קביעת מבנה וקואורדינציה של קומפלקסים של פפטיד-מתכת באמצעות תמ"ג 1D ^{ו-2D 1}H

המטרה הכללית של הליך זה היא לקבוע את המבנה של פפטיד חיקוי של חלבון Metallo chaperone במתחם עם נחושת. דבר זה מושג תחילה על ידי הכנת הדגימה בסביבה נטולת חמצן. השלב השני הוא רכישת נתוני תהודה מגנטית גרעינית או ספקטרוסקופיית NMR המראים אינטראקציות בין אטומי מימן.

בשלב הבא, האינטראקציות המרחביות ממופות על תבנית פפטידית ליניארית. השלב הסופי הוא מציאת מבנה מייצג בעל אנרגיה נמוכה המתאים לנתונים. בסופו של דבר, מבנים המופקים מ-NMR משמשים לקביעת אופן הקישור ולביצוע ניתוח מבני של הקומפלקס הקשור לנחושת.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני טכניקות קיימות, כגון קריסטלוגרפיית קרני X, הוא שניתן להשתמש בה כדי לבחון קומפלקסים בעלי קישור חלש, וכן מולקולות וקומפלקסים שאינם מתגבשים. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי חלבונים קושרי נחושת, ניתן ליישמה גם על מערכות אחרות, כגון חלבוני נשאים (chaperones) של מתכות אחרות, כדי לחקור כיצד חלבונים מאפשרים הובלה בטוחה של יוני מתכת חיוניים, אך פוטנציאליים לרעילות, בסביבת קו התאים.

כדי להתחיל, יש להכין את הדגימות בסביבה נטולת חמצן כדי למנוע חמצון של הנחושת. להכנת דגימת ה-APO, המיסו כ-1 עד 2 מיליגרם של הפפטיד ב-450 עד 500 µL של ממס בדרגת NMR דאוטרי. עבור הדגימה שקיבלה נחושת, המיסו את אותה כמות של פפטיד יחד עם כמות מולרית שווה של מלח מתכת ב-450 עד 500 µL של ממס ה-NMR. סננו כל תמיסה באמצעות נייר סינון מזכוכית סנטריפוגית או בכל טכניקה אחרת המתאימה לתרכובות הנחקרות ואינה סופחת אותן. שלב זה חיוני להסרת חלקיקים מתכתיים, אשר ישפיעו על ההומוגניות.

העבירו את התמיסות למבחנות NMR וסגרו את הדגימות בתוך המבחנות. לפני היציאה מתא הכפפות, הוציאו את הדגימות מתא הכפפות ואטמו אותן. רשמו את ספקטרום הפרוטון החד-ממדי של דגימות ה-APO והדגימות שהגיבו עם נחושת במכשיר ה-NMR והשוו ביניהן.

הפפטיד APO הוא גמיש ומציג ממוצע של קונפורמציות, אך בעקבות תגובה עם נחושת, לאמידים של הפפטיד הקשור יש מבנה קשיח יותר. לכן, ספקטרום ה-NMR של הפפטיד המכיל נחושת אמור להראות שינוי משמעותי בהסחה הכימית באזור האמיד, והפיקים עשויים להפוך למובחנים. הגדירו ניסויי COSY, TOCSY, NOESY או ROESY מותאמים בתנאים זהים לאלו המתוארים בפרוטוקול הטקסט והריצו אותם ברצף.

בצעו ניסויי מימד אחד בין ניסוי לניסוי כדי לוודא שהרכב הדגימה נותר קבוע לאורך רכישת הנתונים. לאחר עיבוד הנתונים כפי שסוכם בפרוטוקול הכתוב, הכינו סדרה של ספקטראי COSY ו-TOCSY המונחים על גבי ספקטרום ה-NOESY וה-ROSY. זאת כדי לשייך את כל פיקי ה-NOE בספקטרום.

התחילו בהקצאת שיאים החופפים לאותים רעילים באזור טביעת האצבע. מכיוון שפעולה זו תקל על רישומי הקצאת שיאים עוקבים בתוכנית Sparky, רשמו את השיאים שהוקצו, תרגמו את ערכי הצימוד של H alpha לאמיד בחלבון לזוויות דיהדרליות. כמו כן, תרגמו שיאים לאילוצי מרחק באמצעות אינטגרציה של השיאים בתוך התוכנית ותרגומם באמצעות אינטראקציה במרחק ידוע.

