מחקרים מבניים אטומי בקנה מידה של הרכבות Macromolecular על ידי תהודה מגנטית גרעינית solid-state ספקטרוסקופיה
17 בספטמבר 2017
מבנים של חלבון סופרא מולקולרית הרכבות ברזולוציה אטומית הם רלוונטיות גבוהה בשל התפקידים מכריע שלהם במגוון רחב של תופעות ביולוגיות. במסמך זה, אנו מציגים פרוטוקול לבצע מחקרים מבניים ברזולוציה גבוהה על הרכבות לא מסיסים, הבלתי גבישי החלבון macromolecular על-ידי קסם-זווית ספינינג ספקטרוסקופיה של מצב מוצק תהודה מגנטית גרעינית (MAS SSNMR).
המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא לחקור את המבנים של מכלולי חלבונים על-מולקולריים בלתי ממיסים ולא גבישיים ברזולוציה אטומית באמצעות ספקטרוסקופיית NMR במצב מוצק עם סיבוב בזווית קסומה (magic angle spinning). נציג את השלבים המתודולוגיים החיוניים לחקר מבנים אטומיים של מכלולי חלבונים ביו-מולקולריים באמצעות NMR במצב מוצק. חקר המבנים האטומיים של מכלולים אלו הוא מאתגר ביותר מכיוון שהם מטבעם בלתי ממיסים ולא גבישיים.
NMR במצב מוצק היא טכניקה מתפתחת המסוגלת לחקור מבנה מולקולרי ודינמיקה ברזולוציה אטומית, מבלי להיות מוגבלת על ידי גודל האובייקט המורכב או על ידי המסיסות שלו. אנו מדגימים כאן את השלבים המרכזיים להדמיה של מבנים אטומיים של מכלולים חלבוניים ביו-מולקולריים באמצעות NMR במצב מוצק, כולל הכנת דגימות מסומנות איזוטופית, איסוף וניתוח של נתונים מבניים מ-NMR במצב מוצק. השלב הראשון בזרימת העבודה של NMR במצב מוצק הוא ייצור של תתי-יחידות חלבוניות המסומנות ב-C13 N15 והרכבתן in vitro.
בצע הזרעה של מושבה אחת של תאי E.coli שעברו טרנספורמציה לתוך 15 ml של תרבית מקדימה (pre-culture) של מצע LB שחומם מראש. הדגר בטמפרטורה של 37 degrees celsius עם ניעור במהירות של 200 RPM למשך הלילה. להזרעת התרבית הראשית, העבר את כל התרבית המקדימה לתוך ליטר אחד של מצע N9 שחומם מראש ומכיל מקורות פחמן וחנקן המסומנים איזוטופית כנדרש.
אלו יכולים לכלול, ammonium chloride המסומן ב-N15, גלוקוז המסומן באופן אחיד ב-C13, גלוקוז המסומן באופן סלקטיבי ב-C13, או גליצרול המסומן באופן סלקטיבי ב-C13. דגרו ב-37 °C, ומדדו את הצפיפות האופטית ב-600 nm ברגע שהתרבית הופכת עכורה. כאשר ה-OD הגיעה לערך של 0.8, השרו ביטוי חלבון באמצעות 0.75 mM IPTG למשך ארבע שעות. שימו לב כי תנאי השראה אופטימליים עשויים להשתנות מחלבון אחד למשנהו.
שחזרו את התאים על ידי סנטריפוגציה למשך 30 דקות ב-6,000 G ובארבע מעלות. לאחר טיהור תתי-היחידות של החלבון, הן מורכבות in vitro. רכזו את החלבון לכ-1 מילימולרי ביחידה לסינון צנטריפוגלי.
כדי לעשות זאת, הכניסו את הדגימה ליחידת הסינון וסובבו בצנטריפוגה במהירות של 4,000 G למשך 30 דקות. בין שלבי הצנטריפוגציה, ערבבו בעדינות את התמיסה ביחידת הסינון באמצעות פיפטה כדי למנוע שקיעה של חלבונים על ממбраנת המסנן. חזרו על הפעולה עד להשגת הריכוז הרצוי.
