כרוני לטווח ארוך Pseudomonas aeruginosa זיהום דרכי הנשימה בעכברים

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבסס זיהום כרוני מתמשך ארוך טווח בדרכי הנשימה של פסאודומונס אירוגן בעכברים. זה מושג על ידי תרבית ראשונה של זן חיידקי Pseudomonas aerogen הנבחר. השלב השני הוא להטמיע חיידקים בחרוזי אגר קטנים על ידי ערבוב חיידקים עם אגר ושמן מינרלי ב-50 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן קירור התערובת בארבע מעלות צלזיוס תוך ערבוב איטי ומתמשך.

לאחר מכן, השמן המינרלי מוסר על ידי מספר שטיפות עם PBS וחלק מחרוזי האגר הומוגני ומצופה על צלחות אגר כדי לקבוע את תכולת החיידקים, השלב האחרון הוא הזרקת כמה מיקרוליטרים של תרחיף חרוזי האגר לקנה הנשימה של עכברים כדי ליצור זיהום ריאות כרוני של פסאודומונס אירוגן. בסופו של דבר, ניתן לשחזר נוזל שטיפת סימפונות וריאות בנקודות זמן שונות מהאתגר ולצפות אותם על צלחות אגר כדי לזהות את אחוז העכברים הנגועים כרוניים ואת העומס החיידקי בגלי האוויר של עכברים ששרדו. היתרון העיקרי של שיטות אלה על פני השיטות הקיימות הוא בכך שהן מאפשרות זיהום כרוני יציב לטווח ארוך באחוז גבוה של עכברים המוביל להתמדה של עומס חיידקים יציב עד חודש.

שיטות הסיביות של AGA מספקות בריאה של העכבר את המצב המיקרו-אירובי המאפשר לחיידקים לגדול בצורה של מושבות מיקרו. בדומה לגידול בריר של חולי סיסטיק פיברוזיס, שיטות אלו יכולות לעזור לחוקרים לענות על שאלת המפתח על הפתוגנזה של סיסטיק פיברוזיס ומחלות נשימה אחרות ולבדוק טיפולים חדשים נגד זיהום ריאות כרוני של פסאודומונה סגין. השיטות יכולות לשמש גם להשגת זיהום כרוני עם פתוגנים אחרים, כולל הדבקה משותפת של בור XO אפאצ'י או סטפילוקוקוס איריס עם פתוגנים שונים או תחרות ניסויים אפשריים גם המדגימים שההליך יהיה פנו, פוסט-דוקטורנט, וקמיל ריבה, דוקטורנט במעבדה שלי שלושה ימים לפני אתגר העכברים, לחסן לולאה מלאה ב-Pseudomonas air gen מתרבית מלאי מינוס 80 מעלות צלזיוס לצלחת אגר סויה לנסות ולדגור ב-37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

היום שאחרי. בחר מושבה בודדת מחוסנת בחמישה מיליליטר של מרק סויה מנסה ומודגרת ב-37 מעלות צלזיוס למשך הלילה באינקובטור רועד ב-200 סל"ד למחרת בבוקר, לדלל כמות קטנה של תרבית לילה חיידקית במי מלח עם פוספט ב-1 עד 50. לאחר מכן מדוד את הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר.

לאחר מכן, יש לדלל את תרבית החיידקים הלילה על ידי הוספת שני OD של תרחיף החיידקים בצינור חדש המכיל 20 מיליליטר TSB טרי שהודגר ב-37 מעלות צלזיוס למשך כשלוש עד ארבע שעות כדי לרשום שלב בחממה רועדת ב-200 סל"ד עד שמגיעים ל-10 עד 50 OD בסך הכל. ברגע ש-pseudomonas aerosa מגיע לשלב העץ, אסוף את תאי החיידקים על ידי צנטריפוגה ב-2,700 פעמים, כוח הכבידה למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס והשליך את הסופרנטנט. לאחר מכן.

Resus השהה את הכדור החיידקי במיליליטר אחד של PBS סטרילי ומערבולת ביסודיות כדי להשעות אותו לחלוטין. לאחר מכן מערבבים מיליליטר אחד של תרחיף החיידקים עם תשעה מיליליטר של נוזל TSA מאוזן מראש ל -50 מעלות צלזיוס. הוסיפו את התערובת הזו לשמן המינרלי הכבד שמחמם מראש 50 מעלות צלזיוס.

מערבבים מיד שש דקות בטמפרטורת החדר. התסיסה חייבת לייצר מערבולת גלויה בשמן. לאחר מכן מצננים את התערובת לארבע מעלות צלזיוס, תוך ערבוב במהירות המינימלית למשך 35 דקות.