אם הפסגות חופפות או שלא ניתן להשתמש בשיטות אינטגרציה אוטומטיות, ניתן לסמן את הפסגות כחזקות, בינוניות, חלשות או חלשות מאוד באמצעות הערכה ויזואלית, וניתן לתרגם הגדרות אלו למרחקים של עד 2.5, 3.5, 4.5 ו-5.5 אנגסטרמים בהתאמה. ייבאו את אילוצי המרחקים והזוויות הדיהדרליות בפורמט הנכון עבור explore. תוכנת explore תסרוק את המרחב הקונפורמציוני כדי למצוא מבנים התואמים לגאומטריה כימית קנונית.

בנוסף למגבלות המרחק שנמצאו ניסויית, כדי ליצור אנסמבל שבו אף אחד מהפרמטרים הללו אינו מופר. זה יהווה את האנסמבל ההתחלתי. בצע את הרצה הראשונה של קביעת המבנה ללא שימוש במגבלות כלשהן למתכת, כדי למצוא אילו שאריות משתתפות בקישור למתכת ללא הטיות.

הנח את האילוצים באופן הדרגתי כדי להקל על זיהוי טעויות בהשמה, כמו גם בפרמטרי אנרגיית NOE וכריעה סימולטיבית (simulated kneeling) כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט, לפני מזעור המבנים באמצעות מזעור אנרגיה בשיטת הגרדיאנט הצמוד (conjugate gradient) למשך 4,000 איטרציות. צור מאסף (ensemble) סופי המורכב בדרך כלל מ-50 חברים על ידי הכנסת אילוצים באופן איטרטיבי על פני כל המאסף, ודווח על מספר האינטראקציות מכל סוג של NOE שנמצאו. לבסוף, צור מאסף של מבנים העומדים בגיאומטריה כימית קנונית ובאילוצים האמפיריים שהופקו מ-NMR. דווח על המספר הכולל של הקונפורמציות, מספר הקונפורמציות שיש להן הפרות של האילוצים שהופקו מ-NMR, ועל ערכי ה-RMSD של המאסף כולו, כולל ערכי RMSD של השלד (backbone) ושל כל האטומים הכבדים.

נתחו את אנסמבל האנרגיה הנמוכה וקבעו אילו שרשראות צד של שאריות נמצאות בקרבה נכונה אחת לשנייה כדי לאפשר קישור של יון המתכת. לאחר שנקבעו אלו, חזרו על הניתוח, כולל נתוני הקישור לנחושת. בנוסף לאילוצי המרחק שהופקו מ-NMR, הוסיפו כעת אילוצי קישור למתכת לשאריות שנקבעו.

הוסיפו פרמטרים מתאימים לתיאור יון המתכת והטופולוגיה שלו. הזינו לקובץ הפרמטרים את המידע הפיזי המתאים, כגון מסה, אורכי קשר עם אטומים אחרים, זוויות ופרמטרים של דחייה לא-קושרת. הוסיפו את מידע הקשירה לקובץ הטופולוגיה.

מידע זה כולל אילו קשרים נוצרו ונשברו, ואילו מטענים פורמליים השתנו כתוצאה מהקישור. לבסוף, השג מקבץ מבנים כפי שנעשה קודם לכן, שכן המקבץ הפתור מייצג את המרחב הקונפורמציוני שאומץ על ידי הפפטיד. במהלך מדידת ה-NMR, ייבא את כל הקונפורמציות של המבנה לתוכנת Mal Mall כדי ליצור מקבץ התחלתי.

בחן את האנסמבל כדי לקבוע את היציבות המקומית של המולקולה. קבע את ערכי ה-RMSD של השלד (backbone) והשרשרת הצדדית על ידי בחירת אזורים של ארבעה שאריות עוקבות לאורך הרצף, והפעל את התוכנה לחישוב ה-RMSD ביחס למבנה בעל האנרגיה הנמוכה ביותר או לממוצע; קבע אילו אזורים במולקולה מראים יציבות מקומית באמצעות שרטוט ה-RMSD המקומי כפונקציה של הרצף, בצע חפיפה (overlay) של האנסמבל לאורך אזור זה של המולקולה והשתמש באנסמבל זה להמשך הניתוח. בחר קונפורמציות בעלות אנרגיה נמוכה העומדות באילוצים שהופקו מ-NMR.

אלה יהוו את רשומת המכלול בעלות האנרגיה הנמוכה וידווחו על מספר האישורים במכלול, הקריטריונים לבחירתם וערכי ה-RMSD. אם אופן קישור המתכת טרם נקבע, נתח את המכלול בעלות האנרגיה הנמוכה וקבע אילו שרשראות צד של שאריות אינן נכונות. קרבה זו לזו תאפשר את קישור יון המתכת.

השתמש ב-KYMERA כדי לקבוע מרחקים תוך-מולקולריים בין אטומים החשודים כקושרים מתכות. חשב את המרחקים הממוצעים באנסמבל לאחר שנקבעו אלו. חזור על הניתוח כולל נתוני קשירת הנחושת.