העבירו את הדגימה לשפופרת פלקון והדגירו תחת ערבול למשך שבוע בטמפרטורת החדר. בדרך כלל, הפולימריזציה של תתי היחידות לסיבים מלווה בהפיכת התמיסה לעכורה. הוסיפו 0.02% משקל לנפח של sodium azide כדי למנוע זיהום חיידקי.
כדי לאסוף את מקבץ החלבון, סבבו את הדגימה בצנטריפוגה למשך שעה אחת ב-20,000 G ובטמפרטורה של ארבע מעלות. שאבו את רוב הנוזל העליון (supernatant), והשאירו כמות נוזל שתכסה בלבד את פני השטח כדי למנוע ייבוש של הדגימה; שמרו את הדגימה בארבע מעלות עד למדידה. נציג את הניסויים החיוניים לניתוח מבני באמצעות NMR במצב מוצק.
ניסויי קריאה חד-ממדיים של קטב-מחלף (cross polarization, או CP) ו-inept המזוהים על גרעיני C13 משמשים לזיהוי מקטעי חלבון קשיחים וגמישים במבנה, בהתאמה, ולהערכת מידת ההומוגניות המבנית והפולימורפיזם המקומי. כאן, אנו משתמשים בערכים ניסיוניים סטנדרטיים.
טווחים טיפוסיים של פרמטרים מצוינים בפרוטוקול. הכניסו את הרוטור למגנט ה-NMR והפעילו את הסבב בזווית הקסומה (magic angle spinning) כפי שמתואר בפרוטוקול. הגדירו את תדירות הסבב הרצויה, וודאו שהיא התייצבה בטווח של פלוס או מינוס 10 hertz.
הקליטו ספקטרום פרוטון חד-ממדי פולסתי יחיד באמצעות 16 סריקות. הגדירו ניסוי CP של פרוטון ופחמן ב-1D. ניסויי CP מראים את האותים הנובעים משאריות במבנה קשיח. פרמטרי הניסוי הראשוניים נלקחו מהליך אופטימיזציה סטנדרטי על תרכובת ייחוס.
ניתן לבצע אופטימיזציה של פרמטרי כיול הפולסים והניתוק (decoupling) בדגימה כאשר הרגישות גבוהה מספיק. כאן, אנו מקליטים CP עם 16 סריקות. זמן המגע של ה-CP ורמות ההספק נבחרים על בסיס עוצמת האות המקסימלית, כפי שמוצג כאן עבור אופטימיזציה של זמן המגע של ה-CP.
בעוד שהעוצמה המקסימלית בדוגמה זו מושגת ב-800 מילישניות, יש לכוון מחדש את פרמטרי הניתוק (decoupling) מאלו שנקבעו במקור בכיול התרכובת הייחוס. לבסוף, יש להקפיד על מיקום פסי הצד של הסיבוב (spinning side bands) בתדר סיבוב הזווית הקסומה (magic angle spinning) הנתון, שמוצג כאן ב-18 kilohertz, כדי למנוע חפיפה עם האות.
הקליטו ספקטרום CP של פרוטון-פחמן חד-ממדי (1D) המשמש כטביעת אצבע ספקטרלית חד-ממדית. כאן, אנו צוברים 128 סריקות עם זמן מגע CP של 800 milliseconds, עוצמת decoupling של 100 kilohertz, השהיית מחזור (recycle delay) של שלוש שניות, וזמן רכישה של 20 milliseconds. עבדו את ניסוי ה-CP ללא apathization.
