יישום מערכת ביטוי עין מתנהלת לחקר הפרעות של גורמים בקטריאלי ארסיות עם איתות תאיים

השיטה המתוארת כאן משמשת לגרימת מפל האיתות האפופטוטי בשלבים מוגדרים על מנת לנתח את הפעילות של חלבון אפקטור חיידקי אנטי-אפופטוטי. שיטה זו יכולה לשמש גם לביטוי השראה של חלבונים פרו-אפופטוטיים או רעילים, או לניתוח הפרעות עם מסלולי איתות אחרים.

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לחקור הפרעות של גורמי אלימות חיידקים עם איתות תוך-תאי. זה מושג על ידי הקמת קווי תאים יציבים, המבטאים את החלבון המעניין כדי לחקור את פעילותו ברמת התא בתפזורת כשלב שני, נוצרת מערכת וקטור ביטוי הניתנת להשראה, המאפשרת הפעלת מפל איתות של תא מארח בשלב מוגדר. לאחר מכן, ינותח האם החלבון המעניין יכול להפריע להפעלת מפל האיתות של התא המארח על מנת לצמצם את נקודת הפעילות של החלבון המעניין, התוצאות מראות כי גורם האלימות הצהוב הנעים של ברנט KA B מפריע למפל האפופטוטי במורד הזרם של הגב ובמעלה הזרם של הפעלת מפל שלוש בהתבסס על ניתוח כתמים מערביים.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה הזיהומית, כגון זיהוי שלב המפתח במפל העברת אותות שבו חלבון אפקטור חיידקי נתון מפריע. זה לא רק יעזור לנו להבין טוב יותר כיצד מיקרואורגניזמים פתוגניים מתמרנים את המארחים שלהם, אלא גם כיצד תהליכים תאיים בסיסיים אלה מתפקדים. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי אסטרטגיות חיידקים למניעת התרחשות מוות של תאים אפופטוטיים, ניתן ליישם אותה גם על מערכות העברת אותות אחרות בתחום המוות התאי, כגון ONS או pyro ptosis, או גם על רשתות איתות המעורבות בשגשוג תאים, ויסות גנים או תגובות של מערכת החיסון.

תדגים את ההליך הזה סטפני בסלר, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה של מאן. התחל הליך זה על ידי זריעת תאי HEK 2 93 המבטאים ביציבות GFP או GFP, נניח B ב-12. צלחת באר בצפיפות של 100, 000 תאים לבאר.

לאחר מכן, הכינו מגיב טרנספקציה ממוצע DNA ופוליאתילן בנפרד ב -75 מיקרוליטר של מדיום אופציונלי, ודגרו במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר להיווצרות מורכבת. דוגרים את שתי התערובות יחד למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסיפו את תמיסת ה-DNA של פוליאתילן בטיפה לתאים ודגרו ב-37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו חמצני.

חמש שעות לאחר הטרנספקציה גורמים לביטוי של החלבונים הפרו-אפופטוטיים על ידי הוספת מיקרוגרם אחד למיליליטר של דוקסיציקלין למדיום התרבית. לאחר מכן דגרו על התאים למשך 18 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו חמצני תחת מיקרוסקופ האור. בדוק את התאים לאיתור השראת מוות תאים לפני הקציר.

בדוק את התאים האפופטוטיים המושרים, הניתנים לזיהוי על ידי נוכחותם של גופים אפופטוטיים. לאחר מכן, הסר את הסופרנטנט ושטוף את התאים הדבוקים. ברגע ש-PBS חם יש להשעות את התאים ב-100 מיקרוליטר של שני מאגר דגימה x lamby.

לאחר מכן מחממים במשך חמש דקות בחום של 95 מעלות צלזיוס ולשימוש מאוחר יותר מאחסנים בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס לאחר מכן. לאחר מכן, טען שישה מיקרוליטרים של סולם חלבון מסחרי כסמן משקל מולקולרי. לאחר מכן טען כ-40,000 תאים לדגימה על ג'ל דף SDS של 12%.

