יישום מערכת ביטוי עין מתנהלת לחקר הפרעות של גורמים בקטריאלי ארסיות עם איתות תאיים

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לחקור את ההפרעה של גורמי virulent של חיידקים לאיתות תוך-תאי. מטרה זו מושגת על ידי הקמת קווי תאים יציבים המבטאים את החלבון הנחקר. כדי לבחון את פעילותו ברמת תאים במסה (bulk cell level), כשלב שני, נוצרת מערכת וקטור ביטוי הניתנת להשראה, המאפשרת להפעיל מסלול איתות בתא המאחס בשלב מוגדר. לאחר מכן, ייבחן האם החלבון הנחקר יכול להפריע להפעלת מסלול האיתות של תא המאחס, וזאת במטרה לצמצם את נקודת הפעילות של החלבון הנחקר. התוצאות מראות, על בסיס ניתוח western blotting, כי גורם ה-virulence KA B של cozy yellow Burnett מפריע למסלול האפופטוזיס במורד הזרם של backs ובמעלה הזרם של הפעלת cascade three.

שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הביולוגיה של מחלות זיהומיות, כגון זיהוי השלב המכריע בשרשרת העברת אותות שבו חלבון אפקטור חיידקי נתון מפריע. הדבר לא רק יעזור לנו להבין טוב יותר כיצד מיקרואורגניזמים פתוגניים מניפולט את המארחים שלהם, אלא גם כיצד תהליכים תאיים בסיסיים אלו פועלים. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי אסטרטגיות חיידקיות למניעת מוות תאי אפופטוטי, ניתן ליישמה גם למערכות העברת אותות אחרות בתחום מוות התאים, כגון נמק (necrosis) או פירופטוזיס (pyroptosis), או אף לרשתות סיגנלינג המעורבות בשגשוג תאים, בבקרת גנים או בתגובות של מערכת החיסון.

את הפרוצדורה תדגים סטפני בסלר (Stephanie Besler), סטודנטית לתואר מתקדם מהמעבדה של Mann. התחילו את הפרוצדורה על ידי זריעת תאי HEK 2 93 המבטאים באופן יציב GFP או GFP, say B בצלחת 12 באריים בצפיפות של 100, 000 תאים לבאר.

בשלב הבא, הכין בנפרד את ה-DNA ואת ריאגנט הטרנספקציה פוליאתילן ב-75 µL של מצע opt, והדגר למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר ליצירת קומפלקסים. הדגר את שתי התערובות יחד למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסף את תמיסת הפוליאתילן-DNA טיפה אחר טיפה לתאים והדגר ב-37 °C ב-5% CO2.

חמש שעות לאחר הטרנספקציה, גרמו לביטוי של החלבונים הפרו-אפופטוטיים על ידי הוספת 1 µg/mL של doxycycline למצע התרבית. לאחר מכן, דגרו את התאים למשך 18 שעות ב-37 °C ב-5% carbon dioxide תחת מיקרוסקופ אור. בדקו את התאים כדי לוודא השראת מוות תאי לפני האיסוף.

בחן את התאים שעברו אפופטוזה מושרית, שניתן לזהותם על ידי נוכחותם של גופי אפופטוזה. לאחר מכן, הסר את העליון (supernatant) ושטוף את התאים ההיצמדים. לאחר שטיפה אחת ב-PBS חם, השהה מחדש את התאים ב-100 µL של בופר דגימות lamby בריכוז פי 2.

לאחר מכן, חממו למשך חמש דקות ב-95 °C ואחסנו ב-20 °C- לשימוש מאוחר יותר. לאחר מכן, טענו 6 µL של סולם חלבונים מסחרי כסמן למשקל מולקולרי. לאחר מכן, טענו כ-40,000 תאים לדגימה על ג'ל SDS-PAGE בריכוז של 12%.

הרץ את הג'לים במערכת אלקטרופורזה של ג'ל תחת מתח קבוע של 180 volts למשך 45 עד 60 דקות עם תמיסת ריצה (running buffer) בריכוז one x laly. לאחר מכן, בצע BLO של החלבונים על ממברנות PVDF במתח קבוע של 16 volts למשך 60 דקות. השתמש בתא העברה חצי-יבש (semi-dry transfer cell) מדגם trans blot SD, ולאחר מכן חסום את הממברנות ב-10 milliliters של MPT למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.

