דה-סלולריזציה של ריאות פרימטים לא אנושיים ורסלולריזציה באמצעות ביו-ריאקטור מיוחד לאיברים גדולים

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד מטריצות ביולוגיות של איברים שלמים מהריאות של ראוס מקאס ולהשתמש במטריצות אלה כפיגומים לחקירת יישומי הנדסת רקמות ריאה. זה מושג על ידי פירוק ריאות רויס מאקה שלמות עם חומרי ניקוי, מלחים ואנזימים. השלב השני הוא התקנת פיגומי הריאה המפורקים לתוך ביו-ריאקטור המסוגל גם לאוורר את דרכי הנשימה וגם לחלחל את כלי הדם הריאתיים במצע תרבית תאים נוזלי.

לאחר מכן, פיגומי הריאה יושבים עם תאי גזע דרך דרכי הנשימה ותאי האנדותל דרך כלי הדם הריאתיים. השלב האחרון הוא תרבית התאים בתוך פיגום הריאה בתנאי האוורור והזלוף המסופקים על ידי הביוריאקטור למשך הזמן הרצוי, ולאחר מכן ניתוח המורפולוגיה התאית והרקמות המתקבלת. בסופו של דבר, חידוש פיגומי ריאות מאקה תאיים עם תאי גזע ותאי אנדותל מביא לרקמה מהונדסת המחקה את המאפיינים האנטומיים וההיסטולוגיים של רקמות ריאה מקומיות.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי הנדסת רקמות הריאה, כגון האם ניתן להשתמש בתאי גזע או אב לחידוש רקמת ריאה, לבד או בתיאום עם תאי אפיתל ריאתיים ואנדותל בוגרים. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול במחלות ריאה בשלב הסופי מכיוון שלשילוב של מטריצות ריאה תאיות עם תאי גזע או אב שמקורם בחולה יש פוטנציאל להגדיל את מספר ריאות התורם הזמינות להשתלת ריאות. יתר על כן, הריאות המתקבלות שהונדסו באמצעות תאי גזע של המטופל עצמו עשויות להיות עמידות בפני דחייה חיסונית.

הרעיון לשיטה זו עלה לנו לראשונה כאשר צפינו בסרטון ג'ו שפורסם בעבר על ידי חברי המעבדה של ד"ר לורה ניקולסון באוניברסיטת ייל. כאן אנו מציגים שינויים בנוהל שלהם עבור מכרסמים כך שיתאימו לצרכים של מודל החיה הגדולה שלנו Resus Meac. יש לנקוט בזהירות מרבית כדי למנוע מקרים של חשיפה זיהומית בעת עבודה עם רקמות מאקה.

לפני הטיפול ברקמות פרימטים לא אנושיות, יש ללבוש ציוד מגן אישי כולל מסכה כירורגית, מגן פנים, שכבה אחת של כפפות כירורגיות, חלוק חד פעמי ושכבה שנייה של כפפות כירורגיות כשהריאות מונחות שטוחות במגש ניתוח, יש לשטוף את עורק הריאה באמצעות מחבר פיתוי נשי עם דוקרנים בגודל מתאים. אבטח את הצינורית למקומה בעזרת עניבת רוכסן מעוקרת אלכוהול. החלק עניבת רוכסן מפלסטיק סביב קנה הנשימה.

הכנס מחבר פיתוי נקבה לפתח קנה הנשימה והדק את עניבת הרוכסן סביב הדוקר של המחבר כדי להחזיק את קנה הנשימה במקומו סביב הדוקרן. הסר אוויר כלוא מהריאות על ידי החדרת תמיסת מלח פוספט או PBS המכילה 30 יחידות למיליליטר הפרין וחמישה מיקרוגרם למיליליטר צד נתרן ניטרופרס. SNP מקוצר מאפשר להוציא את התמיסה על ידי רתיעה טבעית לפני החזרה.