בחר שיא מבודד כדי להעריך את ה-C39 בתוך הדגימה, המעיד על סדר מבני והומוגניות. כאן, רוחב הקו, הנמדד כרוחב מלא בחצי הגובה, הוא סביב 60 עד 70 hertz, מה שמעיד על מבנה חלבון מסודר היטב במקבץ. הגדר ניסוי inept חד-ממדי של פרוטון-פחמן כדי לבחון חלקים בעלי ניידות גבוהה במקבץ החלבונים.
הקליטו ניסוי reference inept שישמש כטביעת אצבע עבור מקטעי החלבון הניידים. הפרמטרים הטיפוסיים הם 128 סריקות, וזמן רכישה של 25 milliseconds. עבדו את ניסוי proton carbon inept.
מספר האותים ומיקומם מעידים, בהתאמה, על מידת ניידות השאריות ועל הרכב חומצות האמינו. כאן, נצפה רק אות מה-CH2 של twist buffer merit-y, מכיוון שכל החלבון נמצא במשטר קשיח במבנה ההרכבה. ניתוח קונפורמציוני של מבנה החלבון מבוסס על השיוכים התהודים של NMR במצב מוצק עבור כל השאריות הקשיחות של ההרכבה.
דבר זה מתאפשר מכיוון שהסטיות הכימיות (chemical shifts) הן גששים רגישים מאוד לסביבה הכימית המקומית, וניתן להשתמש בהן כדי לחזות את המבנה השניוני של החלבון. קביעה מלאה של מבנה תלת-ממדי מתבססת לאחר מכן על איסוף נתונים מבניים, כגון הגבלות מרחק המקודדות קרבויות של אטומים הן בתוך המולקולה והן בין מולקולות, עד למרחק של תשעה אנגסטרם. כאן, נראה כיצד מוקלטים הניסויים הדו-ממדיים הבסיסיים ונספק דוגמה לשיוך רצפי (sequential assignment).
לאחר מכן נספק הדגמה קצרה על אופן איסוף הגבלות מרחק מניסויים שהוקלטו על דגימות המסומנות באופן סלקטיבי ב-C13. הגדירו את ניסוי ה-PDSD הדו-ממדי של פחמן-פחמן עם זמן ערבוב קצר, כדי לזהות קורלציית פחמן-פחמן בתוך שארית. העתיקו את הערכים עבור שלב קטב הסיבוב (cross polarization) הראשוני של פרוטון-פחמן מניסוי ה-CP החד-ממדי.
ניתן להגדיר את הערבוב ל-50 milliseconds עבור דגימות המסומנות באופן אחיד ב-C13. כאן, בחרנו בזמן רכישה של 15 ו-20 milliseconds בממדים העקיף והישיר בהתאמה. לעיבוד ספקטרום ה-PDSD, אנו משתמשים בפונקציית חלון QSINE עם sine-bell shift של 3.5.
כדי לאפשר שיוך ספציפי לשאריות, השתמש בהגדרות של PDSD עם זמן ערבוב קצר כדי להקליט PDSD עם זמן ערבוב בינוני של 100 עד 200 מילישניות. שים לב כי לעיתים קרובות נדרשים ספקטרומים נוספים, כולל ניסויים עם גילוי חנקן, לצורך שיוך תהודה מלא, ואלה מפורטים בפרוטוקול. בחר תוכנה לניתוח NMR, כגון CCPNMR Analysis.
הטעינו את הספקטרומים הדו-ממדיים לתוך התוכנה, וצרו אובייקט מולקולרי עם רצף החלבון הראשוני. התחילו בזיהוי סוגי חומצות האמינו הנראים בספקטרום PDSD בזמן ערבוב קצר. חיבור אטומי הפחמן של מערכות הספין מאפשר שיוך ספציפי לסוג השארית.
כאן, אנו מקצים את מערכת הספין של שארית תריניום. העברת הקיטוב בין גרעיני ה-C-alpha, C-beta ו-C-gamma מובילה לשיאי הצלבה פיזיים בספקטרום ה-PDSD. נסו לזהות כמה שיותר שאריות באמצעות הליך זה.
