclear Cu(I) Cluster in the Metallochaperone Protein CopZ.</a> Biochem. 48, 9324-9326 (2009).</li>
<li>Shoshan, M. S., Tshuva, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MXCXXC+class+of+metallochaperone+proteins%3A+model+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">The MXCXXC class of metallochaperone proteins: model studies.</a> Chem. Soc. Rev. 40, 5282-5292 (2011).</li>
<li>Shoshan, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMR+characterization+of+a+Cu%28I%29-bound+peptide+model+of+copper+metallochaperones%3A+Insights+on+the+role+of+methionine%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Comm%22%5BJournal%5D)">NMR characterization of a Cu(I)-bound peptide model of copper metallochaperones: Insights on the role of methionine.</a> Chem. Comm. 47, 6407-6409 (2011).</li>
<li>Schmitt, W., Zanotti, G., Wieland, T., Kessler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformation+of+different+S-deoxo-Xaa%283%29-amaninamide+analogues+in+DMSO+solution+as+determined+by+NMR+spectroscopy.+Strong+CD+effects+induced+by+beta+I%2C+beta+II+conformational+change%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Conformation of different S-deoxo-Xaa(3)-amaninamide analogues in DMSO solution as determined by NMR spectroscopy. Strong CD effects induced by beta I, beta II conformational change.</a> J. Am. Chem. Soc. 118 (3), 4380-4387 (1996).</li>
<li>Behrens, S., Matha, B., Bitan, G., Gilon, C., Kessler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-activity+relationship+of+the+ring+portion+in+backbone-cyclic+C-terminal+hexapeptide+analogs+of+substance+P+-+NMR+and+molecular+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Peptide+and+Protein+Res%22%5BJournal%5D)">Structure-activity relationship of the ring portion in backbone-cyclic C-terminal hexapeptide analogs of substance P - NMR and molecular dynamics.</a> Int. J. Peptide and Protein Res. 48, 569-579 (1996).</li>
<li>Overview TopSpin NMR - Software for NMR Data Analysis and NMR Spectra Data Procession | Bruker Corporation [Internet]. , Bruker Corporation. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.bruker.com/products/mr/nmr/nmr-software/software/topspin">http://www.bruker.com/products/mr/nmr/nmr-software/software/topspin</a> (2013).</li>
<li>Aue, W. P., Bartholdi, E., Ernst, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2-Dimensionsl+spectroscopy-+application+to+nuclear+magnetic+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Phys%22%5BJournal%5D)">2-Dimensionsl spectroscopy- application to nuclear magnetic resonance.</a> J. Chem. Phys. 64, 2229-2246 (1976).</li>
<li>Bax, A., Davis, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MLEV-17-based+two-dimensional+homonuclear+magnetization+transfer+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Magn.+Reson%22%5BJournal%5D)">MLEV-17-based two-dimensional homonuclear magnetization transfer spectroscopy.</a> J. Magn. Reson. 65, 355-360 (1985).</li>
<li>Kumar, A., Ernst, R. R., Wüthrich, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+two-dimensional+nuclear+overhauser+enhancement+%282D+NO%29+experiment+for+the+elucidation+of+complete+proton-proton+cross-relaxation+networks+in+biological+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Comm%22%5BJournal%5D)">A two-dimensional nuclear overhauser enhancement (2D NO) experiment for the elucidation of complete proton-proton cross-relaxation networks in biological macromolecules.</a> Biochem. Biophys. Res. Comm. 95, 1-6 (1980).</li>
<li>Bax, A., Davis, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+aspects+of+two-dimensional+transverse+NOE+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Magn.+Reson%22%5BJournal%5D)">Practical aspects of two-dimensional transverse NOE spectroscopy.</a> J. Magn. Reson. 63, 207-213 (1985).</li>
<li>Williamson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+3+Applications+of+the+NOE+in+Molecular+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Reports+on+NMR+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">Chapter 3 Applications of the NOE in Molecular Biology.</a> Annu. Reports on NMR Spectroscopy. 65, 77-109 (2009).</li>
<li>Piotto, M., Saudek, V., Sklenar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradient-tailored+excitation+for+single-quantum+NMR-spectroscopy+of+aqueous+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+NMR%22%5BJournal%5D)">Gradient-tailored excitation for single-quantum NMR-spectroscopy of aqueous solutions.</a> J. Biomol. NMR. 2, 661-665 (1992).</li>
<li>Sparky - NMR Assignment Program. , Available from: 
	 <a target="_blank" href="http://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky">http://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky</a> (2008).</li>
<li>Wüthrich, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aW%C3%BCthrich%2C+K+%22NMR+of+proteins+and+nucleic+acids%22">NMR of proteins and nucleic acids</a>. , J. Wiley & Sons Inc. (1986).</li>
<li>Nilges, M., Kuszewski, J., Brünger, A. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNilges%2C+M+%22Comp.+aspects+study+biol.+macromol.+by+NMR%22">Comp. aspects study biol. macromol. by NMR</a>. , Plenum Press. (1991).</li>
<li>Koradi, R., Billeter, M., Wüthrich, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MOLMOL%3A+A+program+for+display+and+analysis+of+macromolecular+structures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Molecular+Graphics%22%5BJournal%5D)">MOLMOL: A program for display and analysis of macromolecular structures.</a> J. Molecular Graphics. 14, 51(1996).</li>
<li>Pettersen, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UCSF+chimera+-+A+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Computational+Chem%22%5BJournal%5D)">UCSF chimera - A visualization system for exploratory research and analysis.</a> J. Computational Chem. 25, 1605-1612 (2004).</li>
<li>Pearlmen, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMBER%2C+a+package+of+computer+programs+for+applying+molecular+mechanics%2C+normal+mode+analysis%2C+molecular+dynamics+and+free+energy+calculations+to+simulate+the+structural+and+energetic+properties+of+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Comp.+Phys%22%5BJournal%5D)">AMBER, a package of computer programs for applying molecular mechanics, normal mode analysis, molecular dynamics and free energy calculations to simulate the structural and energetic properties of molecules.</a> Comp. Phys. 91, 1-41 (1995).</li>
<li>Honig, B., Sharp, K., Yang, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macroscopic+models+of+aqueous+solutions-+biological+and+chemical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Macroscopic models of aqueous solutions- biological and chemical applications.</a> J. Phys. Chem. 97, 1101-1109 (1993).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תרומתו של מידע מבני להבנת מנגנוני הקישור מקובלת היטב. פפטידים שימושיים כמודלים לקשירת חלבונים ואינטראקציות; עם זאת, הם אינם מתאימים לשיטה העיקרית לקביעת מבנה, קריסטלוגרפיה בקרני רנטגן. תמ"ג שימושי במיוחד עבור מערכות אלה, מכיוון שניתן לפתור את המבנים בקלות בתמיסה. זה במיוחד במקרה של חיקוי מטאלוצ'פרון הדורשים בנוסף קביעת מבנה בסביבה אינרטית כדי למנוע חמצון של יון המתכת.
פפטיד MTCSGCSRPG, המכיל את מוטיב MT/HCXXC המשומר, קשור ל-Cu (I) כפי שניכר בשינוי המשמעותי של הספקטרום מצורת האפו לפפטיד המגיב ע...

