Name: Pseudomonas aeruginosa מושרה ריאות פגיעה דגם (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: למדו ליצור מודל פציעת ריאות בעכברים באמצעות זיהום Pseudomonas aeruginosa דרך הזרקה תוך-קשתית. שיטה זו מאפשרת חקר דלקת ריאות, תיקון רקמות ומנגנוני החלמה בפציעות ריאות חריפות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי המכונים הלאומיים לבריאות HL105947-01 (YL), HL07829-16 (AM), HL090152 (AM).

הניסויים בבעלי החיים אושרו בועדת הטיפול בבעלי חיים וועדות בטיחות הביולוגית המוסדית של אוניברסיטת אילינוי בשיקגו. הערה: כל הנהלים הקשורים Pseudomonas יש לבצע עם רמת הבטיחות הביולוגית 2 שיטות (BSL2), אשר כוללות, אך לא מוגבלות ל: מסכה, משקפי מגן, שמלה או חליפת הגוף, וכפפות כפולות. לעבוד בקבינט בטיחות ביולוגי מוסמך. פנק את המכשירים במגע עם חיידקים עם חומר חיטוי מבוסס אקונומיקה או כלור דו-חמצני. השתמש בקופסה אטומה עבור דגימות תחבורה. 1. פ aeruginosa תרבות וצמיחה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החנות פ aeruginosa PA103 כמו מנית חיידקים בכובע בורג cryovial ב -80 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצנצנת במעמד בקופסא עם מגבות נייר רטוב אתנול 70% ולקחת למעבדה רמת בטיחות הביולוגית 2 (BSL2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פס החיידקים על גבי צלחות אגר דם כבשים ולגדול ב 37 מעלות צלזיוס במשך ~ 15 שעות באינקובטור. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> בברדס BSL2, לשרוט את החיידקים מצלחת עם לולאת חיידקים וגלול ב 5 מיליליטר PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את המניה ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 3 חודשים. עם זאת, לקבוע את כייל כל 2 שבועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סדרתי לדלל את החיידקים בPBS (בדרך כלל מ1:10 4 ל1:10 7) וצלחת את הדילול הידוע על צלחות אגר דם כבשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הצלחות במשך ~ 15 שעות. רוזן מושבות ולחשב מושבה יחידה להרכיב (CFU) כדי לקבוע את ריכוז חיידקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend הריכוזים המתאימים (~ 5 x 10 3 CFU / μl) ב0.5 מיליליטר PBS ב 1.5 מיליליטר cryovials כובע בורג סטרילי. חותם את cryovials ולמקם אותם במעמד cryovial על מגבות נייר עמוסות חומר חיטוי בקופסא מכסה הצמד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את התיבה למתקן בעלי החיים BSL2. ברגע שיש, לפתוח את התיבה בממשלת BSL2. </li></ol> 2. פ aeruginosa החדרה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע סביבה נקיה מחיידקי ניתוח הישרדות (כפפות סטריליות, כלים סטריליים, וטכניקות ספטית). השתמש בוילון סטרילי כדי לספק משטח עבודה עבור מכשירי ניתוח סטרילי (autoclaved). לעקר מכשירים באמצעות מעקר חרוז חם בין כל הליך החדרה לקנה הנשימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול עכברים לפני הרדמה. הרדימי עכברים עם קטמין (100 מ&quot;ג / קילוגרם), xylazine (5 מ&quot;ג / קילוגרם), ב0.1-0.2 מיליליטר PBS intraperitoneally (IP). לקביעת היעילות של ההרדמה על ידי אי-היענות לקמצוץ הבוהן. השתמש במשחת וטרינר על עיניים למניעת יובש בהרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרסן את העכברים על לוח כירורגית בקבינט BSL2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את האזור לחתוך כלפי מטה. לגלח אזור זה ולהכין את העור באמצעות לסירוגין מטליות יוד אלכוהול וpovidone 3 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנק את אזור החתך עם הרדמה מקומית (לידוקאין) והרדמה זו, די בניתוח קטן כמו חתך בעור כדי לגשת לקנה הנשימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך קטן (5 מ&quot;מ בערך) על קו האמצע של הצוואר, ולהשתמש F הבוטהorceps להזיז בעדינות את השרירים לגישה לקנה הנשימה. לחשוף את קנה הנשימה על ידי נתיחה כירורגית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצייר פתרון חיידקים לתוך מזרק חד פעמי 1 מיליליטר עם 27 מחט G. עבור כל עכבר, לנהל 20-30 μl של חיידקים בריכוז המתאים (עד 10 5 CFU כל עכבר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס מחט לתוך קנה הנשימה. הזרק פתרון לאט לתוך קנה הנשימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שההתנשפויות של בעלי החיים, אשר בדרך כלל מצביעה על הפתרון שהגיעו לריאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את הפצע עם תפרים סטריליים (6-0 monofilament) בתנאי ספטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 0.1 מ&quot;ג / קילוגרם עצירות על ידי הזרקה תת עורית כשיכוך כאבים לאחר הניתוח לטיפול בכאב לאחר ניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שהזמן הנדרש מאינדוקצית הרדמה ראשונית לחתך סגר הוא פחות מ -15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הזרקה, להיפטר ממזרקים ומחטים במכל חד Biohazard מתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנק את מכשירי ניתוח עם דסק&quot;ש מבוסס כלור דו-חמצניnfectant במשך 15 דקות, לשטוף ולחזור למעבדה לעיקור ולעשות שימוש חוזר במידת צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בית העכברים ביחידים בכלובים נקיים בסביבה חמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו על בעלי החיים בכל 30 דקות עד שהוא חוזר להכרה ומתחיל לנוע; ולאחר מכן במרווחים של 12 שעות לניתוח שלאחר 3 ימים הראשון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על העכברים במתקן BSL2 בעלי החיים לאורך כל הניסוי. ודא שהרקמה היחידה הכלולה בקופסא אטומה עוזבת את מתקן BSL2 בעלי החיים. אם העכברים לבטא כל אחת מההתנהגויות גוססות (שהוגדר כמצוקה נשימתית, עייפות, אי ambulate בתגובה לגירוי עדין) בכל נקודה במחקר, להרדים את העכברים על ידי ה- CO 2 שאיפה ממקור בבקבוקים ואחריו נקע בצוואר הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את נושא הניסיון על ידי exsanguination תחת הרדמה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף רקמת ריאה מעכברים מורדמים. לבצע הליכים אלה בברדס BSL2. במידת הצורך, להעביר את המדגם באמצעות צינורות אטומים ממוקמים בRACk על מגבות נייר עמוסות חומר חיטוי בקופסא מכסה הצמד לתהליך נוסף. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Ware, L. B., Matthay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+acute+respiratory+distress+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">The acute respiratory distress syndrome.</a> N Engl J Med. 342, 1334-1349 (2000).</li>
