מחקרים מבניים אטומי בקנה מידה של הרכבות Macromolecular על ידי תהודה מגנטית גרעינית solid-state ספקטרוסקופיה

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לחקור את המבנים של מכלולי חלבון סופר-מולקולריים בלתי מסיסים ולא גבישיים ברזולוציה אטומית על ידי ספקטרוסקופיה של תמ"ג במצב מוצק בזווית קסם. נציג את השלבים המתודולוגיים החיוניים לחקר מבנים אטומיים של מכלולי חלבונים ביומולקולריים על ידי תמ"ג במצב מוצק. חקר המבנים האטומיים של מכלולים אלה הוא מאתגר ביותר מכיוון שהם מטבעם בלתי מסיסים ואינם גבישיים.

תמ"ג במצב מוצק היא טכניקה מתפתחת המסוגלת לחקור מבנה מולקולרי ודינמיקה ברזולוציה האטומית מבלי להיות מוגבלת על ידי גודל האובייקט המורכב, או על ידי מסיסותו. אנו מדגימים כאן את השלבים העיקריים להמחשת מבנים אטומיים של מכלולי חלבונים ביומולקולריים על ידי תמ"ג במצב נמכר, כולל הכנת דגימות מסומנות איזוטופית, איסוף וניתוח נתונים מבניים מתמ"ג במצב מוצק. השלב הראשון בזרימת עבודה של NMR במצב מוצק הוא ייצור של תת-יחידות חלבון מסומנות C13 N15 והרכבתן במבחנה.

יש לחסן תרבית מוקדמת של 15 מיל של מדיום LB שחומם מראש עם מושבה אחת של תאי E.coli שעברו טרנספורמציה. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם רעידות של 200 סל"ד במהלך הלילה. כדי לחסן את התרבות העיקרית, העבירו את כל התרבות המוקדמת לליטר אחד של מדיום N9 מחומם מראש המכיל מקורות איזוטופיים נחוצים של פחמן וחנקן.

אלה יכולים לכלול, N15 עם תווית אמוניום כלוריד, גלוקוז עם תווית C13 אחידה, גלוקוז עם תווית C13 סלקטיבית, או C13 סלקטיבי עם דגירה של גליצרול ב-37 מעלות, ולמדוד את הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר ברגע שהתרבית נעשית עכורה. כאשר ה-OD הגיע לערך של 0.8, השרה ביטוי חלבון עם IPTG מיני מולארי של 0.75 למשך ארבע שעות. שימו לב שתנאי האינדוקציה האופטימליים יכולים להשתנות מחלבון אחד למשנהו.

שחזר את התאים על ידי צנטריפוגה למשך 30 דקות בטמפרטורה של 6, 000 גרם וארבע מעלות. לאחר טיהור יחידות המשנה של החלבון, הם מורכבים במבחנה. רכז את החלבון לכ-1 מיני טוחנת ביחידת מסנן צנטריפוגלית.

לשם כך, הכנס את הדגימה ליחידת המסנן ולצנטריפוגה ב-4,000 גרם למשך 30 דקות. בין שלבי הצנטריפוגה, ערבבו בעדינות את התמיסה ביחידת המסנן עם פיפטה כדי למנוע שקיעת חלבון בקרום המסנן. חזור על ההליך עד להגעה לריכוז הרצוי.

העבירו את הדגימה לצינור בז ודגרו תחת תסיסה למשך שבוע בטמפרטורת החדר. בדרך כלל, פילמור יחידות המשנה לחוטים מלווה בכך שהתמיסה הופכת לעכורה. הוסף 0.02% משקל לנפח נתרן אזיד כדי למנוע זיהום חיידקי.

כדי לקצור את מכלול החלבון, צנטריפוגה את הדגימה למשך שעה בחום של 20, 000 גרם וארבע מעלות. שאפו את רוב הסופרנטנט והשאירו רק מספיק נוזל כדי לכסות את פני השטח כדי למנוע ייבוש דגימה, ואחסנו את הדגימה בארבע מעלות עד למדידה. נציג את הניסויים החיוניים לניתוח מבני על ידי תמ"ג במצב מוצק.

קיטוב צולב חד מימדי, או CP, וניסויים לא יעילים שזוהו בגרעיני C13 משמשים לאיתור מקטעי חלבון קשיחים וגמישים במכלול, בהתאמה. ולהעריך את מידת ההומוגניות המבנית והפולימורפיזם המקומי. כאן, אנו משתמשים בערכי ניסוי סטנדרטיים.

טווחי פרמטרים אופייניים מצוינים בפרוטוקול. הכנס את הרוטה למגנט ה-NMR והתחל את סיבוב זווית הקסם כמתואר בפרוטוקול. הגדר את תדר הסחיטה הרצוי, והבטח ייצוב בטווח של פלוס מינוס 10 הרץ.