התקנה פעמיים נוספות לאחר התקנת דרכי הנשימה השלישית עם פתרון PBS Heparin SNP. מכסים את צינורית הפיתוי של קנה הנשימה עם פקק פיתוי. חתכו את קודקוד הלב והשקו את החדרים הפנימיים עם PBS Heparin SNP כדי להסיר שאריות דם שקרעו את שתי הפרוזדורים כדי להקל על ניקוז המעגלים הריאתיים בעת הזלוף.

חבר מזרק 60 סמ"ק מלא בתמיסת PBS Heparin SNP לצינורית עורק הריאה והסר בזהירות את הבוכנה כדי לאפשר לנוזל לזרום לתוך כלי הדם. הסר את הפקק מצינורית קנה הנשימה ואפשר להוציא את הנוזל בדרכי הנשימה על ידי רתיעה טבעית. המשך בזלוף עד להוצאת כמה שיותר דם מכלי הדם הריאתיים.

ההיבט הקשה ביותר של ההליך הוא שטיפה ושטיפה יעילה של דרכי הנשימה של הריאות עם נוזלים, זרימת הנוזלים מעוכבת ביחס לגזים מכיוון שדרכי הנשימה אינן אמורות להוביל נוזלים, זמן ומטופלים נחוצים לביצוע שלבים אלה, אנו ממליצים להמשיך עם הפרוטוקול, למרות שנותר נוזל שנותר בדרכי הנשימה עם התקדמות הדה-סלולריזציה ופסולת תאית נשטפת החוצה, צמיגות הנוזלים תישאר נמוכה והריאות יוכלו להוציא נוזלים ביעילות ביום הראשון. טבלו את גוש ריאות הלב במים נטולי יונים, נפחו וחלחלו את הריאה במים נטולי יונים באמצעות מזרקים של 60 סמ"ק המחוברים לצינורית קנה הנשימה והעורקים השקועים בהתאמה. חזור ביעילות על שטיפות דרכי הנשימה וכלי הדם במים נטולי יונים.

ארבע פעמים נוספות בסך הכל חמש שטיפות של כ-0.5 עד ליטר כל אחת לאחר חמש כביסות, הסר את הריאות מהמים והטביע את הבלוק בתמיסת טריטון. נפחו וחלחלו את הריאות בתמיסת טריטון. כמו קודם, חזור על ההתקנה פעם נוספת ודגירה על האיברים השקועים בתמיסת טריטון למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר דגירה של לילה, הסר את גוש הריאות מתמיסת טריטון ושטוף חיצונית במים נטולי יונים. לאחר מכן הטביע את הבלוק במים טריים נטולי יונים. החדירו את המים נטולי היונים לקנה הנשימה ולעורק הריאה חמש פעמים כדי לשטוף את תמיסת הטריטון ואת פסולת התאים.

הסר את הריאות ממים נטולי יונים וטבול בציפוי נתרן דאוקסי 2% או בתמיסת SDC. נפחו וחלחלו עם תמיסת SDC באותו אופן. טבלו את הריאות בתמיסת SDC למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס ביום השלישי.

שטפו את הרקמה שוב במים נטולי יונים חיצונית ודרך דרכי הנשימה וכלי הדם חמש פעמים. כמו קודם, הסר את הרקמה ממים נטולי יונים וטבול בתמיסת נתרן כלוריד טוחנת אחת. לנפח ולחלחל בתמיסת נתרן כלורי כמו קודם, ולטבול את הרקמה בתמיסת נתרן כלורי למשך שעה בטמפרטורת החדר לאחר שטיפת הריאות מתמיסת נתרן כלורי בחמש שטיפות של מים נטולי יונים.

כמו קודם, רחצו אותם בתמיסת DNA טרייה והחדירו תמיסה זו לדרכי הנשימה ולכלי הדם. דגרו את הריאות בתמיסת DNA למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן הסר את הריאות מתמיסת ה- DNA ושטוף חיצונית עם תמיסת PBS.