פפטידים נמצאים בשימוש נרחב כמודלים של חלבונים, מובילי תרופות פוטנציאליים וסוכנים טיפוליים בפני עצמם. עם זאת, גודלם הקטן ומידת הגמישות הגבוהה שלהם מונעים לעתים קרובות קביעת מבנה על ידי קרני רנטגן עקב קשיים בהתגבשות.
תהודה מגנטית גרעינית (NMR) יכולה לשמש לקביעת מבנים ואינטראקציות של פפטידים. השיטה יכולה לתת מידע לגבי מבנה מקומי וכללי, אינטראקציות קשירה וזיקה נמוכה יותר, והיא ישימה לדגימות קשות מכיוון שניתן לעשות זאת במצב הפתרון.
הובלת נחושת במערכות ביולוגיות מושגת על ידי חלבוני נחושת מטלוצ'פרון תוך-תאיים הקושרים באופן ספציפי יוני Cu (I) ומעבירים אותם לחלבוני המטרה שלהם באמצעות סדרה של אינטראקציות חלבון-חלבון, כדי להגן על היונים מפני חמצון ולמנוע שחרור נחושת רעילה2-5. אתר הקישור מאופיין ברצף המשומר, MXH/TCXanyXanyC, שהוכח הן על ידי NMR והן על ידי קריסטלוגרפיה כקושר את ה-Cu (I) על ידי ליגנדות התיולטו הרכות של שתי שאריות הציסטאין, אם כי הוצע גם ליגנד חיצוני נוסף6-8. יחסי המבנה-תפקוד של חלבונים אלה היו נושא למחקר אינטנסיבי9.
במחקר המוצג כאן, סונתז מודל פפטיד הכולל את הרצף השמור של מטאלוצ'פרונים נחושת והגיב עם Cu (I) בסביבה אינרטית. הפרוטוקול המוצג מתאר את שלבי קביעת המבנה על ידי NMR, כולל הכנת דגימות, איסוף נתונים, עיבוד נתונים, יצירת מבנה וניתוח מבני. הניתוח נעשה בשני שלבים: ראשית נוצרו מבנים ללא מידע לגבי אופן הקישור של הפפטיד ליון הנחושת. לאחר שמצב הכריכה נקבע באופן אמפירי, אילוצים אלה הוצגו כדי לספק מבנה ברזולוציה גבוהה. אופן הכריכה הוא הנקודה המהותית במודל ולכן נקבע באופן בלתי משוחד.
הקביעה המבנית של NMR של פפטידי מודל היא טכניקה בעלת ערך רב המשמשת לעתים קרובות כימאים וביולוגים. ניתן ליישם אותו בקלות יחסית על פפטידים שונים בתנאים שונים, ובכך עשוי לשפוך אור על מנגנונים רלוונטיים10. הבנת תהליך הבהרת המבנה מספקת הבנה טובה יותר של נקודות החוזק והחולשה של המבנים המוצעים.

