קביעת מבנה וקואורדינציה של קומפלקסים של פפטיד-מתכת באמצעות תמ"ג 1D ^{ו-2D 1}H

המטרה הכוללת של הליך זה היא לקבוע את המבנה של פפטיד חיקוי של חלבון צ'פרון מטאלו המורכב עם נחושת. זה מושג על ידי הכנת הדגימה תחילה בסביבה נטולת חמצן. השלב השני הוא רכישת נתוני התהודה המגנטית הגרעינית או ספקטרוסקופיה NMR המציגים אינטראקציות בין אטומי מימן.

לאחר מכן, האינטראקציות המרחביות ממופות על תבנית פפטיד ליניארית. השלב האחרון הוא למצוא מבנה מייצג של אנרגיה נמוכה שמתאים לנתונים. בסופו של דבר, מבנים שמקורם ב-NMR משמשים לקביעת אופן הכריכה ולביצוע ניתוח מבני על קומפלקס הנחושת.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני טכניקות קיימות כמו קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן, הוא שניתן להשתמש בה כדי להסתכל על קומפלקסים של קשירה שבועית וגם על מולקולות וקומפלקסים שאינם מתגבשים. אם כי שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי חלבונים קושרי נחושת. ניתן ליישם אותו גם על מערכות אחרות כגון חלקי מתכת אחרים כדי לחקור כיצד חלבונים מאפשרים אספקה בטוחה של יוני מתכת חיוניים, אך רעילים פוטנציאליים בסביבת קו התא.

כדי להתחיל, הכינו דגימות בסביבה נטולת חמצן כדי למנוע מהנחושת להתחמצן, כדי להכין את דגימת ה-APO, יש להמיס כ-1 עד 2 מיליגרם של הפפטיד ב-450 עד 500 מיקרוליטר של ממס בדרגת תמ"ג מפוטר עבור הדגימה המגיבה בנחושת, להמיס את אותה כמות כמו פפטיד ה-APO עם כמות מולרית EQU של מלח מתכת ב-450 עד 500. מיקרוליטרים של ממס NMR מסננים כל תמיסה באמצעות נייר סינון זכוכית מרכזית או כל טכניקה אחרת המתאימה לתרכובות הנחקרות ואינה סופגת אותן. זה חיוני כדי להסיר חלקיקים מתכתיים, שישפיעו על ההומוגניות.

מעבירים את התמיסות לצינורות NMR וסוגרים את הדגימות בצינורות. לפני היציאה מתא הכפפות, הוציאו את הדגימות מתא הכפפות ואטמו אותן. רשום את ספקטרום הפרוטונים החד-ממדי של דגימות ה-APO והנחושת במכונת ה-NMR והשוואה.

פפטיד ה-APO גמיש ומציג ממוצע של אישורים, אך בתגובה עם נחושת, לאמידים הפפטידים הקשורים יש מבנה קשיח יותר. לכן, ספקטרום הפפטידים המכיל נחושת אמור להראות שינוי משמעותי בשינוי הכימי באזור האמיד, והפסגות עשויות להיפתר. הגדר ניסויי תמ"ג אופטימליים, נעימים, חטטניים או ורודים בתנאים זהים כמתואר בפרוטוקול הטקסט והפעל ברצף.

הפעל ניסויים חד-ממדיים בין כל ניסוי כדי לוודא שהרכב הדגימה נשאר קבוע לאורך כל רכישת הנתונים. לאחר עיבוד הנתונים כפי שנדון בפרוטוקול הטקסט, הכינו סט של ספקטרום נעים וספקטרום על הספקטרום הוורוד. להקצות את כל פסגות ה-NOE בספקטרום.

התחל בהקצאת פסגות החופפות לאותות רעלן באזור טביעת האצבע. מכיוון שזה יקל על ערכי הקצאת השיא הבאים עם רשומת תוכנית Sparky, הפסגות שהוקצו מתרגמות ערכי צימוד של H אלפא לחלבון אמיד לזוויות דדאל. תרגם גם פסגות לאילוצי מרחק על ידי שילוב הפסגות מתוך התוכנית ותרגום שלהן באמצעות אינטראקציה של מרחק ידוע.