<li>Matthay, M. A., Ware, L. B., Zimmerman, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+acute+respiratory+distress+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">The acute respiratory distress syndrome.</a> J Clin Invest. 122, 2731-2740 (2012).</li>
<li>Shimabukuro, D. W., Sawa, T., Gropper, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injury+and+repair+in+lung+and+airways%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Injury and repair in lung and airways.</a> Crit Care Med. 31 (8), 524-531 (2003).</li>
<li>Wansleeben, C., Barkauskas, C. E., Rock, J. R., Hogan, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+of+the+adult+lung%3A+Their+development+and+role+in+homeostasis%2C+regeneration%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Stem cells of the adult lung: Their development and role in homeostasis, regeneration, and disease.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 131-148 (2013).</li>
<li>Singleton, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamin+2+and+c-abl+are+novel+regulators+of+hyperoxia-mediated+nadph+oxidase+activation+and+reactive+oxygen+species+production+in+caveolin-enriched+microdomains+of+the+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Dynamin 2 and c-abl are novel regulators of hyperoxia-mediated nadph oxidase activation and reactive oxygen species production in caveolin-enriched microdomains of the endothelium.</a> J Biol Chem. 284, 34964-34975 (2009).</li>
<li>Sadikot, R. T., Blackwell, T. S., Christman, J. W., Prince, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogen-host+interactions+in+pseudomonas+aeruginosa+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Pathogen-host interactions in pseudomonas aeruginosa pneumonia.</a> Am J Respir Crit Care Med. 171, 1209-1223 (2005).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxm1+mediates+the+progenitor+function+of+type+ii+epithelial+cells+in+repairing+alveolar+injury+induced+by+pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Foxm1 mediates the progenitor function of type ii epithelial cells in repairing alveolar injury induced by pseudomonas aeruginosa.</a> J Exp Med. 208, 1473-1484 (2011).</li>
<li>Kurahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+septic+shock+in+pseudomonas+aeruginosa+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of septic shock in pseudomonas aeruginosa pneumonia.</a> J Clin Invest. 104, 743-750 (1999).</li>
<li>Kumar, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distal+airway+stem+cells+yield+alveoli+in+vitro+and+during+lung+regeneration+following+h1n1+influenza+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Distal airway stem cells yield alveoli in vitro and during lung regeneration following h1n1 influenza infection.</a> Cell. 147, 525-538 (2011).</li>
<li>Delano, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sepsis+induces+early+alterations+in+innate+immunity+that+impact+mortality+to+secondary+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunology%22%5BJournal%5D)">Sepsis induces early alterations in innate immunity that impact mortality to secondary infection.</a> J Immunology. 186, 195-202 (2011).</li>
<li>Lange, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+model+of+sepsis+following+smoke+inhalation+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">A murine model of sepsis following smoke inhalation injury.</a> Biochem Biophys Res Commun. 391 (3), 1555-1560 (2010).</li>
<li>Kobayashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+chemokines+in+neutrophil+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">The role of chemokines in neutrophil biology.</a> Front Biosci. 13, 2400-2407 (2008).</li>
<li>Matute-Bello, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Animal models of acute lung injury.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 295, L379-L399 (2008).</li>
<li>Sadikot, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+immunomodulation+of+the+nf-kappab+pathway+in+airway+epithelium+impacts+host+defense+against+pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Targeted immunomodulation of the nf-kappab pathway in airway epithelium impacts host defense against pseudomonas aeruginosa.</a> J Immunol. 176, 4923-4930 (2006).</li>
<li>Pinto, I. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+experimental+model+of+neutrophilic+pulmonary+response+induction+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pneumologia%22%5BJournal%5D)">Development of an experimental model of neutrophilic pulmonary response induction in mice.</a> J Pneumologia. 29, 213-214 (2003).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