לאחר מכן לנוח בקרח למשך 20 דקות נוספות. לאחר מכן, העבירו את חרוזי האגר לצינורות בז של 50 מיליליטר וצנטריפוגה פי 2, 700. כוח משיכה למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס.

הסר במדויק את השמן המינרלי ושטוף את כדור חרוזי האגר עם PBS סטרילי. חזור על ההליך שש פעמים לאחר שלוש כביסות. ניתן לגלול את החרוזים על ידי כוח הכבידה במקום להשתמש בצנטריפוגה לאחר הכביסה האחרונה.

השעו מחדש את חרוזי האגר ב -20 עד 30 מיליליטר של PBS הומוגני אספטית 0.5 מיליליטר של החרוזים. לאחר מכן, יש לדלל 100 מיקרוליטר מהחרוזים ההומוגניים ב -900 מיקרוליטר PBS סטרילי ובאופן סדרתי. מדללים את החרוזים שש פעמים עד 10 למינוס שישי ביחס של 1 ל-10.

לאחר מכן דילול סדרתי של צלחת על לוחות ה-TSA כולל לא מדולל. דגימה עד 10 למינוס שישית ודגירה על הצלחות ב -37 מעלות צלזיוס. מדוד את קוטר החרוזים באמצעות מיקרוסקופ אור הפוך במספר שדות.

קוטר החרוז חייב להיות בין 100 ל-200 מיקרון לפני שעכברים מאתגרים. ספרו את מספר היחידות היוצרות מושבה על לוחות ה-TSA על מנת לקבוע את מספר ה-CFU למיליליטר בתרחיף חרוז האגר. לאחר מכן התאם את נפח חרוזי האגר לשניים עד ארבעה כפול 10 ל-CFU השביעי למיליליטר כדי להגיע לחיסון אופטימלי של אחד עד פעמיים 10 עד השישי ב-50 מיקרוליטר.

הניחו עכבר זכר בן שישה עד שמונה שבועות שהורדם בעבר בקטמין וקסילזין בשכיבה על כרית חימום, חטאו את הפרווה שלו עם 70% אתנול. חשוף את קנה הנשימה על ידי חתך אנכי של העור. לאחר מכן, השתמש בפינצטה כדי להפריד בין השרירים המכסים את קנה הנשימה.

לאחר מכן קח עד 50 מיקרוליטר של מתלה חרוזי אגר על ידי מזרק מיליליטר אחד. לאחר מכן, יש להחדיר את קנה הנשימה עם קטטר ולחבר את מזרק המיליליטר עם מתלה חרוזי אגר לקטטר. דחוף בעדינות את הבוכנה של המזרק כדי לאפשר להשתיל את החרוזים בריאה.

לאחר מכן סגור את החתך באמצעות קליפס תפרים. בשלב זה. הניחו את העכבר המורדם במצב שכיבה וחטאו את פרוותו באתנול 70%.

לאחר מכן, חשפו את קנה הנשימה ואת כלוב בית החזה על ידי חתך אנכי של העור. לאחר מכן, חשוף את הריאות על ידי חיתוך הסרעפת. הכנס חוט תפר מתחת לקנה הנשימה בעזרת פינצטה והחדיר את קנה הנשימה בעזרת קטטר.

לאחר מכן משוך את שני הקצוות של חוט התפר כדי לקשור את הקטטר לקנה הנשימה ולא את החוט סביב קנה הנשימה. כעת קח מיליליטר אחד ממדיום תרבית התאים באמצעות מזרק מיליליטר אחד והצמד אותו לקטטר. דחוף את הבוכנה של המזרק כדי לשטוף את הריאות, החזר מיד את הנוזל ואחסן אותו בצינור של 15 מיליליטר.

חזור על שלב זה שלוש פעמים עם סך של שלושה מיליליטר מדיום, ולאחר מכן אחסן את נוזל שטיפת הסימפונות על קרח לאיסוף וניתוח הריאות. כריתת הריאות מהעכבר. שוטפים אותם ב- PBS סטרילי.

ואז הפרד את האונות. הכניסו אותם לצינור תחתון עגול עם שני מיליליטר PBS סטרילי ואחסנו על קרח. הומוגניזציה אספטית של הריאות ובאופן סדרתי.

לדלל את ההומוגנאט ב-PBS ביחס של 1 ל-10. לאחר מכן דילול סדרתי של צלחות, כולל הדגימה הלא מדוללת על לוחות ה-TSA ודגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. קח את נוזל ה-BAL מהקרח והטביע אותו בתמיסת טורק ביחס של אחד לשניים תחת מיקרוסקופ אופטי באור הפוך.