בצע חפיפה של ספקטרום ה-PDSD עבור זמן הערבוב הקצר והבינוני. הפסגות הנוספות הנראות ב-PDSD של זמן הערבוב הבינוני נובעות בדרך כלל ממגע בין שאריות עוקבות. סמן את פסגות התהודה של מערכת ספין ומצא ב-PDSD של זמן הערבוב הבינוני מתאמים עם תדרי תהודה של מערכות ספין אחרות.
אנו מציגים את השיוך הרצפי מ-thenium 33 ל-isolutane 32 במבנה החלבון הפילימנטי שלנו. תדרי התהודה של מערכת הספין של thenium נראים בתדר הפחמן של ה-isolutes ב-32, ולהיפך. נהלי השיוך באמצעות ספקטרה עם גילוי חנקן, וכן קבלת מבנה שניוני של החלבון מתוך השיוכים, מתוארים בפרוטוקול.
בעקבות הקצאת תהודות יסודית, ניתן להמשיך בזיהוי אילוצים למרחקים ארוכים. אילוצים למרחקים ארוכים הם קרבות פחמן-פחמן תוך-מולקולריים או בין-מולקולריים בין שאריות רחוקות, המגדירים הן את הקיפול השלישוני של התתי-יחידות המונומריות והן את הסידור של התתי-יחידות בתוך המקבץ. כאן, דגימות המסומנות באופן סלקטיבי ב-C13 הן בעלות חשיבות מיוחדת.
יש להלביש PDSD של זמן ערבוב בינוני על PDSD של פחמן-פחמן עם זמן ערבוב ארוך, שהוקלט עם זמן ערבוב שבין 400 מילישניות לשנייה אחת בדגימה המסומנת באופן סלקטיבי ב-C13. במידת האפשר, שני ה-PDSD צריכים להיות מוקלטים מאותה דגימה המסומנת באופן סלקטיבי. שיאים משלימים נוצרים כתוצאה מקורלציות בין אטומי C13 מרוחקים יותר.
במהלך השיוך של התהודות (resonance assignment), יש להתחשב בתוכנית הסימון הסלקטיבי. במקרה זה, 1-3-glycerol. כאן הדגשנו דוגמה לשיא של מגע ארוך-טווח עם שיוך חד-משמעי בשני הממדים.
Thenium 33 C-beta עם protein 45 C-alpha. לאחר השלמת זיהוי מרחקים בטווח ארוך, האילוצים מסווגים כחד-משמעיים או כדו-משמעיים, וכן כתוך-מולקולריים או בין-מולקולריים. רשימות האילוצים שיש להכין עבור המידול המבני מפורטות בפרוטוקול.
ניתן למצוא ברשת מדריכים למידול מבני באמצעות תוכנות שונות. נתוני NMR במצב מוצק, כשלעצמם או בשילוב עם נתונים משלימים, יכולים לאפשר קביעת מבנה ברמה אטומית של מקבצים סופרא-מולקולריים. היתרונות של NMR במצב מוצק הם, מצד אחד, היכולת לספק הן מידע על מבנה שני והן מגבלות מרחק אטומי מממשקים תוך-מולקולריים, שניתן לשלב בתהליך המידול.
מאידך, המאפיין הייחודי של ספקטרוסקופיית NMR במצב מוצק טמון ביכולתה לאסוף אילוצי מרחק אטומיים בממשקים בין-מולקולריים של הרכבים על-מולקולריים שלמים. עם זאת, הזיהוי וההבחנה בין השיוכים של אילוצים תוך-מולקולריים לבין אילוצים בין-מולקולריים עשויים להיות תהליך מייגע, ובדרך כלל דורשים הכנה של דגימות המסומנות באופן סלקטיבי ב-C13. אך עם פיתוחים חדשים באסטרטגיות סימון סלקטיבי, בתכנון חומרת הספקטרומטר ובמתודולוגיות NMR במצב מוצק, הטכניקה מממשת יותר ויותר את הפוטנציאל התאורטי שלה לספק מידע מולקולרי ברמה אטומית ללא הגבלות של גודל האובייקט, סדר לטווח רחוק או קריסטליות.