מודל פציעת ריאות עכבר Pseudomonas שאנחנו מתארים כאן מחקה את כל התהליך של דלקת, פציעת ריאות, תיקון, ורזולוציה המתרחש בעקבות פציעת ריאות חריפה או דלקת ריאות. יש לו יתרונות ייחודיים השוואה עם מספר מודלים פציעה אחרים בכך שהוא קליני רלוונטי ובטוח יחסית וקל לטפל. השלב הקריטי בהליך הוא שההזרקה של תמיסת חיידקים צריך להיות איטיים מאוד. אם הזריקה היא מהירה מדי, העכברים עלולים למות בחנק. לאחר זריקה מוצלחת, העכברים בדרך כלל ...

ריאות נחשפות לפתוגנים סביבתיים ורגישות לדלקת והפגיעה 1-3. במהלך מצבים פתולוגיים כגון דלקת ריאות או מצוקה נשימתית מבוגר תסמונת (ARDS), פתוגנים כמו גם גורמים דלקתיים שפורסמו על ידי כדוריות דם לבנות לגרום לפציעה ולמוות של תאי שומן 1-3. חשוב לפתח מודלים של בעלי חיים לפגיעה ריאות חריפות כדי להקל על המחקר של הפתולוגיה של פגיעה, כמו גם מנגנון של תיקון. נכון לעכשיו, רוב האנשים משתמשים במודלי פציעת ריאות hyperoxia ועכבר מושרה בליאומיצין 4. עם זאת, המנגנונים של hyperoxia גרמו לפציעה היא לא אותו הדבר כמו רוב פציעות ריאות שכיחות המתרחשות במהלך דלקת ריאות או ARDS 5. פציעה אקוטית נגרמת בליאומיצין היא נדירה בהקשר קליני 4. כאן אנו מדווחים מודל פציעת ריאות עכבר באמצעות זריקה תוך קנה הנשימה של פ aeruginosa 6,7. מודל זה הוא רלוונטי מבחינה קלינית, ומחקה את processes שיקרה בעקבות דלקת ריאות 8. כפתוגן אופורטוניסטי, nosocomial של אנשים מדוכאי חיסון, פ aeruginosa בדרך כלל מדביק את מערכת הריאות, בדרכי שתן, כוויות, פצעים, וגם גורם לזיהומים בדם אחרים 6. החיידקים לשחרר exotoxin גורם ארסיות, להתרבות ולגרום לתגובה חיסונית 6. ממשל Intra-trachael של פ aeruginosa משקף את המצב בחשיפה של בני אדם לחיידק שגורם לדלקת ריאות ופתולוגיה עשויה להיות שונה מהמודל שדיווח לאחרונה H1N1 וירוס שפעת הריאות הנגרמות פציעת 9. מאז פ aeruginosa הוא פתוגן אופורטוניסטי, זה בטוח יחסית לטיפול, בהשוואה לחלק מגורמי המחלה האלימה יותר. כאן השתמשנו בהזרקה תוך קנה הנשימה לנהל את החיידקים כי אנחנו ציינו כי שיטה זו הציגה יותר חיידקים לאזור alveoli הדיסטלי של הריאה בהשוואה לכמה נהלים אחרים כגון שימוש בצנתר דרך פה. בהשוואה לדגמי פציעת ריאות חריפות אחרים, פ מודל aeruginosa שתואר כאן הוא מתאים ללימוד פציעת ריאות הנגרמת על ידי חיידקים ועל ידי דלקת מופרזת. בניגוד למודלים של בעלי חיים אחרים המשתמשים בפ aeruginosa לגרום אלח דם 10,11, כאן אנו משתמשים בהזרקה תוך-קנה הנשימה של חיידקים אלה לגרום לפגיעת ריאות חריפה מקומית.

<table><tbody><tr><td>הרדמה: קטמין, קסילזין, לידוקאין, בופרנורפין</td><td></td><td></td><td>מחט פרמצבטית בדרגה</td></tr><tr><td>27 גרם</td> מזרק <td>פישר</td><td>1482648</td><td></td></tr><tr><td>פישר</td><td></td><td>14823434</td> מספריים <td>1 מ"ל</td></tr><tr><td>כלים</td><td></td><td></td><td>מדעיים עדינים</td></tr><tr><td>מלקחיים</td> כלי <td></td><td></td><td>מדע עדין</td></tr><tr><td>תפרים&nbsp;</td><td>פישר</td><td>19-037-526</td><td></td></tr><tr><td>מד עין, כפפה, שמלה</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ארון</td><td></td><td></td><td></td>בטיחות ביולוגית</tr><tr><td>חומר חיטוי</td><td></td><td></td> מבוסס כלור דו חמצני <td>Clidox</td></tr><tr><td>כבשים דם אגר צלחות אגר&nbsp;</td><td>אספקת מדקס</td><td>HL-1160</td><td></td></tr></tbody></table>