ספרו את המספר הכולל של תאים בתא ספירת תאים בורקר לצנטריפוגה דיפרנציאלית של ספירת תאים את נוזל ה-BAL ב-330 פעמים כוח הכבידה למשך שמונה דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הגלולה בריכוז של מיליון תאים למיליליטר במדיום תרבית תאים המכיל 10% מקום סרום בקר עוברי. המיקרוסקופ מחליק ומסנן בחריצים המתאימים בסיבוב הציטו כאשר מסנני הקרטון פונים למרכזו.

פיפטה 150 מיקרוליטר מכל דגימה לבארות המתאימות של הציטוזין והצנטריפוזיה היא צנטריפוגת ציטו בכוח הכבידה פי 300 למשך חמש דקות. לאחר מכן יש להבחין בנקודה של תאים לאחר שניתן לבצע צביעה של ספירת הדיפרנציאל הנקודתית במיקרוסקופ. איור זה מציג את מהלך הזמן של זיהום כרוני של פסאודומונס אירוגן עם PA או זן ייחוס אחד ו-RP 73.

מאמץ קליני לכל נקודת זמן. היסטוגרמות מייצגות את אחוז התמותה הנגרמת על ידי בקטרמיה באדום והישרדות באפור, או אחוז בעלי החיים שנקו את הזיהום בלבן, ואלה המסוגלים לבסס זיהום כרוני בירוק. הזן הקליני pseudomonas aerogen RP 73 יעיל יותר בביסוס זיהום כרוני בהשוואה לזן המעבדה PA oh one.

עכברים ששרדו הומתו בנקודות הזמן שצוינו והריאות נקצרו, הומוגניות ותרבו על לוחות TSA כדי לקבוע את העומס החיידקי. עקומות הגדילה של זני P oh one ו-RP 73 בריאות העכברים מראות שכמות החיידקים בשלושה ימים לאחר ההדבקה גבוהה יותר עבור P oh one בהשוואה ל-RP 73. לאחר מכן, משבעה ימים ואילך, כאשר נוצר זיהום כרוני, העומס החיידקי מתייצב בין 10 לרביעי ובין 10 לחמישי CFU לריאה עבור שני הזנים לאחר שבעה ימים של זיהום כרוני בזן קליני RP 73, הוערך גיוס התאים הדלקתיים בנוזל BAL.

מספר הלויקוציטים הכולל גבוה משמעותית בעכברים נגועים ב-RP 73 בהשוואה לעכברים לא נגועים. התאים המיוצגים ביותר הם נויטרופילים המעידים על תגובה ניכרת של מערכת החיסון המולדת לזיהום כרוני. בתיבה למטה, חיצים מציינים נויטרופילים ומקרופאג כפי שניתן לראות בנקודה על שקופית לאחר סיבוב ציטו.

מוצגים כאן צביעת המטין ואאוזין על חתכים היסטולוגיים של ריאות עכבר לאחר שבעה ימים של זיהום כרוני ב-rp. ניתן לראות חרוזי זן קליניים המסומנים על ידי חיצים בלומן הסימפונות ובמושבות מיקרו של תאי חיידקים. באזורים הנגועים, הסמפונות והפרנכימה הריאתית מאופיינות בגיוס תאים דלקתיים מסיבי.

בעוד שדרכי הנשימה של עכבר לא נגוע היו נקיות מתאים דלקתיים, הקוטר והריכוז הסופי של ה-BES הם פרטים חשובים מאוד. כדי להשיג תוצאה טובה, חשוב לזכור שגודל be מושפע מקצב ההיגוי בשלב הקירור, וכי כמות החיידקים ההתחלתית יכולה להשפיע על הדילול הסופי של החרוזים. יתרה מכך, בחירה בזן פסאודומונה מתאים, הגורם לתמותה נמוכה של עכברים ואחוז גבוה של זיהום כרוני, תמזער את מספר העכברים בשימוש.

לאחר הדבקת עכברים מתבצעת ספירת חיידקים. בנוסף, תגובה דלקתית מבחינת ספירת תאים כוללת ודיפרנציאלית ברמת ה- VIR של הסימפונות, ניתן לבצע ניתוח ציטוקינים נוזליים, בדיקת מלו פרוקסידאז וניתוח היסטולוגי על מנת לחקור את תגובת הכיב לזיהום חיידקי. אל תשכח שעבודה עם פתוגנים אופורטוניסטיים כמו פסאודומונס יכולה לזקן ויש לנקוט תמיד ביישומים, כגון לבישת כפפות, טיפול בחיידקים מתחת לארון בטיחות ביולוגית ושימוש בטכניקות סטריליות.

פיתוח מודלים מתאימים בבעלי חיים איפשר ניסויים פרה-קליניים של מולקולות אנטיבקטריאליות ואנטי דלקתיות חדשות. זהו צעד חשוב להתערבויות טיפוליות עתידיות של זיהום ריאות בחולים הסובלים מסיסטיק פיברוזיס או מחלות נשימה אחרות.