דללו שבעה µL של נוגדן anti cleaved PARP בתוך שבעה mL של MPT. דגרו את ממбраסת ה-PVDF עם תמיסת הנוגדנים למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C. הסירו את תמיסת הנוגדנים ובצעו שלושה שלבי שטיפה של 10 דקות עם PBS 0.05%Tween 20, ולאחר מכן דגרו את הממברסות עם 1.4 µL של נוגדנים משניים המצומדים ל-horse radish peroxidase, המדוללים בשבעה mL של MPT, למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.

שטפו את הממברנות שלוש פעמים עם PBS 0.05%Tween 20, וגלו את פעילות ה-horseradish peroxidase באמצעות ערכה מסחרית בהתאם לפרוטוקול היצרן. השתמשו בציוד סטנדרטי לפיתוח סרט כדי להדמות את פסי החלבון. לאחר מכן, הסירו את הנוגדנים הקשורים על ידי דגירה של הממברנות עם שבעה מיליליטר של western blot stripping buffer למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, לאחר שלושה שטיפות עם PBS 0.05%Tween 20, ובצעו סריקה של הממברנות עם ארבעה מיקרוליטר של נוגדן anti actin בתוך ארבעה מיליליטר של MPT למשך לילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.

למחרת, בצעו שלושה שלבי שטיפה של 10 דקות לממברנות עם כ-10 milliliters של PBS 0.05%Tween 20, ולאחר מכן הדגירו את הממברנות עם 1.4 microliters של נוגדנים משניים המצומדים ל-horse radish peroxidase המדוללים בשבעה milliliters של MPT למשך שעה אחת של דגירה בטמפרטורת החדר. שטפו את הממברנות שלוש פעמים עם PBS 0.05%Tween 20, גלו את הפעילות של horse radish peroxidase באמצעות ערכה מסחרית והשתמשו בציוד סטנדרטי לפיתוח סרט כדי להדגים את פסי החלבון. בניסוי זה, נערך immuno blooding של ליזאטים של תאים שלמים של תאי HEK 2 93 GFP ותאי HEK 2 93 GFP sabe עבור GFP כדי להראות ביטוי יציב.

ניתוח ציטומטריית זרימה מייצג של תאי HEK 2 93 GFP ותאי HEK 2 93 GFP sabe מראה את עוצמת ביטוי ה-GFP. תאי HEK 2 93 GFP ותאי HEK 2 93 GFP sabe טופלו ב-four micromolar sporin למשך שש שעות כדי להשרות אפופטוזיס אינטרינזי. האפופטוזיס נותח באמצעות ניתוח immuno blot של cleaved PARP, שבו נמצא כי פיצול ה-PARP פחת בתאי HK 2 9 3 GFP SA B בהשוואה לתאי HK 2 93 GFP.

CB מגן מפני אפופטוזיס המושרה על ידי bax, אך לא מפני אפופטוזיס המושרה על ידי caspase three. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לבחון כמה שיותר רכיבים של מסלול השליחויות כדי לסייע בזיהוי שלב האינטראקציה. כמו כן, מומלץ לבחון חלבונים המופעלים הן במצבם הבסיסי והן במצבם הפעיל, כדי לקבוע אם חלבון האפקטור שנבחר מפריע למסלול עצמו, או שמא לשלב ההפעלה העוקב לפרוצדורה זו.

ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון knockdown, knockout, yeast two hybrid, pull down, בדיקות של מודיפיקציות פוסט-טרנסלציונליות או בדיקות יציבות פרוטאלוליטית, כדי לענות על שאלות נוספות, כגון: מהם המנגנונים המולקולריים המדויקים שבהם משתמשים אפקטורים מיקרוביאליים אלו כדי להשפיע על הפיזיולוגיה התקינה של תאי המאכסן? וכיצד הדבר תורם להישרדותו ולהפצתו של הפתוגן.