הפעל את הג'לים במערכת אלקטרופורזה של ג'ל במתח קבוע של 180 וולט למשך 45 עד 60 דקות עם מאגר ריצה אחד x laly. לאחר מכן, BLO את החלבונים על ממברנות PVDF במתח קבוע של 16 וולט למשך 60 דקות. השתמש בתא העברה חצי יבש SD כתם טרנס, ואז חסום את הממברנות ב -10 מיליליטר MPT למשך שעה בטמפרטורת החדר.

יש לדלל שבעה מיקרוליטרים של נוגדן PARP נגד שסע בשבעה מיליליטר של MPT. דגרו את קרום ה-PVDF עם תמיסת הנוגדנים למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. הסר את תמיסת הנוגדנים ובצע שלוש שטיפות של 10 דקות עם PBS 0.05%Tween 20, דגר על הממברנות עם 1.4 מיקרוליטר של נוגדנים משניים מצומדים פרוקסידאז צנון סוסים מדולל בשבעה מיליליטר MPT למשך שעה בטמפרטורת החדר לאחר הדגירה.

שטפו את הממברנות שלוש פעמים עם PBS 0.05% Tween 20, זהו פעילות חזרת פרוקסידאז עם ערכה מסחרית על פי פרוטוקול היצרן. וליישם ציוד סטנדרטי לפיתוח סרטים כדי להמחיש את רצועות החלבון. לאחר מכן הסר נוגדנים קשורים על ידי דגירה של הממברנות עם שבעה מיליליטר של מאגר הפשטת כתם מערבי למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר לאחר שלוש שטיפות עם PBS 0.05%Tween 20, בדוק את הממברנות עם ארבעה מיקרוליטרים של נוגדן נגד אקטין בארבעה מיליליטר MPT למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס.

למחרת, בצע שלושה שלבי כביסה של 10 דקות על הממברנות עם כ-10 מיליליטר PBS 0.05%Tween 20, ולאחר מכן דגר את הממברנות עם 1.4 מיקרוליטר של נוגדנים משניים מצומדים פרוקסידאז צנון סוסים מדולל בשבעה מיליליטר MPT לאחר שעה של דגירה בטמפרטורת החדר. שטפו את הממברנות שלוש פעמים עם PBS 0.05% Tween 20, זהו פעילות פרוקסידאז של צנון סוסים עם ערכה מסחרית ויישמו ציוד סטנדרטי לפיתוח סרטים כדי להמחיש איסורי חלבון. בניסוי זה, ליזטים של תאים שלמים של תאי HEK 2 93 GFP ו-HEK 2 93 GFP היו בדם חיסוני כדי להראות ביטוי יציב.

ניתוח ציטומטריית הזרימה המייצגת של תאי SABE HEK 2 93 GFP ו- HEK 2 93 GFP מראה את עוצמת ביטוי ה- GFP. תאי סבה HEK 2 93 GFP ו- HEK 2 93 GFP טופלו בארבעה ספורין מיקרומולרי במשך שש שעות כדי לגרום לאפופטוזיס פנימי. אפופטוזיס נותח על ידי ניתוח כתמים חיסוניים של PARP שסוע שבו נמצא כי מחשוף PARP יורד בתאי HK 2 9 3 GFP SA B בהשוואה לתאי HK 2 93 GFP.

CB מגן מפני אפופטוזיס המושרה על ידי באקס, אך לא מפני אפופטוזיס המושרה על ידי קספאז שלוש. בעת יישום הליך זה, חשוב לחקור כמה שיותר רכיבים של מסלול האיתות כדי לסייע בזיהוי שלב האינטראקציה. כמו כן, טוב לבדוק חלבונים המופעלים הן במצב הקרקע והן במצב המופעל שלהם כדי לקבוע אם חלבון האפקטור הנבחר מפריע למסלול עצמו, או ליתר דיוק לשלב ההפעלה לאחר הליך זה.

ניתן לבצע שיטות אחרות כמו נוקדאון, שמרים נוקאאוט שני היברידיים מושכים למטה שינוי לאחר תרגום או מבחני יציבות פרוטאוליטיים כדי לענות על שאלות נוספות כגון, מהם המנגנונים המולקולריים המדויקים שהאפקטורים המיקרוביאליים הללו משתמשים בהם כדי לתמרן את הפיזיולוגיה הרגילה של תא המארח? וכיצד זה מועיל להישרדות ולהפצה של פתוגנים.