<table><tbody><tr><td>Avance DMX 600 MHz ספקטרומטר</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NMR צינורות דגימה&nbsp;</td>תא כפפות <td>Wilmad</td><td>535-PP</td><td></td></tr><tr><td></td><td>MBraun</td><td>LM05-019</td><td></td></tr><tr><td>ליופילייזר&nbsp; &nbsp;</td><td>VirTis</td><td>benchtopK</td><td></td></tr><tr><td>Peptide</td><td>BioChemia</td><td>בהתאמה אישית</td><td>>95% טוהר</td></tr><tr><td>נחושת (1) כלוריד</td><td>Aldrich</td><td>224332</td><td></td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית</td><td>BioLab</td><td>231-595-7</td><td></td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד</td><td>גדות</td><td>1310-73-2</td><td></td></tr><tr><td>d6-Dimethylsulfoxide</td><td>Aldrich</td><td>236926</td><td></td></tr><tr><td>תחמוצת דאוטריום</td><td>Aldrich</td><td>151882</td><td></td></tr></tbody></table>

קביעת מבנה וקואורדינציה של קומפלקסים של פפטיד-מתכת באמצעות תמ"ג 1d ו-2d 1h

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

קשירת נחושת (I) על ידי חלבוני הובלת מטאלוצ'פרון מונעת חמצון נחושת ושחרור היונים הרעילים שעלולים להשתתף בתגובות חמצון חיזור מזיקות. קומפלקס Cu (I) של מודל הפפטיד של חלבון מטאלוצ'פרון קושר Cu (I), הכולל את הרצף MTCSGCSRPG (מסומן בקו תחתון נשמר), נקבע בתמיסה בתנאים אינרטיים על ידי ספקטרוסקופיה של NMR.
NMR היא טכניקה מקובלת לקביעת מבני תמיסה של חלבונים ופפטידים. בשל הקושי בהתגבשות לספק גבישים בודדים המתאימים לקריסטלוגרפיה של קרני רנטגן, טכניקת ה-NMR היא בעלת ערך רב, במיוחד מכיוון שהיא מספקת מידע על מצב הפתרון ולא על המצב המוצק. כאן אנו מתארים את כל השלבים הנדרשים לקביעת מבנה תלת מימדי מלא על ידי NMR. הפרוטוקול כולל הכנת דגימה בשפופרת NMR, איסוף ועיבוד נתונים חד-ממדיים ודו-ממדיים, הקצאת שיא ואינטגרציה, חישובי מכניקה מולקולרית וניתוח מבנה. חשוב לציין, הניתוח נערך לראשונה ללא קשרי מתכת-ליגנד מוגדרים מראש, כדי להבטיח קביעת מבנה אמינה בצורה בלתי מוטה.