בחן את האנסמבל וקבע את המבנה השניוני המקומי בתוך המולקולה באמצעות פרמטרי החיפוש ברירת המחדל של תוכנית ה-MAL mall. לאחר מכן, ייבא את האנסמבל ל-kymera. מבנים שניוניים נשמרים על ידי קשרי מימן ומצביעים על אזורים יציבים במולקולה.

קבעו את קשירת המימן באמצעות כלי ה-kymera. המשיכו בניתוח המבני כפי שפורט בפרוטוקול הטקסטואלי. לאחר מכן, סכמו את כל הממצאים המבניים כדי להבין כיצד הם מחזקים זה את זה. כדי לחקור מודלים של חלבונים קושרים נחושת, נקבע המבנה של רצף הקשירה השמור של חלבון בתוך הפפטיד הליניארי הנגזר באמצעות NMR במצב תמיסה, כאשר אזור האמיד של הפפטיד היה בין 6.7 ל-8.5.

PP M הראה התרחבות בעקבות תגובה עם נחושת ל-6.6 עד 9.0 PP M. הרחבת קווים עקב חמצון קל של הנחושת ניכרת בקו הבסיס. מוצג כאן חפיפה של אזורי טביעת האצבע של ספקטראי Roy Toxi ו-cozy של הפפטיד הקשור לנחושת. הדגימה הייתה יציבה לאורך זמן והספקטראים היו בעלי רזולוציה טובה והניבו 81 אינטראקציות NOE שנרכשו באמצעות ניסוי rosy.

מכיוון שהמולקולה הראתה אינטראקציות NOE קרובות לאפס בניסוי NO C, המכלול של הפפטיד שהופק עבור הדגימה המגיבה, אך ללא שימוש באילוצים למתכת, הניב 47 מתוך 50 מבנים שאינם זהים עם ערכי RMSD של 1.44 ו-2.07 אנגסטרומים לשלד החלבון ולאטומים הכבדים, בהתאמה. מתוכם נבחרים 13 קונפורמרים בעלי אנרגיה נמוכה לניתוח נוסף, עם ערכי RMSD של 0.25 ו-0.61 אנגסטרומים לשלד החלבון ולאטומים הכבדים, בהתאמה. גרף ה-RMSD המקומי הראה אזור של יציבות בין השאריות השלישית והשביעית; בנוסף לאזור הקשיח של הקצה ה-C, הכולל שארית פרולין, אזור זה נמצא בקונפורמציה של כיפוף בין השאריות הרביעית והשביעית בכל הקונפורמציות.

הקונפורמציה הכפופה מיוצבת על ידי קשרי מימן בין תורמי ומקבלי שלד הפפטיד בגליצין 5 ובגליצין 3, וכן בין ציסטאין 6 לציסטאין 3. כיפוף זה ניכר גם בציסטאין 3 ובסרין 7, כפי שמעידים ערכי הצימוד המופחיתים באזור זה. הקונפורמציות הונחו זו על זו באזור זה ונבחנו לאיתור שאריות קישור אפשריות, כאשר ציסטאין 3, ציסטאין 6 ומתיונין 1 נשקלו כשאריות קישור פוטנציאליות.

המרחק הקצר ביותר בין אטומי גופרית היה בין קבוצות הפולאט של ציסטאין 3 וציסטאין 6; הוכנס קישור לנחושת והחישוב חזר על עצמו כדי להפיק את האנסמבל ששימש לניתוח. האנסמבל בעל האנרגיה הנמוכה של הפפטיד הקשור לנחוש מראה כי האמין בקצה הטרמינלי נמצא בסמיכות לנחושת הקשורה. מוצג כאן משטח השווי (isosurface) של התפלגות הפוטנציאל האלקטרוסטטי, כאשר פוטנציאל חיובי מוצג בכחול ופוטנציאל שלילי מוצג באדום.

שאריד הארגינין בולט מהשלד של הפפטיד ויוצר אונה חיובית של פוטנציאל אלקטרוסטטי, בעוד שפחמני השלד מסודרים בקו היוצר פוטנציאל אלקטרוסטטי שלילי פחות בולט. לאחר רכישת המיומנות, ניתן לבצע קביעה מבנית בתוך כשבוע של זמן NMR ומספר ימים נוספים של עיבוד נתונים, כדי להשיג מאהיל של קונפורמציות שניתן להשתמש בהן לניתוח מבני. בעקבות הליך זה, ניתן לנתח מוטציות פפטידיות אחרות ותנאים שונים כדי לענות על שאלות נוספות הנוגעות לתנאים הדרושים לדרגות שונות של קישור ושחרור של יון הנחושת.