pseudomonas aeruginosa מושרה ריאות פגיעה דגם

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

על מנת ללמוד פציעת אדם חריפה ריאות ודלקת ריאות, זה חשוב לפתח מודלים של בעלי חיים כדי לחקות את התכונות פתולוגיים שונות של מחלה זו. כאן יש לנו פיתחנו מודל פציעת ריאות עכבר על ידי הזרקה תוך קנה הנשימה של חיידקי Pseudomonas aeruginosa (פ aeruginosa או הרשות הפלסטינית). שימוש במודל זה, שהיינו מסוגל להראות דלקת ריאות בשלב המוקדם של פציעה. בנוסף, דליפות מחסום האפיתל נֹאדִי נצפו על ידי ניתוח שטיפה ברונכואלוואולרית (BAL); והמוות של תאי נֹאדִי נצפה על ידי assay Tunel באמצעות רקמה הוכנה מריאות נפגעו. בשלב מאוחר בעקבות פציעה, שצפינו התפשטות תאים הנדרשת לתהליך התיקון. הפציעה הוחלט 7 ימים מהייזום של פ הזרקת aeruginosa. מודל זה מחקה כמובן רציף של דלקת ריאות, פגיעה ותיקון בדלקת ריאות. מודל חיה רלוונטי מבחינה קלינית זה מתאים ללימוד פתולוגיה, מנגנון של תיקון, וollowing פציעת ריאות חריפה, והוא יכול גם לשמש לבדיקת סוכנים טיפוליים פוטנציאליים למחלה זו.

החל מ 24 - לאחר שעות 72 P. הזרקת aeruginosa, תאי מוגבר נצפה בחלקי ריאה (איור 1 א-ד). הריאות החלו להתאושש מהודעת 96 שעות פציעה (איור 1E). בשעת 7 ימים הודעה P. aeruginosa, מורפולוגיה alveoli נורמלית שוחזרה במידה רבה (איור 1F). חלקי ריאה באמצעות מכתים מנהרה שהוכנו בהודעת שעה 24 P. aeruginosa הראה מוות של תאים בתאי alveoli (איור 1G-I). על מנת ללמוד את תהליך התיקון במודל פגיעה זו, Br...

פיתחנו מודל פגיעה ריאתית של עכבר על ידי הזרקה תוך-קנה של חיידקים Pseudomonas aeruginosa. מודל זה מחקה פגיעה ריאתית במהלך דלקת ריאות והוא רלוונטי מבחינה קלינית.