שיטה זו מאפשרת לנו לחקור את המבנה האטומי של מקבצי ביו-מולקולריים. חשוב מאוד להכין את הדגימה בקפידה כדי להבטיח תנאי NMR אופטימליים, במטרה להשיג נתונים ברזולוציה גבוהה. באמצעות פרוטוקול זה, ניתן להגיע לרזולוציות אטומיות המספקות מידע על מקבצי חלבונים.
ניתן לשלב טכניקה זו עם טכניקות אחרות בביולוגיה מבנית כדי להשיג מודלים תלת-ממדיים.
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול לחקר המבנים של מקבצי חלבונים סופרא-מולקולריים בלתי מסיסים שאינם גבישיים ברזולוציה אטומית, באמצעות ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית במצב מוצק עם סיבוב בזווית קסומה (MAS SSNMR). השיטה נותנת מענה לאתגרים הנובעים מהחוסר המובנה במסיסות ובהיותם לא גבישיים של מקבצים אלו.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- ביולוגיה מבנית
- ביוכימיה
- ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית (NMR)
רקע
- מקבצי חלבונים על-מולקולריים ממלאים תפקידים מכריעים בתופעות ביולוגיות שונות.
- חקר המבנים שלהם חיוני להבנת התפקודים שלהם.
- NMR במצב מוצק היא טכניקה עוצמתית לניתוח מבנים אלו.
- האתגרים כוללים את חוסר המסיסות ואת טבעם הבלתי-גבישי של המקבצים.
מטרת המחקר
- מתן פרוטוקול מפורט למחקרים מבניים ברזולוציה גבוהה של מקבצי חלבונים.
- הדגמת שלבים מתודולוגיים מרכזיים ב-NMR במצב מוצק.
- מתן אפשרות לחוקרים להדמיות של מבנים אטומיים של מקבצים ביו-מולקולריים.
השיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת דגימות חלבון המסומנות איזוטופית.
- הרכבה in vitro של תת-יחידות חלבון.
- ספקטרוסקופיית NMR במצב מוצק עם סיבוב בזווית קסומה (Magic-angle spinning).
- איסוף נתונים וניתוח באמצעות פרמטרים ניסיוניים סטנדרטיים.
תוצאות עיקריות
- ויזואליזציה מוצלחת של מבנים אטומיים של מקבצי חלבונים.
- זיהוי של מקטעים קשיחים וגמישים בתוך המקבצים.
- הערכה של הומוגניות מבנית ופולימורפיזם מקומי.
- הדגמה של יעילות ה-NMR במצב מוצק (solid-state NMR) בחקר מבנים מורכבים של חלבונים.
מסקנות
- הפרוטוקול מאפשר ניתוח מבני מפורט של מקבצי חלבונים מאתגרים.
- NMR במצב מוצק היא שיטה יעילה לחקר חלבונים שאינם מסיסים ואינם גבישיים.
- יישומים עתידיים עשויים לשפר את הבנתנו לגבי תפקוד חלבונים ואינטראקציות ביניהם.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסבסים
NMR במצב מוצק (SSNMR) עם סיבוב בזווית קסומה מאפשר פיתוח מבני ברמה אטומית של מקבצי מקרומולקולות שאינם מסיסים ואינם גבישיים, אשר אינם נגישים לטכניקות מסורתיות של ביולוגיה מבנית. יכולת זו נותנת מענה לפער קריטי בשלבי הגילוי המוקדמים ובתיקוף מטרות עבור מקבצי חלבונים מורכבים המעורבים במנגנוני מחלה. שילוב של תובנות אטומית המופקות מ-SSNMR משפר את הביטחון החזוי ומפחית סיכונים בקבלת החלטות לגבי תיקי מוצרים של תרופות ביולוגיות וחדשנות בשיטות טיפול.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה ברזולוציה אטומית של מנגנוני הרכבה של חלבונים סופרא-מולקולריים הרלוונטיים לנתיבי מחלה.