כחלק ממחקר מתמשך של מודלים לחלבונים קושרי נחושת, נקבע באמצעות NMR במצב תמיסה המבנה של הרצף השמור MT/HCXXC בתוך הפפטיד הליניארי MTCSGCSRPG. הפפטיד הגיב עם CuCl בסביבה אינרטית, וה-pH נמדד כ-3.0 באמצעות מד pH רב-שימושי. אזור האמידים של הפפטיד הראה התרחבות בעקבות התגובה עם נחושת, מ-6.7-8.5 ל-6.6-9.0 ppm (איור 2). הרחבת קווים עקב חמצון קל של נחושת ניכרת בקו הבסיס.
דגימת הפפטיד שהגיבה עם הנחושת הייתה יציבה לאורך זמן (איור 7) והספקטרה היו בעלות רזולוציה טובה (<strong...

נקבע מבנה תמיסת ה-NMR של פפטיד מודל מטאלוצ'פרון עם Cu (I), ומתואר פרוטוקול מפורט מהכנת דגימה ואיסוף נתונים חד-ממדיים ודו-ממדיים למבנה תלת מימדי.

קביעת מבנה וקואורדינציה של קומפלקסים של פפטיד-מתכת באמצעות תמ"ג 1D ו-2D 1H

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לקבוע את המבנה של פפטיד חיקוי של חלבון Metallo chaperone במתחם עם נחושת. דבר זה מושג תחילה על ידי הכנת הדגימה בסביבה נטולת חמצן. השלב השני הוא רכישת נתוני תהודה מגנטית גרעינית או ספקטרוסקופיית NMR המראים אינטראקציות בין אטומי מימן.בשלב הבא, האינטראקציות המרחביות ממופות על תבנית פפטידית ליניארית. השלב הסופי הוא מציאת מבנה מייצג בעל אנרגיה נמוכה המתאים לנתונים. בסופו של דבר, מבנים המופקים מ-NMR משמשים לקביעת אופן הקישור ולביצוע ניתוח מבני של הקומפלקס הקשור לנחושת.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני טכניקות קיימות, כגון קריסטלוגרפיית קרני X, הוא שניתן להשתמש בה כדי לבחון קומפלקסים בעלי קישור חלש, וכן מולקולות וקומפלקסים שאינם מתגבשים. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי חלבונים קושרי נחושת, ניתן ליישמה גם על מערכות אחרות, כגון חלבוני נשאים (chaperones) של מתכות אחרות, כדי לחקור כיצד חלבונים מאפשרים הובלה בטוחה של יוני מתכת חיוניים, אך פוטנציאליים לרעילות, בסביבת קו התאים.כדי להתחיל, יש להכין את הדגימות בסביבה נטולת חמצן כדי למנוע חמצון של הנחושת. להכנת דגימת ה-APO, המיסו כ-1 עד 2 מיליגרם של הפפטיד ב-450 עד 500 µL של ממס בדרגת NMR דאוטרי. עבור הדגימה שקיבלה נחושת, המיסו את אותה כמות של פפטיד יחד עם כמות מולרית שווה של מלח מתכת ב-450 עד 500 µL של ממס ה-NMR. סננו כל תמיסה באמצעות נייר סינון מזכוכית סנטריפוגית או בכל טכניקה אחרת המתאימה לתרכובות הנחקרות ואינה סופחת אותן. שלב זה חיוני להסרת חלקיקים מתכתיים, אשר ישפיעו על ההומוגניות.העבירו את התמיסות למבחנות NMR וסגרו את הדגימות בתוך המבחנות. לפני היציאה מתא הכפפות, הוציאו את הדגימות מתא הכפפות ואטמו אותן. רשמו את ספקטרום הפרוטון החד-ממדי של דגימות ה-APO והדגימות שהגיבו עם נחושת במכשיר ה-NMR והשוו ביניהן.הפפטיד APO הוא גמיש ומציג ממוצע של קונפורמציות, אך בעקבות תגובה עם נחושת, לאמידים של הפפטיד הקשור יש מבנה קשיח יותר. לכן, ספקטרום ה-NMR של הפפטיד המכיל נחושת אמור להראות שינוי משמעותי בהסחה הכימית באזור האמיד, והפיקים עשויים להפוך למובחנים. הגדירו ניסויי COSY, TOCSY, NOESY או ROESY מותאמים בתנאים זהים לאלו המתוארים בפרוטוקול הטקסט והריצו אותם ברצף.בצעו ניסויי מימד אחד בין ניסוי לניסוי כדי לוודא שהרכב הדגימה נותר קבוע לאורך רכישת הנתונים. לאחר עיבוד הנתונים כפי שסוכם בפרוטוקול הכתוב, הכינו סדרה של ספקטראי COSY ו-TOCSY המונחים על גבי ספקטרום ה-NOESY וה-ROSY. זאת כדי לשייך את כל פיקי ה-NOE בספקטרום.