Pseudomonas aeruginosa מושרה ריאות פגיעה דגם

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לחקות דלקת ריאות, מצבי פגיעה ריאתית בעכבר על ידי מתן פסאודומונס אירוגן. זה מושג על ידי הכנת פסאודומונס תחילה בריכוז המתאים להזרקה. בשלב השני, קנה הנשימה של העכבר נחשף בזהירות ולאחר מכן החיידקים מועברים לריאות על ידי הזרקה תוך קנה הנשימה.בשלב האחרון עוקבים בקפידה אחר התקדמות המחלה בעכבר. בסופו של דבר, ניתן לחקור דלקת ריאות, מוות תאים, שינויים במחסום המכתשית ותיקון ריאות בריאה של עכבר בהזרקת פסאודומונס אירוגן. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על הטיפול בפגיעה ריאתית חריפה הנגרמת על ידי דלקת ריאות.מכיוון שמודל זה מחקה את התהליכים בעקבות דלקת ריאות כדי ליצור quats של p Aerogen, PA 1 0 3 להתקנה התחל בהובלת בקבוקון קריו של החיידקים ממינוס 80 מעלות צלזיוס, אחסון לרמת בטיחות ביולוגית שתיים או BSL שתי מעבדה במדף בקופסה מרופדת במגבות נייר רטובות אתנול 70%. לאחר מכן, תחת פס BSL של שני מכסה המנוע, מושבות החיידקים P aerogen PA 1 0 3 על צלחות אגר דם כבשים, ומגדלות את המושבות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס. לאחר כ-15 שעות, השתמש בלולאת חיידקים כדי להעביר את המושבות לחמישה מיליליטר PBS.לאחר מכן יש לדלל באופן סדרתי את החיידקים ביותר PBS לאחד עד 10, לארבעה, לאחד עד 10 לשבעת הריכוזים כדי להוציא את הדילול על צלחות אגר דם כבשים טריות. לאחר כ-15 שעות דגירה נוספות, חשב את היחידות היוצרות מושבה עבור כל צלחת כדי לקבוע את ריכוז החיידקים. לאחר מכן, Eloqua את הכמות המתאימה של חיידקים ב-0.5 מיליליטר PBS ב-1.5 מיליליטר, בקבוקוני קריו של מכסה בורג סטרילי, ולאחר מכן הניחו את הבקבוקונים האטומים במתלה בקבוקון קריו על מגבות נייר עמוסות בחומרי חיטוי בקופסת מכסה הצמד בארון BSL two, כסו בעדינות את עיני החיה במשחת וטו עובדת.גלח במהירות את החתך ונקה את העור באמצעות ספוגיות לסירוגין של אלכוהול ויוד פובידון שלוש פעמים ואשר טשטוש לפי הבוהן. צבט, רסן את העכבר על לוח כירורגי לאחר טיפול בעור בהרדמה מקומית. לאחר מכן, בצע חתך קטן של חמישה מילימטרים בקו האמצע של צוואר החיה והשתמש במלקחיים קהים כדי להזיז בעדינות את השריר כדי לגשת לקנה הנשימה.כאשר קנה הנשימה נחשף, משוך עד פעם אחת 10 לחמש יחידות יוצרות המושבה של החיידק ב-20 עד 30 מיקרוליטר של PBS למזרק חד פעמי של מיליליטר המצויד במחט בגודל 27. לאחר מכן הכנס את המחט לקנה הנשימה והזריק לאט את התמיסה. ודא שהחיה מתנשפת, מה שבדרך כלל מעיד על כך שהתמיסה הגיעה לריאות.