- תומך בתיקוף תפקודי של מטרות על ידי חשיפת סדר מבני, הומוגניות ומצבים קונפורמציוניים.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטית עבור הרכבות המעורבות בניוון עצבי, זיהום או אינטראקציות מארח-פתוגן.
- מספק מדדים מבניים לסריקה ותיעדוף של מטרות בעלות מסיסות או גבישיות מוגבלת.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק טביעות רשת ספקטרליות מאומתות עבור מקטעי חלבון קשיחים וגמישים, התומכות בסטנדרטיזציה של הבדיקה.
- מאפשר זיהוי הדיר במידה רבה של הומוגניות מבנית ופולימורפיזם מקומי במקבצים מורכבים.
- מכין מערכות חסונות עם סימון איזוטופי עבור תהליכי סריקה והערכת תרכובות המשך.
- תומך ביכולת הרחבה של הפלטפורמה עבור מטרות מקרו-מולקולריות מגוונות מעבר לחלבונים מסיסים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה נתונים מבניים ברמה אטומית למצבי הרכבה הרלוונטיים למחלה לצורך פיתוח ביומרקרים תרגומיים.
- מבטיחה רצף משלב הגילוי ועד לאישור פרה-קליני עבור מטרות בלתי ממיסות או מצוברים.
- מפחיתה סיכונים בקידום תרופות ביולוגיות על ידי אספקת ראיות ישירות לארכיטקטורת ההרכבה ולמגעים בממשקים.
- מאפשרת שילוב עם שיטות משלימות של ביולוגיה מבנית למידול תלת-ממדי מקיף.
שילוב זרימת עבודה וצינור עיבוד
SSNMR משתלב ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני על ידי כך שהוא מאפשר קביעת מבנה ברמה אטומית של מקבצים העמידים לניתוח באמצעות X-ray או NMR של תמיסות.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות ובבירור מסלולים עבור קומפלקסים של חלבונים בלתי ממיסים.
- סריקה: מספקת פלטים ספקטרליים כמותיים וניתנים לשחזור לצורך מוכנות של בדיקות ותיקוף מערכות.
- אנליזה: מספקת השמה של הסטות כימיות, מגבלות מרחק וטביעות אצבע קונפורמציוניות לצורך אנליזה השוואית.
- מחקר תרגומי: מקשר בין מבנה אטומי למצבי הרכבה רלוונטיים למחלה, ובכך מספק מידע לאסטרטגיות של סמנים ביולוגיים וטיפולים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה לשימוש חוזר לבדיקה מבנית של מגוון הרכבים מקרומולקולריים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית עבור מטרות מורכבות.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של תהליכי עבודה עבור מקבצים בלתי ממיסים, ובכך משפר את השחזוריות והיכולת להרחבה (scalability).
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס להחלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) ומפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים עבור מודליות חדשניות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכון וקידום של מטרות ביולוגיות מאתגרות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בסימון איזוטופי, הכנת דגימות וספקטרוסקופיית NMR מתקדמת.
- מחייב גישה למכשור NMR בעוצמה גבוהה (high-field) ותוכנות ניתוח ייעודיות.
- מצריך סטנדרטיזציה בין-צוותית של תכניות הסימון ושל פרוטוקולי הניתוח הספקטרלי.
- התאמה למבני חלבון שונים עשויה לדרוש אופטימיזציה של פרמטרי הסימון והרכישה.
- פירוש של אילוצים בין-מולקולריים עשוי להיות מורכב ועלול להצריך אסטרטגיות סימון סלקטיביות.