הקלט ספקטרום פרוטונים חד-ממדי חד-ממדי באמצעות 16 סריקות. הגדר CP פחמן פרוטון 1D. ניסויי CP מראים את האותות הנובעים משאריות בקונפורמציה קשיחה. פרמטרי הניסוי הראשוניים נלקחים מהליך אופטימיזציה סטנדרטי על תרכובת ייחוס.

ניתן לייעל את פרמטרי כיול הדופק וניתוק הדגימה כאשר הרגישות גבוהה מספיק. כאן, אנו רושמים CP עם 16 סריקות. זמן המגע ורמות ההספק של CP נבחרים על סמך עוצמת האות המקסימלית, כפי שמודגם כאן עבור אופטימיזציה של זמן המגע של CP.

העוצמה המקסימלית בדוגמה זו מושגת ב-800 אלפיות השנייה. יש להתאים מחדש את פרמטרי הניתוק מאלה שנקבעו במקור מכיול תרכובת הייחוס. לבסוף, התבונן בזהירות בלוקליזציה של רצועות צד מסתובבות בתדר הסיבוב של זווית הקסם הנתונה, המוצג כאן ב-18 קילו-הרץ, כדי למנוע חפיפה עם האות.

הקלט ספקטרום CP פחמן פרוטון 1D הפניה המשמש כטביעת אצבע ספקטרלית חד מימדית. כאן, אנו צוברים 128 סריקות עם זמן מגע CP של 800 אלפיות השנייה, חוזק ניתוק של 100 קילו-הרץ, עיכוב מיחזור של שלוש שניות וזמן רכישה של 20 אלפיות השנייה. עבד את ניסוי ה-CP ללא אדישות.

בחר ובודד שיא כדי להעריך את ה-C39 בתוך המדגם, המעיד על סדר מבני והומוגניות. כאן, רוחב הקו, הנמדד כרוחב המלא בחצי גובה, הוא בסביבות 60 עד 70 הרץ, מה שמעיד על מבנה חלבון מסודר היטב במכלול. הקים ניסוי חד ממדי של פחמן פרוטון כדי לחקור חלקים ניידים מאוד של מכלול החלבון.

הקלט ניסוי ייחוס לא כשיר שישמש כטביעת אצבע עבור מקטעי החלבון הניידים. פרמטרים אופייניים הם 128 סריקות, וזמן רכישה של 25 אלפיות השנייה. לעבד את ניסוי הפחמן הפרוטוני.

מספר האותות, ומיקומם, מעידים על מידת ניידות השאריות והרכב חומצות האמינו בהתאמה. כאן, נצפה רק אות ממאגר הטוויסט CH2 Merit-y מכיוון שהחלבון כולו נמצא במשטר נוקשה במבנה ההרכבה. ניתוח קונפורמציה של מבנה החלבון מבוסס על הקצאות תהודה של NMR במצב מוצק עבור כל השאריות הקשיחות של המכלול.

זה מתאפשר מכיוון שהיסטים כימיים הם בדיקות רגישות מאוד לסביבה כימית מקומית, וניתן להשתמש בהן כדי לחזות את המבנה המשני של החלבון. קביעת מבנה תלת מימדית מלאה מבוססת על איסוף נתונים מבניים כגון מגבלות מרחק המקודדות קרבה אטומית תוך-מולקולרית ובין-מולקולרית עד תשעה אנגסטרום. כאן, נראה כיצד נרשמים הניסויים הדו-ממדיים הבסיסיים וניתן דוגמה למשימה עוקבת.

לאחר מכן ניתן הדגמה קצרה כיצד לאסוף מגבלות מרחק מניסויים שנרשמו על דגימות C13 סלקטיביות. הגדר את זמן הערבוב הקצר ניסוי PDSD פחמן פחמן דו-ממדי כדי לזהות מתאם פחמן פחמן בתוך שאריות. העתק את הערכים עבור שלב הקיטוב הראשוני של פחמן פרוטון מניסוי CP חד מימדי.

ניתן להגדיר את הערבוב ל-50 אלפיות השנייה עבור דגימות עם תווית C13 אחידה. כאן, בחרנו זמן רכישה של 15 ו -20 אלפיות השנייה בממדים העקיפים והישירים בהתאמה. כדי לעבד את ספקטרום ה-PDSD, אנו משתמשים בפונקציית חלון QSINE עם הזזת פעמון סינוס של 3.5.

כדי לאפשר הקצאה ספציפית לשאריות, השתמש בהגדרות של זמן הערבוב הקצר PDSD כדי להקליט זמן ערבוב ביניים PDSD עם זמן ערבוב של 100 עד 200 אלפיות השנייה. שימו לב שספקטרום נוסף, כולל ניסויים שזוהו בחנקן, נדרשים לעתים קרובות למשימת תהודה מלאה, ומפורטים בפרוטוקול. בחר תוכנית ניתוח NMR, כגון ניתוח CCPNMR.