אם הפסגות חופפות או שלא ניתן להשתמש בשיטות אינטגרציה אוטומטיות, ניתן לתייג את הפסגות כחזקות, בינוניות, חלשות או חלשות מאוד על ידי הערכה חזותית, וניתן לתרגם את הכינויים הללו למרחקים של עד 2.5, 3.5, 4.5 ו-5.5 אנגסטרומים בהתאמה. בייבוא אילוצי המרחק וזוויות הדדל עם הפורמט הנכון לחקירה. Explore יחפש מרחב אישור כדי למצוא מבנים הנצמדים לגיאומטריה כימית קנונית.

בנוסף לאילוצי המרחק שנמצאו בניסוי ליצירת אנסמבל שבו אף אחד מהפרמטרים הללו אינו מופר. זה יהווה את ההרכב הפותח. בצע את ריצת קביעת המבנה הראשונה מבלי להשתמש באילוצים כלשהם למתכת כדי למצוא אילו שאריות משתתפות בכריכת מתכת ללא כל הטיה.

הציגו את האילוצים בהדרגה כדי להקל על זיהוי טעויות בהקצאה כמו גם אנרגיית NOE ופרמטרים מדומים של כריעה כמתואר בפרוטוקול הטקסט לפני מזעור המבנים באמצעות מזעור אנרגיית שיפוע מצומד עבור 4,000 איטרציות, צור הרכב סופי של בדרך כלל 50 חברים המבצעים הצגת אילוצים בצורה איטרטיבית על כל האנסמבל מדווח על המספר של כל סוג של אינטראקציה NOE שנמצאה. לבסוף, צור אנסמבל של מבנים הנצמדים לגיאומטריה כימית קאנונית ולדוח האילוצים הנגזרים מ-NMR האמפירי. המספר הכולל של האישורים, מספר אלה שיש להם הפרות של אילוצי NM Rived וה-RMSD של ההרכב כולו, כולל גם עמוד השדרה וגם כל ערכי ה-RMSD של האטומים הכבדים.

נתח את הרכב האנרגיה הנמוכה וקבע אילו שרשראות צד שאריות נמצאות בסמיכות נכונה זו לזו כדי להיות מסוגלות לקשור את יון המתכת. לאחר שנקבעו, חזור על הניתוח, כולל נתוני קשירת הנחושת. בנוסף לאילוצי המרחק הנגזרים מ-NMR, הוסף כעת אילוצי קשירת מתכת לשאריות שנקבעו.

הוסף פרמטרים מתאימים לתיאור יון המתכת והטופולוגיה שלו. הזן את המידע הפיזיקלי המתאים כגון אורכי קשר מסה עם אטומים אחרים, זוויות ופרמטרי דחייה שאינם קושרים לקובץ הפרמטרים. הוסף את מידע האיגוד לקובץ הטופולוגיה.

מידע זה כולל אילו קשרים נוצרים ונשברים, ואילו חיובים פורמליים משתנים כתוצאה מהכריכה. לבסוף, רכוש אנסמבל של מבנים כמו לפני שהאנסמבל שנפתר מייצג את מרחב האישור שאומץ על ידי הפפטיד. במהלך מדידת התמ"ג, ייבא את כל האישורים של המבנה לתוכנית Mal Mall כדי ליצור הרכב התחלתי.

לבחון את ההרכב כדי לקבוע את היציבות המקומית של המולקולה. קבע את ערכי ה-RMSD של עמוד השדרה והשרשרת הצדדית על ידי בחירת ארבעת אזורי השאריות הבאים לאורך הרצף ובקשת התוכנית לחשב את ה-RMSD למבנה האנרגיה הנמוך ביותר או לממוצע, לקבוע אילו אזורים של המולקולה מראים יציבות מקומית על ידי התוויית ה-RMSD המקומי כפונקציה של רצף, שכב את האנסמבל לאורך אזור זה של המולקולה והשתמש בהרכב זה לניתוח נוסף. בחר אישורי אנרגיה נמוכה הנצמדים לאילוצים הנגזרים מהתמ"ג.

אלה יהוו את רשומת אנסמבל האנרגיה הנמוכה וידווחו על מספר האישורים בהרכב, הקריטריונים לבחירתם וערכי RMSD. אם מצב כריכת המתכת טרם נקבע, נתח את הרכב האנרגיה הנמוכה וקבע אילו שרשראות צד שאריות אינן נכונות. קרבה זה לזה כדי להיות מסוגלים לקשור את יון המתכת.

השתמש ב-KYMERA כדי לקבוע מרחקים תוך-מולקולריים בין אטומים החשודים כקשירת מתכות. חשב את המרחקים הממוצעים בהרכב לאחר שנקבעו. חזור על הניתוח כולל נתוני קשירת הנחושת.