התחילו בהקצאת שיאים החופפים לאותים רעילים באזור טביעת האצבע. מכיוון שפעולה זו תקל על רישומי הקצאת שיאים עוקבים בתוכנית Sparky, רשמו את השיאים שהוקצו, תרגמו את ערכי הצימוד של H alpha לאמיד בחלבון לזוויות דיהדרליות. כמו כן, תרגמו שיאים לאילוצי מרחק באמצעות אינטגרציה של השיאים בתוך התוכנית ותרגומם באמצעות אינטראקציה במרחק ידוע.אם הפסגות חופפות או שלא ניתן להשתמש בשיטות אינטגרציה אוטומטיות, ניתן לסמן את הפסגות כחזקות, בינוניות, חלשות או חלשות מאוד באמצעות הערכה ויזואלית, וניתן לתרגם הגדרות אלו למרחקים של עד 2.5, 3.5, 4.5 ו-5.5 אנגסטרמים בהתאמה. ייבאו את אילוצי המרחקים והזוויות הדיהדרליות בפורמט הנכון עבור explore. תוכנת explore תסרוק את המרחב הקונפורמציוני כדי למצוא מבנים התואמים לגאומטריה כימית קנונית.בנוסף למגבלות המרחק שנמצאו ניסויית, כדי ליצור אנסמבל שבו אף אחד מהפרמטרים הללו אינו מופר. זה יהווה את האנסמבל ההתחלתי. בצע את הרצה הראשונה של קביעת המבנה ללא שימוש במגבלות כלשהן למתכת, כדי למצוא אילו שאריות משתתפות בקישור למתכת ללא הטיות.הנח את האילוצים באופן הדרגתי כדי להקל על זיהוי טעויות בהשמה, כמו גם בפרמטרי אנרגיית NOE וכריעה סימולטיבית (simulated kneeling) כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט, לפני מזעור המבנים באמצעות מזעור אנרגיה בשיטת הגרדיאנט הצמוד (conjugate gradient) למשך 4,000 איטרציות. צור מאסף (ensemble) סופי המורכב בדרך כלל מ-50 חברים על ידי הכנסת אילוצים באופן איטרטיבי על פני כל המאסף, ודווח על מספר האינטראקציות מכל סוג של NOE שנמצאו. לבסוף, צור מאסף של מבנים העומדים בגיאומטריה כימית קנונית ובאילוצים האמפיריים שהופקו מ-NMR. דווח על המספר הכולל של הקונפורמציות, מספר הקונפורמציות שיש להן הפרות של האילוצים שהופקו מ-NMR, ועל ערכי ה-RMSD של המאסף כולו, כולל ערכי RMSD של השלד (backbone) ושל כל האטומים הכבדים.נתחו את אנסמבל האנרגיה הנמוכה וקבעו אילו שרשראות צד של שאריות נמצאות בקרבה נכונה אחת לשנייה כדי לאפשר קישור של יון המתכת. לאחר שנקבעו אלו, חזרו על הניתוח, כולל נתוני הקישור לנחושת. בנוסף לאילוצי המרחק שהופקו מ-NMR, הוסיפו כעת אילוצי קישור למתכת לשאריות שנקבעו.הוסיפו פרמטרים מתאימים לתיאור יון המתכת והטופולוגיה שלו. הזינו לקובץ הפרמטרים את המידע הפיזי המתאים, כגון מסה, אורכי קשר עם אטומים אחרים, זוויות ופרמטרים של דחייה לא-קושרת. הוסיפו את מידע הקשירה לקובץ הטופולוגיה.מידע זה כולל אילו קשרים נוצרו ונשברו, ואילו מטענים פורמליים השתנו כתוצאה מהקישור. לבסוף, השג מקבץ מבנים כפי שנעשה קודם לכן, שכן המקבץ הפתור מייצג את המרחב הקונפורמציוני שאומץ על ידי הפפטיד. במהלך מדידת ה-NMR, ייבא את כל הקונפורמציות של המבנה לתוכנת Mal Mall כדי ליצור מקבץ התחלתי.בחן את האנסמבל כדי לקבוע את היציבות המקומית של המולקולה. קבע את ערכי ה-RMSD של השלד (backbone) והשרשרת הצדדית על ידי בחירת אזורים של ארבעה שאריות עוקבות לאורך הרצף, והפעל את התוכנה לחישוב ה-RMSD ביחס למבנה בעל האנרגיה הנמוכה ביותר או לממוצע; קבע אילו אזורים במולקולה מראים יציבות מקומית באמצעות שרטוט ה-RMSD המקומי כפונקציה של הרצף, בצע חפיפה (overlay) של האנסמבל לאורך אזור זה של המולקולה והשתמש באנסמבל זה להמשך הניתוח. בחר קונפורמציות בעלות אנרגיה נמוכה העומדות באילוצים שהופקו מ-NMR.