כעת סגור את הפצע באופן אספטי עם שישה תפרים סטריליים אפס מונופילמנט ובצע את משככי הכאבים לאחר הניתוח. לאחר מכן השלך את המזרקים והמחטים למיכל החדים הביולוגי המתאים לאחר הזרקת כל בעל חיים. איך המאיירס מסתובבים לבד בכלובים נקיים בסביבה חמה?בודקים את בעלי החיים כל 30 דקות עד שהם חוזרים להכרה ומתחילים לנוע. טפל במכשירי הניתוח בחומר חיטוי כלור דו חמצני למשך 15 דקות. לאחר מכן יש לשטוף ולהחזיר את הכלים למעבדה להמשך עיקור לפי הצורך.לשכן את העכברים במתקן BSL שני בעלי חיים לאורך כל הניסוי ולאחר מכן לאחר הוצאה בהרדמה, לאסוף את רקמת הריאה מכל חיה מתחת למכסה המנוע של BSL. לבסוף, אם רוצים עיבוד נוסף, העבירו את הדגימות בצינורות אטומים המונחים על מתלה על מגבות נייר עמוסות בחומר חיטוי בקופסת מכסה הצמדה למתקן העיבוד המתאים. בניסוי מייצג זה 24 עד 72 שעות לאחר הזרקת P, ניתן להבחין בתאייות מוגברת בקטעי הריאות.עד 96 שעות, הריאה החלה להתאושש ובשבעה ימים, המורפולוגיה הרגילה של הנאדיות משוחזרת ברובה. צביעת מנהרה של קטעי ריאה שהוכנו 24 שעות לאחר התקנת P aerogen מציגה מוות תאים בתוך תאי הנאדיות כדי לחקור את תהליך התיקון. בפציעה זו, ניתן להזריק את דגם BRDU לעכברים שלושה ימים לאחר מתן p aerogen.כפי שמודגם, בעלי חיים שטופלו ב-p aerogen מציגים התפשטות יתר ברקמת הריאה בהשוואה לבעלי חיים שטופלו בביקורת. כדי לחקור את השינויים במחסום, בחדירות ובדלקת לאחר פציעה, ניתן לאסוף שטיפת סימפונות או נוזל מעיים בנקודות זמן שונות. לאחר הזרקת אירוגן, למשל, ריכוז החלבון במעי גדל משמעותית לאחר 48 שעות לאחר התקנת החיידקים, מה שמעיד על דליפת מחסום האפיתל במספר התאים.המעי גם גדל באופן משמעותי בשלב זה, מה שמרמז על תגובה דלקתית ארבעה עד חמישה ימים לאחר הזרקת P, גם רמת חלבון המעי וגם מספר התאים מתחילים לרדת מה שמרמז על התאוששות. יתר על כן, רמה של חלבון דלקתי מקרופאגים 2, ציטוקין המעורב במשיכת נויטרופילים עולה משמעותית לאחר 48 שעות ואז חוזרת לרמות הבסיס לאחר 96 שעות. בליזטים ריאתיים ללא p aerogen נצפה רק מספר קטן של מונוציטים בנוזל המעי.לעומת זאת, מספר רב של נויטרופילים נמצאים במעי, מבודדים 48 שעות לאחר ההזרקה. עד 96 שעות, הרכב התאים של המעי חוזר לרמות השליטה לאחר הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות כמו איסוף היסטולוגי, חתך או איסוף שטיפת סימפונות כדי לענות על שאלות נוספות כגון, אילו תאים או גורמים מעורבים בדלקת ובתיקון לאחר פגיעה ריאתית חריפה?