לבחון את ההרכב ולקבוע את המבנה המשני המקומי בתוך המולקולה באמצעות פרמטרי החיפוש המוגדרים כברירת מחדל של תוכנית MAL mall. לאחר מכן, ייבא את האנסמבל לקימרה. מבנים משניים מוחזקים על ידי קשרי מימן ומצביעים על אזורים יציבים של המולקולה.

קבע את קשירת המימן באמצעות כלי הקימרה. המשך ניתוח מבני כמפורט בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן סכם את כל הממצאים המבניים כדי לחשוף כיצד הם מחזקים זה את זה כדי לחקור מודלים של חלבון קושר נחושת, מבנה רצף הקישור השמור של חלבון בתוך הפפטיד הליניארי הנגזר נקבע על ידי מצב תמיסה NMR, אזור האמיד של הפפטיד בין 6.7 ל -8.5.

PP M הראה התרחבות בתגובה עם נחושת ל-6.6 עד 9.0 PP M. התרחבות הקו עקב חמצון נחושת קל ניכרת בקו הבסיס. מוצגת כאן שכבת-על של אזורי טביעות האצבע של Roy Toxi וספקטרום נעים של הפפטיד הקשור בנחושת. הדגימה הייתה יציבה עם הזמן והספקטרום נפתר היטב ונתן 81 אינטראקציות NOE שנרכשו על ידי ניסוי ורוד.

מכיוון שהמולקולה נתנה כמעט אפס אינטראקציות NOE בניסוי NO C, הרכב הפפטיד שנגזר עבור הדגימה המגיבה, אך ללא אילוצים למתכת נתן 47 מתוך 50 מבנים לא עם ערך RMSD של 1.44 ו-2.07 אנגסטרומים על עמוד השדרה והאטומים הכבדים בהתאמה. מתוכם, 13 קונפורמרים באנרגיה נמוכה נבחרו לניתוח נוסף עם ערכי RMSD של 0.25 ו-0.61 אנגסטרומים על עמוד השדרה והאטומים הכבדים בהתאמה. תרשים ה-RMSD המקומי הראה אזור יציבות בין שאריות שלוש לשבע בנוסף לאזור הטרמינל הקשיח C, כולל שאריות פרולן, אזור זה נמצא באישור כיפוף בין שאריות ארבע ושבע בכל האישורים.

אישור הכיפוף מיוצב על ידי קשר מימן בין תורמי עמוד השדרה למקבלי גליצין חמש ושלושה אנין שתיים, כמו גם ציסטאין שש וציסטאין שלוש. עיקול זה ניכר גם בציסטין שלוש וסינוס שבע על ידי ערכי הצימוד המופחתים באזור זה. האישורים הונחו על גבי אזור זה ונותחו עבור שאריות קשירה אפשריות כאשר בוחנים ציסטין 3, ציסטין 6 ומתיונין 1 כשאריות קשירה פוטנציאליות.

המרחק הקצר ביותר בין גופרית לאטומי גופרית היה זה שבין קבוצות החומצה הפולית של ציסטאין 3 וציסטאין 6, הוכנס קשירת נחושת והחישוב חזר על עצמו כדי לתת את ההרכב המשמש לניתוח. אנסמבל האנרגיה הנמוכה של הפפטיד הקשור לנחושת מראה כי האמין הסופי קרוב לנחושת הקשורה מוצג כאן איזופני השטח של התפלגות הפוטנציאל האלקטרוסטטי עם פוטנציאל חיובי המוצג בכחול ופוטנציאל שלילי מוצג באדום.

שאריות הארגינין משתרעות מעמוד השדרה של הפפטיד ויוצרות אונה חיובית של פוטנציאל אלקטרוסטטי, ואילו תפוקות הפחמן של עמוד השדרה מסודרות בקו היוצר פוטנציאל אלקטרוסטטי שלילי פחות בולט לאחר השליטה, ניתן לבצע קביעה מבנית תוך כשבוע של זמן NMR ועוד כמה ימים של עבודה על מנת לקבל אנסמבל של אישורים שניתן להשתמש בהם לניתוח מבני. בעקבות הליך זה, ניתן לנתח מוטנים פפטידים אחרים ומצבים שונים על מנת לענות על שאלות נוספות המתייחסות לתנאים הנדרשים לדרגות שונות של קשירה ושחרור של יון הנחושת.