טען את הספקטרום הדו-ממדי לתוכנה, וצור אובייקט מולקולרי עם רצף החלבון הראשוני. התחל בזיהוי סוגי חומצות האמינו הנראים בספקטרום PDSD של זמן הערבוב הקצר. חיבור אטומי הפחמן של מערכות הספין מאפשר הקצאה ספציפית לסוג השאריות.

כאן, אנו מקצים את מערכת הספין של שאריות תניום. העברות הקיטוב בין גרעיני C-alpha, C-beta ו-C-gamma מובילות לפסגות צולבות פיזיות בספקטרום PDSD. נסה לזהות כמה שיותר שאריות בהליך זה.

שכב על ספקטרום PDSD של זמן הערבוב הקצר והבינוני. הפסגות המשלימות הנראות בזמן ערבוב הביניים PDSD נובעות בדרך כלל ממגע בין שאריות עוקבות. סמן את שיאי התהודה של מערכת ספין ומצא מתאמים בזמן ערבוב הביניים PDSD עם תדרי תהודה של מערכות ספין אחרות.

אנו מראים את ההקצאה הרציפה עם תניום 33 לאיזולוטן 32 במכלול החלבון החוטי שלנו. תדרי התהודה של מערכת ספין התניום נראים בתדר פחמן של האיזולוטים ב-32, ולהיפך. נהלים להקצאה עם ספקטרום שזוהה בחנקן ולקבלת מבנה משני של חלבון מההקצאות מתוארים בפרוטוקול.

לאחר הקצאת תהודה יסודית, נוכל להמשיך בזיהוי מעצורים ארוכי טווח. מעצורים לטווח ארוך הם קרבת פחמן תוך-מולקולרית או בין-מולקולרית בין שאריות מרוחקות המגדירות הן את הקפל השלישוני של יחידות המשנה המונומריות והן את סידור יחידות המשנה בתוך המכלול. כאן, יש חשיבות מיוחדת לדגימות המסומנות ב-C13.

שכבת על זמן ערבוב ביניים PDSD עם זמן ערבוב ארוך פחמן פחמן PDSD שהוקלט עם זמן ערבוב בין 400 אלפיות השנייה לשנייה אחת על דגימה מתויגת C13 סלקטיבית. במידת האפשר, שני ה-PDSD היו צריכים להיות מתועדים באותה דגימה עם תווית סלקטיבית. שיאים משלימים נובעים ממתאמים בין אטומי C13 רחוקים יותר.

במהלך הקצאת תהודה, קח בחשבון את ערכת התיוג הסלקטיבית. במקרה זה, 1-3-גליצרול. כאן, הדגשנו ודוגמה לשיא מגע לטווח ארוך עם הקצאה חד משמעית לשני הממדים.

תניום 33 C-בטא עם חלבון 45 C-אלפא. לאחר השלמת זיהוי למרחקים ארוכים, מעצורים מסווגים כחד משמעיים או מעורפלים כמו גם תוך-מולקולריים או בין-מולקולריים. רשימות הריסון שיש להכין למודלים המבניים מפורטות בפרוטוקול.

הדרכות על מידול מבני באמצעות תוכנות שונות ניתן למצוא באינטרנט. נתוני תמ"ג במצב מוצק, בפני עצמם או בשילוב עם נתונים משלימים, יכולים לאפשר קביעת מבנה הרמה האטומית של מכלולים סופר מולקולריים. היתרונות של תמ"ג במצב מוצק הם מצד אחד, היכולת לספק הן מידע על מבנה משני והן מגבלות מרחק אטומיות מממשקים תוך-מולקולריים, הניתנים לשילוב בתהליך המידול.

עם זאת, מצד שני, המאפיין הייחודי של ספקטרוסקופיה של תמ"ג במצב מוצק טמון ביכולתו לאסוף מגבלות מרחק אטומיות בממשקים בין-מולקולריים של הרכבה סופר-מולקולרית שלמה. עם זאת, הזיהוי וההבחנה בין הקצאות ריסון תוך-מולקולאריות ובין-מולקולאריות יכולות להיות תהליך מייגע, ובדרך כלל דורש הכנה של דגימות מסומנות C13 באופן סלקטיבי. עם זאת, עם התפתחויות חדשות באסטרטגיות תיוג סלקטיביות, תכנון חומרת ספקטרומטר ומתודולוגיות NMR של מצב מוצק, הטכניקה מממשת יותר ויותר את הפוטנציאל התיאורטי שלה לספק מידע מולקולרי ברמה האטומית ללא מגבלות של גודל אובייקט, סדר טווח ארוך או גבישיות.

שיטה זו מאפשרת לנו לחקור את המבנה האטומי של מכלולים ביומולקולריים. חשוב מאוד להכין בזהירות את הדגימה כדי לייעל את מצב התמ"ג, כדי לקבל נתונים ברזולוציה גבוהה. בעזרת פרוטוקול זה, אנו יכולים לקבל רזולוציות אטומיות שהן מידע על מכלולי חלבונים.

וניתן לשלב טכניקה זו עם טכניקות אחרות בביולוגיה מבנית כדי להשיג מודלים תלת מימדיים.