אלה יהוו את רשומת המכלול בעלות האנרגיה הנמוכה וידווחו על מספר האישורים במכלול, הקריטריונים לבחירתם וערכי ה-RMSD. אם אופן קישור המתכת טרם נקבע, נתח את המכלול בעלות האנרגיה הנמוכה וקבע אילו שרשראות צד של שאריות אינן נכונות. קרבה זו לזו תאפשר את קישור יון המתכת.השתמש ב-KYMERA כדי לקבוע מרחקים תוך-מולקולריים בין אטומים החשודים כקושרים מתכות. חשב את המרחקים הממוצעים באנסמבל לאחר שנקבעו אלו. חזור על הניתוח כולל נתוני קשירת הנחושת.בחן את האנסמבל וקבע את המבנה השניוני המקומי בתוך המולקולה באמצעות פרמטרי החיפוש ברירת המחדל של תוכנית ה-MAL mall. לאחר מכן, ייבא את האנסמבל ל-kymera. מבנים שניוניים נשמרים על ידי קשרי מימן ומצביעים על אזורים יציבים במולקולה.קבעו את קשירת המימן באמצעות כלי ה-kymera. המשיכו בניתוח המבני כפי שפורט בפרוטוקול הטקסטואלי. לאחר מכן, סכמו את כל הממצאים המבניים כדי להבין כיצד הם מחזקים זה את זה. כדי לחקור מודלים של חלבונים קושרים נחושת, נקבע המבנה של רצף הקשירה השמור של חלבון בתוך הפפטיד הליניארי הנגזר באמצעות NMR במצב תמיסה, כאשר אזור האמיד של הפפטיד היה בין 6.7 ל-8.5.PP M הראה התרחבות בעקבות תגובה עם נחושת ל-6.6 עד 9.0 PP M. הרחבת קווים עקב חמצון קל של הנחושת ניכרת בקו הבסיס. מוצג כאן חפיפה של אזורי טביעת האצבע של ספקטראי Roy Toxi ו-cozy של הפפטיד הקשור לנחושת. הדגימה הייתה יציבה לאורך זמן והספקטראים היו בעלי רזולוציה טובה והניבו 81 אינטראקציות NOE שנרכשו באמצעות ניסוי rosy.מכיוון שהמולקולה הראתה אינטראקציות NOE קרובות לאפס בניסוי NO C, המכלול של הפפטיד שהופק עבור הדגימה המגיבה, אך ללא שימוש באילוצים למתכת, הניב 47 מתוך 50 מבנים שאינם זהים עם ערכי RMSD של 1.44 ו-2.07 אנגסטרומים לשלד החלבון ולאטומים הכבדים, בהתאמה. מתוכם נבחרים 13 קונפורמרים בעלי אנרגיה נמוכה לניתוח נוסף, עם ערכי RMSD של 0.25 ו-0.61 אנגסטרומים לשלד החלבון ולאטומים הכבדים, בהתאמה. גרף ה-RMSD המקומי הראה אזור של יציבות בין השאריות השלישית והשביעית; בנוסף לאזור הקשיח של הקצה ה-C, הכולל שארית פרולין, אזור זה נמצא בקונפורמציה של כיפוף בין השאריות הרביעית והשביעית בכל הקונפורמציות.הקונפורמציה הכפופה מיוצבת על ידי קשרי מימן בין תורמי ומקבלי שלד הפפטיד בגליצין 5 ובגליצין 3, וכן בין ציסטאין 6 לציסטאין 3. כיפוף זה ניכר גם בציסטאין 3 ובסרין 7, כפי שמעידים ערכי הצימוד המופחיתים באזור זה. הקונפורמציות הונחו זו על זו באזור זה ונבחנו לאיתור שאריות קישור אפשריות, כאשר ציסטאין 3, ציסטאין 6 ומתיונין 1 נשקלו כשאריות קישור פוטנציאליות.המרחק הקצר ביותר בין אטומי גופרית היה בין קבוצות הפולאט של ציסטאין 3 וציסטאין 6; הוכנס קישור לנחושת והחישוב חזר על עצמו כדי להפיק את האנסמבל ששימש לניתוח. האנסמבל בעל האנרגיה הנמוכה של הפפטיד הקשור לנחוש מראה כי האמין בקצה הטרמינלי נמצא בסמיכות לנחושת הקשורה. מוצג כאן משטח השווי (isosurface) של התפלגות הפוטנציאל האלקטרוסטטי, כאשר פוטנציאל חיובי מוצג בכחול ופוטנציאל שלילי מוצג באדום.שאריד הארגינין בולט מהשלד של הפפטיד ויוצר אונה חיובית של פוטנציאל אלקטרוסטטי, בעוד שפחמני השלד מסודרים בקו היוצר פוטנציאל אלקטרוסטטי שלילי פחות בולט. לאחר רכישת המיומנות, ניתן לבצע קביעה מבנית בתוך כשבוע של זמן NMR ומספר ימים נוספים של עיבוד נתונים, כדי להשיג מאהיל של קונפורמציות שניתן להשתמש בהן לניתוח מבני. בעקבות הליך זה, ניתן לנתח מוטציות פפטידיות אחרות ותנאים שונים כדי לענות על שאלות נוספות הנוגעות לתנאים הדרושים לדרגות שונות של קישור ושחרור של יון הנחושת.