pseudomonas-aeruginosa-induced-lung-injury-model

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

אנו מתארים את השיטה אגר חרוזים להקים זיהום מתמשך לטווח ארוך כרוני Pseudomonas aeruginosa בדרכי אוויר במודל העכבר.

כרוני לטווח ארוך<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; זיהום דרכי הנשימה בעכברים

אנו מתארים שיטה לגרימת דלקת ריאות neutrophilic על ידי אתגר לlipopolysaccharide תרסיס על ידי עִרפּוּל, מודל פציעת ריאות חריפה. בנוסף, טכניקות ניתוחיות בסיסיות לבידוד ריאה, אינטובציה לקנה הנשימה ושטיפה ברונכואלוואולרית הם גם תיארו.

שיטה ליצירת ריאות neutrophilia שימוש התרסיס lipopolysaccharide

בעוד שמחקר במבחנה של אינטראקציות מארח-פתוגן מאפשר אפיון של תגובות חיסוניות ספציפיות, מודלים in vivo נדרשים כדי להתבונן בהשפעות של תגובות מורכבות. באמצעות חשיפה לקנדידה אלביקנס ואחריה זיהום ריאות בתיווך Pseudomonas aeruginosa, הקמנו מודל עכברי של אינטראקציות מיקרוביאליות המעורבות בפתוגניות של דלקת ריאות הקשורה למכונת הנשמה.

לומד קהילות חיידקים<em&gt; In vivo</em&gt;: דגם של אינטראקציה בתיווך בין מארח<em&gt; קנדידה אלביקנס</em&gt; ו<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; באיירווייס

מספר שיטות תוארו בספרות למידול דלקת ריאות חיידקית בעכברים. בזאת, אנו מתארים לא פולשנית, לא יקר, שיטה מהירה גרימת דלקת ריאות באמצעות שאיפה (כלומר, שאיפה) של בידוד חיידקי pipetted לתוך הלוע התחתון. שיטות Downstream להערכה של התגובה החיסונית המולדת ריאתי הם גם מפורטות.