טבלו את הריאות בתמיסת PBS ושטפו את התמיסה הזו חמש פעמים דרך דרכי הנשימה וכלי הדם. כמו קודם, אחסן את הריאות בתמיסת PBS בכלי אטום למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס ביום הרביעי. שטפו את הריאות בתמיסת PBS קרה כקרח חמש פעמים דרך דרכי הנשימה וכלי הדם.

לאחר מכן אחסן אותם בתמיסת PBS בכלי אטום סטרילי בארבע מעלות צלזיוס עד לשימוש. הרכיבו את רכיבי הביוריאקטור מתחת למכסה זרימה למינרי בהתאם לסכמה. בפרוטוקול הטקסט, מלאו את החדר הראשי במדיום תרבית שאוזן לאטמוספירה של 5% CO2 של אינקובטור תרבית תאים מיד לפני השימוש בביו-ריאקטור, מרחו את מתאמי צינורית קנה הנשימה וכלי הדם על צינורית הריאה.

התקן את האיברים בתא הביוריאקטור הראשי על ידי רחיצת הריאות במדיום התרבית והצמדת מתאמי הצינורית ליציאות המתאימות במכסה ששונה. לאחר החיבור, הצמד את המכסה בצורה מאובטחת ומהודקת. התא לא ייפתח שוב למשך החזרה, שאב אוויר מהצינור באמצעות יציאות המזרק ומזרק 60 CCC המצויד במחט בגודל 18 המניע את הכיווניות של העצירה התלת-כיווני כדי לכוון את זרימת הנוזל לתוך המזרק.

העבר את תאי הביוריאקטור האטומים המחוברים ברציפות עם איברים מותקנים לחממת תרבית רקמות כדי לאזן את הטמפרטורה והגז. אווררו את הריאות באמצעות משאבת מזרק המחוברת לתא הראשי בנשימה מלאה אחת כל שתי דקות, והזירו את כלי הדם דרך המשאבה הפריסטלטית במהירות של כ-10 מיליליטר לדקה למשך 30 דקות בסך הכל לישיבה בדרכי הנשימה. נפח את הריאות עם מתלה התאים על ידי הזרקה עדינה דרך פתח המזרק המחובר לזין העצירה התלת-כיווני בלולאת הנשימה.

החזק את הריאות באופן סטטי ב-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 למשך הלילה ללא דרכי הנשימה או זלוף כלי הדם כדי לאפשר לתאים להיצמד למטריצת הריאות הנטולת תאים. לאחר הדגירה של הלילה, התחל מחדש את תוכנית האוורור הסטנדרטית של דרכי הנשימה ותרבות, האיברים למשך שלושה עד שבעה ימים לישיבה בכלי הדם. ניתן לשנות את כיווניות נתיב הזרימה מהתא הראשי למאגר ישיבה אנדותל על ידי סיבוב השסתום על זין העצירה הממוקם בצינור, המחבר בין שני התאים הללו תאי אנדותל זרעים בהדרגה באמצעות המשאבה הפריסטלטית תוך ערבוב עדין באמצעות הערבוב המגנטי בסיום הזריעה.

דורכים פרפוזיה ודוגרים באופן סטטי במשך כארבע עד שש שעות. התחל מחדש את הזלוף בכלי הדם עם מדיום תא ראשי בקצב של כ-10 מיליליטר לדקה. תרבית במשך שלושה עד שבעה ימים עם זלוף כלי דם רציף במקביל לתקופת תרבית אוורור דרכי הנשימה.

לאורך תהליך הדה-סלולריזציה, ריאות MCCA הראו הלבנה מתקדמת שהגיעה לשיאה במראה שקוף בסוף התהליך. עם זאת, הריאות שמרו על המאפיינים האנטומיים הגסים שלהן ונותרו אלסטיות ברובן ומסוגלות לייצר רתיעה טבעית לאחר ניפוח עם נוזל. ברמה המיקרוסקופית.