structure-coordination-determination-peptide-metal-complexes-using-1d

Research

JoVE Journal

Chemistry

כימיה

קביעת מבנה ותאום של קומפלקסים של פפטיד-מתכת באמצעות 1D ו-2D 1H NMR

פרוטוקול זה מתאר את השימוש של תגובות צימוד אמיד של חומצה וdiaminoalkanes isonicotinic כדי ליצור ligands הגישור המתאים לשימוש בסינתזה של מתחמי פלטינה multinuclear, המשלבים היבטים של התרופות נגד סרטן BBR3464 וpicoplatin.

תגובה אמידה צימוד לסינתזה של ligands מבוסס Bispyridine וcomplexation לפלטינה כסוכנים נגד סרטן Dinuclear

מתחמי phosphine רותניום נמצאים בשימוש נרחב לתגובות קטליטי הומוגנית כמו hydrogenations. הסינתזה של סדרה של מתחמי רותניום tridentate רומן נושאות יגנד N -triphos N (CH 2 PPH 2) 3 מדווחת. בנוסף, התגובה של stoichiometric מורכב dihydride Ru- -triphos N עם חומצת levulinic מתוארת.

הסינתזה, אפיון ותגובתיות של סדרה של רותניום<em&gt; N</em&gt; -triphos<sup&gt; Ph</sup&gt; מכלולים

מאמר זה מתאר בנייה של סדרה של אשכולות על-מולקולריים הקשורים למימן בגבישים באמצעות אמוניום טריפנילאצטטים ראשוניים, המתגבשים מחדש מממיסים לא קוטביים. בנייה סלקטיבית זו של האשכולות העל-מולקולריים מובילה למחקרים סימטריים שיטתיים יעילים על מתאם בין הצבירים העל-מולקולריים למרכיביהם.

בינוי שיטתי סימטריים מחקרים של סדרה של אשכולות מולקולריים עם Triphenylacetates בינארי או המשולש אמוניום

מוצג האפיון של קומפלקסים שנוצרו ביחסים יחסיים שונים של כספית (II) לטטרפפטידים של דיציסטיניל על ידי יינון אלקטרו-ספריי, ספקטרומטריית מסה אורביטראף.