שיטה לא פולשנית הטכנית ללא עתירי עבור אינדוקצית phenotyping של דלקת ריאות חיידקית הניסויית עכברים

מתוארת שיטה לקביעת זיהומי ריאות במכרסמים בעלי יכולת חיסונית. עם מיומנות, ניתן לבצע שיטה זו במהירות ובקלות כדי לגרום לזיהום יציב עם מבודדים רבים של S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae ו-A. baumannii.

מודל דלקת ריאות חזק במכרסמי immunocompetent להערכת יעילות אנטיבקטריאלי נגד<i&gt; S. pneumoniae</i&gt;,<i&gt; H. אינפלואנזה</i&gt;,<i&gt; K. pneumoniae</i&gt;,<em&gt; P. aeruginosa</em&gt; או<em&gt; A. baumannii</em

שיטות פשוטות מתוארים על הפגנת הייצור של amyloids ציטוטוקסיות בעקבות זיהום של אנדותל ריאתי על ידי Pseudomonas aeruginosa.

שיטות זיהוי ציטוטוקסיות Amyloids הבאים זיהום של אנדותל תאי הריאות על ידי Pseudomonas aeruginosa

הציג כאן הוא צעד אחר צעד הליך כדי לגרום לפציעה ריאה חריפה בעכברים על ידי ישירה intratracheal ליפוסכאלפסיד ולבצע ניתוח FACS של דגימות דם, ברונמכתשי נוזל ששטיפה, ורקמות ריאות. מיניציה מינימלית, טיפול פשוט, תוכנות טובה, ו טיטור של חומרת המחלה הם יתרונות של גישה זו.

גרימת פציעה חריפה של הריאה בעכברים על ידי הישירה ליפופוליסכראסטיליאלגרלציה

אנו מתארים פרוטוקול חיסונים מושהה ליצירת זיהומים כרוניים הפצע בעכברים המוסמכים.

מדבקת החיסון נגד הידבקות כרונית בנגיף הדלקת בפצע

כתב יד זה מתאר את ביסוס מודל זיהומי של דלקת ריאות בעכברים ואת אפיון פתרון הפגיעה בהתאמה יחד עם שיטות לגידול חיידקים והחדרה תוך טרכיאלית. מתוארת גם גישה חדשנית המשתמשת בציטומטריית זרימה בממד גבוה להערכת הנוף החיסוני.

מודל ניסיוני להערכת רזולוציה של דלקת ריאות

כיום חסרים מודלים in vivo המתאימים לבדיקת תרופות נגד זיהומים חיידקיים כרוניים. כאן, אנו מתארים פרוטוקול לזיהום פצע על ידי מבודד קליני של Pseudomonas aeruginosa כדי ליצור זיהום מתמשך בזחלי דג הזברה.

מידול זיהום מתמשך של Pseudomonas aeruginosa בזחלי דג זברה פצועים

במחקר זה, טכניקת החדרה אנדוטרכיאלית לא פולשנית הוכחה כמפתחת ALI בעכברים באמצעות לרינגוסקופ בסיסי להבטחת העברת LPS מדויקת לריאות. ה-LPS מושתל דרך צינור אנדוטרכיאלי באמצעות לרינגוסקופ. גודל הפגיעה בריאתיות מוערך במספר נקודות זמן.

מתן לא פולשני של ליפופוליסכריד באנדוטרכיה כדי לגרום לפגיעה ריאתית חריפה אצל מכרסמים

למדו ליצור מודל פציעת ריאות בעכברים באמצעות זיהום Pseudomonas aeruginosa דרך הזרקה תוך-קשתית. שיטה זו מאפשרת חקר דלקת ריאות, תיקון רקמות ומנגנוני החלמה בפציעות ריאות חריפות.

Pseudomonas aeruginosa מושרה ריאות פגיעה דגם

גלה סרטונים נוספים