מבנה האולטרה ההיסטולוגי נותר שלם לאחר דה-סלולריזציה. כלומר סימפונות נשימה סימפונות שקים מכתשית. כלי דם ונימים עדיין היו ניתנים להבחנה די ברורה על ידי מיקרוסקופיה בהספק נמוך.

מיקרואנטומיה היסטולוגית, לעומת זאת, הראתה שבעוד שהאנטומיה הגסה והמבנה האולטרה של הריאה הופרעו קלות על ידי דה-סלולריזציה, הרקמה חסרה לחלוטין תאים שלמים כפי שניתן לראות כאן. רק כמויות זעירות של DNA נותרו ברקמות נטולות תאים. יתר על כן, עקבות ה-DNA, שהתרכז על ידי משקעי אלכוהול והוצג בג'ל AROS של 0.8%, היה מורכב בעיקר משברים בעלי משקל מולקולרי נמוך.

היעילות של הסרת חלבון תאי הוערכה על ידי ניתוחי כתמים מערביים של חלבון ריאה טבעי ונטול תאים. ליזאטים באמצעות נוגדן לבטא אקטין, בטא אקטין זוהה בקלות בליזטים ריאתיים מקומיים, אך לא בליזאטים ריאתיים נטולי תאים, מה שמצביע על כך שדה-סלולריזציה דלדלה באופן דרמטי תאים והסירה חומר חלבוני הקשור לתאים 14 יום לאחר זריעת דרכי הנשימה עם תאי גזע מזנכימליים שמקורם במח עצם מאקה או BMCs ותרבית ביו-ריאקטור עם מחזור תפוגה של השראה אחד כל שתי דקות. הפרנכימה של ריאות מאקה דה-סלולריות הייתה יעילה.

BMCs ריפדו את המחיצה המכתשית תוך שמירה על לומן מכתשית שקוף ופתוח. המטריצה המנופחת של דרכי הנשימה הגדולות עוצבה גם על ידי BMCs באמצעות הביו-ריאקטור, המשטח הלומינלי של סימפונות גזע ראשי היה מרופד בשכבה חד-שכבתית של קשקשי כמו BMCs לאחר 14 יום של תרבית. בביו-ריאקטור המוצג כאן נמצאת אונת ריאה ראוס נטולת תאים חמישה ימים לאחר זריעת כלי הדם עם תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ומתן זלוף כלי דם קבוע עם מדיום תרבית אנדותל בחמישה מיליליטר לדקה.

ניתוח היסטולוגי חשף תאים המצפים את כלי הדם הקטנים בפרנכימת הריאה. במקרים מסוימים, נראה כי תאים מחוברים למטריצה באמצעות מספר הקרנות תאיות על פני הלומן, בעוד שחתכים אחרים של כלי דם הראו תאים המרפדים את פני האנדותל בלומן שקוף. בצע הליך זה.

ניתן לבצע שיטות אחרות כמו אימונוהיסטוכימיה, כתם מערבי ו-PCR כמותי בזמן אמת על מנת לענות על שאלות נוספות כמו האם תאי הגזע שנזרעו מתמיינים לתאי שושלת ריאתית לאחר תרבית על מטריצת הריאה הא-תאית או עם תאי אפיתל ואנדותל בוגרים בתוך הביוריאקטור. לאחר צפייה בסרטון זה, אנו אמורים להבין היטב כיצד לבצע דה-סלולריזציה של ריאות פרימטים לא אנושיים ולאחר מכן להשתמש בריאות הא-תאיות המתקבלות כפיגומים לתרבית תאי גזע, תאי אפיתל ותאי אנדותל במערכת ביו-ריאקטור. אל תשכח שעבודה עם רקמות פרימטים לא אנושיות עלולה להיות מסוכנת ביותר ואמצעי זהירות כגון לבישת ציוד מגן אישי מלא, כולל מגן פנים ושכבה כפולה של לטקס או ניטריל יש לנקוט תמיד בכפפות בעת ביצוע הליך זה.