חקר complexation של מרקורי (II) עם Dicysteinyl Tetrapeptides ידי Ionization electrospray ספקטרומטריית המסה

מבנים של חלבון סופרא מולקולרית הרכבות ברזולוציה אטומית הם רלוונטיות גבוהה בשל התפקידים מכריע שלהם במגוון רחב של תופעות ביולוגיות. במסמך זה, אנו מציגים פרוטוקול לבצע מחקרים מבניים ברזולוציה גבוהה על הרכבות לא מסיסים, הבלתי גבישי החלבון macromolecular על-ידי קסם-זווית ספינינג ספקטרוסקופיה של מצב מוצק תהודה מגנטית גרעינית (MAS SSNMR).

מחקרים מבניים אטומי בקנה מידה של הרכבות Macromolecular על ידי תהודה מגנטית גרעינית solid-state ספקטרוסקופיה

ציסטאין עתירי פפטידים מקפלים לתוך מבנים תלת מימדיים נפרדות בהתאם שלהם קישוריות דיסולפידי. יישוב סינתזה של isomers דיסולפידי הפרט נדרש כאשר מאגר חמצון לא תוביל קישוריות דיסולפידי הרצוי. הפרוטוקול עוסק הסינתזה סלקטיבי של פפטידים 3 דיסולפידי-בונדד וניתוח מבניים שלהם באמצעות מחקרים NMR ו- MS/MS.

סינתזה וקביעת מבנה ממוצע-Conotoxin Isomers PIIIA עם Connectivities דיסולפידי שונים

הקבוצה החדשה של זרז מתכת לתזה מוכנה על ידי השתלת מתחם מתכת אמין על סיליקה הידרולטית. שברי מתכת פני השטח מאופיינים באמצעות FT-IR, מיקרואנליזה אלמנטלים, וספקטרוסקופיית NMR מוצק. עוד משטח הקיטוב הגרעיני הדינמי משופרת ניסויים ספקטרוסקופיית משלימים את הנחישות של כדור התיאום.

Imine מטאפיתזה על ידי הזרזים התומכים בסיליקה באמצעות מתודולוגיה של כימיה אורגנומתכתית של פני השטח

בניידות המסה-הספקטרומטר ההמוני וטכניקות הדוגמנות המולקולריות ניתן לאפיין את ביצועי המתכת הסלקטיבית של הפפטידים העשויים מתכת-כריכה ומתיונין-הנחושת המטאוקובטין. פיתוח מחלקות חדשות של פפטידים מתכת הכלפת יסייע להוביל לtherapeutics עבור מחלות הקשורות באיזון מתכת ביון.

שיטות לקביעת מבנה ומנגנונים של זיהוי יון מתכת וחמצון פעילות של כריכת מתכת Oligopeptides

הכנת של sns לקחיים קובלט (II) דגמי מתחמים של אלכוהול הכבד דהידרוגנאז מוצג כאן. התסביכים יכול להיות מוכן על ידי התגובה ליקודמן עם cocl2· 6h2O ולאחר מכן יכול להיות recrystallized על ידי מתן המאפשר דיאתיל אתר לפזר לאט לפתרון acetonitrile המכיל את מתחם קובלט.

הכנת SNS קובלט (II) מכלולי מודל מודלים של הכבד אלכוהול דהידרוגנאז

ניתוח צורת קו של ספקטרום NMR שנאסף על פני טווח טמפרטורות משמש כמדריך לסידור מחדש של אטומי קואורדינציה-כדור פנימיים בקומפלקס כיראלי, בעל שמונה קואורדינטות, רניום(V) פוליהידריד, ReH5(PPh3)2(sec-butyl amine). ניתוח צורת קו משמש גם כדי לקבוע את פרמטרי ההפעלה ΔH‡, ΔS‡ ו- ΔG‡ עבור סידור מחדש של אטומים.

ניתוח צורת קו של ספקטרום NMR דינמי לאפיון סידור מחדש של כדור קואורדינציה בקומפלקס כיראלי רניום פוליהידריד

חקור את מבנה הקומפלקס של פפטיד-מתכת עם נחושת באמצעות ספקטרוסקופיית תמ"ג. הפרוטוקול כולל הכנת דגימה בסביבה נטולת חמצן, איסוף נתונים וניתוח מבני מפורט.

קביעת מבנה וקואורדינציה של קומפלקסים של פפטיד-מתכת באמצעות תמ"ג 1D ^{ו-2D 1}H

גלה סרטונים נוספים